第四章免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)課件

第四章免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)第四章免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)1免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunofluorescencecytochemistry)

采用熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原作為探針，檢測待測細(xì)胞或組織內(nèi)的靶抗原或抗體，形成帶有熒光素的抗原抗體復(fù)合物。利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，根據(jù)組織細(xì)胞中熒光物質(zhì)的存在，確定抗原或抗體的性質(zhì)并定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)熒光抗體法：用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。較常用熒光抗原法：用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。熒光抗體法+熒光抗原法=免疫熒光細(xì)胞（組織）技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)包括熒光抗體法和熒光抗原法熒光抗體法：免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)包括熒光抗體法和熒光抗原法免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法：

直接法、間接法、補體法免疫熒光染色標(biāo)本制備：

涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物、組織切片……

經(jīng)適當(dāng)固定后染色，或不固定直接染色。

存檔蠟塊：不能再用以免疫熒光染色

存檔的HE染色標(biāo)本：褪去蓋片和顏色，再作免疫熒光或其它免疫細(xì)胞化學(xué)的染色。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法：主要內(nèi)容

一、熒光的特征

二、熒光素

三、熒光素標(biāo)記抗體的方法

四、熒光抗體的質(zhì)量鑒定

五、免疫熒光組化染色方法

六、熒光顯微鏡

七、非特異性熒光的消除方法

八、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的對照染色九、激光掃描共聚焦顯微鏡主要內(nèi)容

一、熒光的特征

二、熒光素

三、熒光素標(biāo)記抗一、熒光的特征

分子都含有電子，電子在不停地運動著。根據(jù)量子理論，運動著的電子可以處于一系列不連續(xù)的能量狀態(tài)中，電子遵守一定的規(guī)則，要以從一個能級向另一能級躍遷，并伴隨著與能級差相對應(yīng)的特定能量的吸收或釋放。激發(fā):

當(dāng)電子吸收能量躍遷到較高能級，這個過程叫激發(fā)。

發(fā)射:

以輻射方式躍遷時，能量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)波長的光，這個過程叫發(fā)射。一、熒光的特征

分子都含有電子，電子在不停地?zé)晒?/p>

(fluorescence)

躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重激發(fā)態(tài)。如果電子直接從單重激發(fā)態(tài)以輻射方式躍遷到基態(tài)，由于單重激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，半衰期很短，發(fā)射持續(xù)的時間也很短，這種發(fā)射光，叫熒光。即指一個分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時停止(一般持續(xù)lO-7～lO-8s)。熒光(fluorescence)即指一個分子或原子吸收了給二熒光素

能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光素；必須具備：吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光。

1具備用于標(biāo)記抗體的熒光素條件

(1)應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基團，結(jié)合后不易離解，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易排除。(2)熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光素質(zhì)量下降不多。

(3)標(biāo)記后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響。

(4)結(jié)合方法簡便而快速，并且較穩(wěn)定。(5)熒光素容易溶解，溶解后不會和其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(6)熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。二熒光素

能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物(1)異硫氰酸熒光素(FITC)

呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。呈現(xiàn)黃綠色熒光。在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵,成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個IgG分子最多能標(biāo)記15-20個FITC分子2熒光素的種類：最大吸收光譜：490～495nm，最大發(fā)射光譜：520～530nm。分子量：389.4KD(1)異硫氰酸熒光素(FITC)2熒光素的種類：最大吸收光(2)四乙基羅達(dá)明(RB200)

褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。呈明亮橙紅色熒光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯，在堿性條件下易與蛋白質(zhì)的賴氨酸一氨基反應(yīng)結(jié)合而標(biāo)記在蛋白分子上。最大吸收光譜:570nm最大發(fā)射光譜:596～600nm分子量：580KD(2)四乙基羅達(dá)明(RB200)最大吸收光譜:570nm(3)四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(TMRITC)

紫紅色粉末，羅達(dá)明的衍生物，易溶于水，性質(zhì)較穩(wěn)定。呈橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對比清晰，與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同F(xiàn)ITC。它可用于雙標(biāo)記示蹤研究。

最大吸收光譜:550nm

最大發(fā)射光譜:620nm

(4)4-乙酰胺-4-異硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）---藍(lán)色熒光(5)得克薩斯紅（Texasred）(6)藻紅素R(7)花青（Cyanine,Cy2綠色,Cy3紅色,Cy5）…(3)四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(TMRITC)三、熒光素標(biāo)記抗體的方法

(一)FITC標(biāo)記抗體的方法

1Marsshall法

(1)原理：當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體反應(yīng)時，主要是抗體分子上的賴氨酸-氨基與FITC上硫碳胺鍵結(jié)合，一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基，一般最多能結(jié)合15～20個。熒光素FITC-N＝C＋N-蛋白質(zhì)→FITC-N–C–N-蛋白質(zhì)

‖‖SHHHSH

(2)操作流程

抗體與熒光素比例為50-100:1

抗體的準(zhǔn)備：20mg/ml(抗體+生理鹽水+碳酸鹽緩沖液）碳酸鹽緩沖液為總量的1/10。

熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白總量，每毫克加入0.01mgFITC

三、熒光素標(biāo)記抗體的方法

(一)FITC標(biāo)記抗體的方法

1

結(jié)合（標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或攪拌棒上，繼續(xù)攪拌12-18h，4℃

透析：離心去沉淀，裝入透析袋pH8.0緩沖鹽水透析過夜，0-4℃

過柱：葡萄糖凝膠G50或G25柱分離游離熒光素保存4℃-40℃等量甘油分裝保存。

2Chadwick法3改良法4透析標(biāo)記法

結(jié)合（標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體溶液中四、熒光抗體的質(zhì)量控制

主要進(jìn)行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。1特異性染色效價測定--與相應(yīng)抗原標(biāo)本染色直接染色：倍比稀釋熒光抗體1:2，1:4,1:8…,“+++”的最大稀釋度為染色滴度，實際染色可取低1-2稀釋度，如染色滴度1:64，實際為1:32或1:16；間接染色：“++”的最大稀釋度為染色滴度。2非特異性染色測定--與相類似抗原標(biāo)本染色3吸收試驗---在熒光抗體中加入過量抗原，吸收后再用相應(yīng)抗原陽性標(biāo)本染色，結(jié)果無明顯陽性熒光。4F/P比值的測定方法F（熒光素）和P（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，

F/P=1-2，過高------非特異染色增強；過低------熒光很弱，降低敏感性。四、熒光抗體的質(zhì)量控制

主要進(jìn)行特異性和敏感性兩個方面的鑒定熒光抗體的保存0-4℃或-20℃低溫保存，防止抗體活性降低和蛋白變性；加入防腐劑：硫柳汞或疊氮鈉；小量分裝；真空干燥后更易長期保存。熒光抗體的保存0-4℃或-20℃低溫保存，防止抗體活性降低和

1直接法

（1）基本原理用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。特點：適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較低五、熒光抗體染色方法適用標(biāo)本：涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物或組織切片，經(jīng)適當(dāng)固定或不固定；方法：直接法、間接法、補體法1直接法五、熒光抗體染色方法

（2）器材

熒光顯微鏡，恒冷箱切片機，剪刀，鑷子，載玻片。（3）材料和試劑

FITC—sIg；0.01MPBS(Ph7.2)；100%丙酮；甘油緩沖液。（4）操作步驟

1）恒冷箱切片，厚5μm，風(fēng)吹干燥30min。

2）100％冷丙酮固定lOmin。

3）0.01MPBS漂洗3次，5min/次。

4）滴加1：50—100的FITC—sIg，室溫或37℃濕盒內(nèi)染色30min。

5）0.01MPBS漂洗3次，5min/次。

6）封片，鏡檢。

7）陰性對照：采用正常血清染色，結(jié)果為陰性。（5）結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光部分為陽性細(xì)胞。（2）器材

2間接法（1）基本原理先用未標(biāo)記特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。優(yōu)點：只需制備一種熒光抗體可檢出多種抗原，敏感性較高，能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（麻疹）等的研究和檢查，廣泛應(yīng)用于自身抗體和感染病人血清的檢驗。缺點：非特異性著色機會較多，染色時間長。2間接法（2）操作步驟：

1）切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)；

2）滴加未標(biāo)記的特異性抗原作用切片于37℃，30min；

3）PBS漂洗3次，5min/次；

4）滴加FITC—sIg再作用切片于37℃，30min；

5）PBS漂洗3次，5min/次。

6）緩沖甘油封固，鏡檢。

7）封片，陰性對照：用正常血清代替一抗，其余步驟同上。結(jié)果

黃綠色熒光處即陽性細(xì)胞分布部位。（2）操作步驟：結(jié)果3補體法用特異性抗體和補體混合液與標(biāo)本上的抗原反應(yīng)，補體就結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上，再用熒光標(biāo)記的抗補體的抗體與補體結(jié)合，從而形成抗原—抗體—補體—抗補體熒光復(fù)合物。熒光顯微鏡下所見陽性熒光即為抗原所在部位。特點：很敏感，且不受特異性抗體種屬的限制，適用于各種動物抗體的檢查方法。方法：1）涂片或冰凍切片固定，PBS水洗；

2）滴加免疫血清和補體等量混合液，37℃，30min；

3）PBS洗滌；

4）滴加抗補體熒光抗體37℃，30min；

5）水洗，緩沖甘油封固。適用：腎穿刺組織活檢診斷等；形態(tài)小的立克體、病毒顆?；虻蜐舛瓤乖?。3補體法4雙重免疫熒光染色法適用：在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需要同時顯示兩種抗原。方法：如A抗原的抗體---FITC標(biāo)記，

B抗原的抗體---RB200標(biāo)記。

(1)一步雙染法

將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合（A+B)；直接法進(jìn)行染色反應(yīng)。(2)二步雙染法

先用RB200標(biāo)記的B抗體,不必洗去；再用FITC標(biāo)記的A抗體染色；按間接法進(jìn)行。

結(jié)果：

A抗原呈黃綠色熒光；B抗原呈桔紅色熒光。4雙重免疫熒光染色法(1)一步雙染法5膜抗原熒光抗體染色方法原理和步驟：直接法或間接法；適用：可對活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色，常用于T和B細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原、受體等。結(jié)果：陽性熒光主要在細(xì)胞膜上。

6熒光抗體再染色法熒光抗原染色法抗原用熒光素標(biāo)記，少用。5膜抗原熒光抗體染色方法原理和步驟：直接法或間接法；六、熒光顯微鏡檢查方法

1熒光顯微鏡超高壓光源、濾板系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。（1）光源

光源的亮度應(yīng)根據(jù)熒光素的類型選擇。小功率汞燈可滿足激勵一般熒光染料的要求。對于免疫熒光染色需用大功率超高壓汞燈。其工作時，兩個電極間放電，引起球內(nèi)水銀蒸發(fā)，經(jīng)過5～15min，球內(nèi)氣壓升至50～70標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，此時達(dá)到最高亮度，成為穩(wěn)定工作狀態(tài)。（2）濾板系統(tǒng)：包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，分光鏡和其他中性濾片。是熒光顯微鏡的重要組成部分，是獲得特定波長光，清晰的熒光影像和發(fā)揮顯微鏡最佳性能之關(guān)鍵。了解濾片性能，正確地選擇濾片是觀察熒光效應(yīng)的前提和必要條件。六、熒光顯微鏡檢查方法

1熒光顯微鏡（1）光源熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng)激勵法分光鏡激發(fā)濾光片截止濾光片

用途UDM400BP330-385BP360-370BA420自動熒光觀察法，DAPI(聯(lián)脒基吲哚)：DNAHoechest33358,33342染色體VDM455BP400-410BA455兒茶酚胺觀察BVDM455BP400-440BA475芥子喹吖因；染色體BP420-440硫磺素S：淋巴細(xì)胞吖淀黃素：核酸BDM500BP450-480BA515異硫氰酸熒光素：熒光抗體觀察BP470-490吖啶橙：DNA，RNABP420-480金胺結(jié)核桿菌IBDM505PB460-490BA515IFBP470-490GDM570BP510-550BA590羅丹明BP530-550四甲基羅丹明異硫氰酸鹽：熒光抗體觀察BP480-550碘化丙啶：DNAIGDM565BP520-550BA580IFDM600BP545-580BA610IF德克薩斯紅：熒光抗體觀察熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng)激勵法分光鏡激發(fā)濾光片截止濾光片2標(biāo)本制作要求

(1)載玻片厚度應(yīng)在0.6～1.2mm之間（有時需石英玻璃載玻片)

(2)蓋玻片應(yīng)光潔，厚度在0.17mm左右（有時需干涉蓋玻片)

(3)標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發(fā)光；細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋易非特異著色。

(4)封片劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/LpH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液等量混合作封片劑（室溫過夜，待氣泡消失可使用)。熒光信號增強封片劑

mowiol40-884.8g

甘油12ml

蒸餾水12ml

0.2mol/LTris(pH8.5)24ml混合加熱溶解，5000g離心，15min，最后加入DABcos，終濃度2.5，溶解后，分裝存于-20℃中。

(5)鏡油:無熒光；可用甘油、液體石蠟替代。2標(biāo)本制作要求

(1)載玻片厚度應(yīng)在0.6～1.2mm之3使用熒光顯微鏡注意事項

(1)嚴(yán)格按說明書操作，不要隨意改變程序；

(2)應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。汞燈點燃5-15min，光源穩(wěn)定后觀察；

(3)防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡；

(4)檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈強度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本在紫外線照射3-5min后，熒光減弱；最多不超2-3h;(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。光源關(guān)閉后必須在30min后才能再啟動光源，一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源；(6)標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察。

(7)熒光高度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，分四級“－”為陰性，“＋”為僅能見明確可見的熒光；“＋＋”為可見有明亮的熒光；“＋＋＋”為可見耀眼的熒光。3使用熒光顯微鏡注意事項

(1)嚴(yán)格按說明書操作，不要隨第四章免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)課件4熒光圖像的記錄方法熒光圖像：具有形態(tài)學(xué)特征、熒光的顏色和亮度熒光顯微鏡攝影：基本同普通顯微鏡攝影技術(shù)高速感光膠片如ASA200以上或24℃以上半自動或全自動顯微攝影系統(tǒng)裝置，或CCD與計算機聯(lián)接，將圖像存在軟盤上缺點：紫外光對熒光猝滅作用大（如FITC標(biāo)記物，紫外光照射30s，熒光亮度降低50%），曝光速度要求高。

4熒光圖像的記錄方法熒光圖像：具有形態(tài)學(xué)特征、熒光的顏色和

七、非特異性染色的產(chǎn)生及消除方法

產(chǎn)生的原因：（1）部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。（3）組織中還可能存在類屬抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合。（4）制備的免疫血清中混雜抗其他組織成分的抗體。（5）抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。（6）熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)取?/p>

七、非特異性染色的產(chǎn)生及消除方法

產(chǎn)生的原因：非特異性染色的消除方法1動物臟器粉末吸收法：常用：肝粉（豬、鼠）、骨髓粉、鼠腦粉、雞胚粉……

原理：對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸收作用，消除非特異著色方法：每毫升熒光抗體中加入肝粉50-100mg——混勻——4℃過夜——離心——取上清——臨用前加入熒光抗體進(jìn)行吸收2透析法

原理：熒光素如FITC分子可通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未結(jié)合的熒光素透析除去。方法：將標(biāo)記完畢的熒光蛋白液裝入透析袋浸入pH7.2-7.4的PBS中，4℃，每日更換3-4次PBS，約5-7天，透析液無熒光即可（熒光光源照射）

非特異性染色的消除方法3葡聚糖G-50柱層析法

目的：除去游離熒光素方法：加入熒光抗體15-18ml---即將入柱時加PBS---關(guān)閉下口30-40min---游離熒光素進(jìn)入分子篩孔氏加入洗脫液---熒光抗體向下移行并與游離熒光素拉開距離---熒光抗體流出----前、中、后三部分收集，測F/P比值，合并、濃縮、分裝-----繼續(xù)加入洗脫液，直至洗脫液中無蛋白和熒光素止。3葡聚糖G-50柱層析法

目的：除去游離熒光素4DEAE纖維素柱層析法去除標(biāo)記過多或過少熒光素的抗體分子5熒光抗體稀釋法6純化抗原方法7純化抗體方法8伊文氏藍(lán)襯染方法：

0.01%伊文氏藍(lán)+0.01mol/LPH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細(xì)胞和組織染色呈紅色熒光，與特異性熒光成對比，減少非特異性熒光，宜作常規(guī)應(yīng)用。9胰酶消化或10%牛血清蛋白封閉4DEAE纖維素柱層析法八、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的對照染色

為了排除某些非特異性染色，保證免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色的準(zhǔn)確性，必須在初次試驗時進(jìn)行以上對照試驗，從而檢測抗原與抗體的結(jié)合是否是特異的。常用對照如下：陽性對照陰性對照自發(fā)熒光對照八、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的對照染色1陽性對照用已知存在某相應(yīng)抗原組織標(biāo)本染色，結(jié)果為陽性2陰性對照(1)吸收實驗

用已知的相應(yīng)抗原與標(biāo)記的抗體反應(yīng)，然后離心除去反應(yīng)物，再用吸收過熒光抗體的液體與標(biāo)本內(nèi)抗原反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)為陰性。

(2)抑制實驗

用未標(biāo)記熒光素的抗體與標(biāo)本內(nèi)相應(yīng)靶抗原反應(yīng)，然后再加入用熒光素標(biāo)記的相同抗體進(jìn)行染色反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)為陰性。①二步抑制法：標(biāo)本先加未標(biāo)記的特異性抗體，再加標(biāo)記熒光抗體。②一步抑制法：

先將熒光抗體用未標(biāo)記抗體作適量混合，再加在標(biāo)本上染色。效果較二步法好，并且簡便。

1陽性對照(2)抑制實驗①二步抑制法：(3)抗原對照

用確知不存在某相應(yīng)抗原的標(biāo)本染色。

(4)抗體對照

用與特異性抗體種屬相同的動物正常血清或同一動物免疫前血清標(biāo)記熒光素代替免疫血清。3自發(fā)熒光對照

標(biāo)本只加PBS或不加PBS。(3)抗原對照結(jié)束結(jié)束九、激光掃描共聚焦顯微鏡LSCM

是80年代發(fā)展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品。實現(xiàn)了對細(xì)胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層掃描成像，從而對被檢物體樣品從停留到表面單層，靜態(tài)平面的觀察進(jìn)行到立體，斷層掃描、動態(tài)全面的觀察，在生命科學(xué)研究中得到迅速應(yīng)用。1儀器構(gòu)成

(1)計算機系統(tǒng)：控制著機械，光學(xué)、聲學(xué)系統(tǒng)及各種外圍設(shè)備。

(2)激光照射系統(tǒng)：氬離子激光器和聲光調(diào)節(jié)器。

(3)

顯微鏡系統(tǒng)，它主要由倒置顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)組成。

(4)檢測系統(tǒng)，由檢測器，檢測放大器等元件組成。

(5)X－Y平臺

(6)Z-軸步進(jìn)馬達(dá)九、激光掃描共聚焦顯微鏡LSCM實現(xiàn)了對細(xì)胞內(nèi)部非第四章免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)課件2共聚焦成像原理激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過光的擴束和整形，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色光鏡使光束偏轉(zhuǎn)90度，經(jīng)過物鏡會聚在物鏡的焦點上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)出沿各個方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過物鏡，長通分色反射鏡，聚焦透鏡，會聚在聚焦透鏡的焦點外，經(jīng)過焦點處的針孔，由檢測器接收并轉(zhuǎn)變成電信號。

3光信號接收和成像方式

(1)光信號接收生物樣品發(fā)出的熒光通常有二種接收方式：①由光電倍增管（PMT）把光信號轉(zhuǎn)變成電信號；②利用電荷耦合器（CCD）把光信號轉(zhuǎn)變成電信號。

(2)成像方式①載物臺運動成像：以直徑很小的激光束照射樣品，照射點發(fā)出的熒光信號經(jīng)PMT變成電信號，然后載物臺移動到下一點，記錄該點的熒光強度。該方法無軸向像差，成像時間長；②反射掃描成像方式，通過轉(zhuǎn)動反射鏡使激光連續(xù)照射樣品，由CCD攝像機記錄下照射點所發(fā)射的熒光，成像速度快。2共聚焦成像原理3光信號接收和成像方式

(1)光第四章免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)課件4參數(shù)的選擇

基本參數(shù)：Confocal,pinhole,detector,

PMT,Stepsize,Xpoints,YPoints,scanstr,speed,LaserPwr,Autozoom,Display,BRsubval,Samples/pt等5性能特點：分辨率高，靈敏度高，掃描速度快，掃描范圍大，圖像存取方便，可進(jìn)行光切片的觀察，可進(jìn)行定量熒光分析。4參數(shù)的選擇

基本參數(shù)：Confocal,pinhole,第四章免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)第四章免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)44免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunofluorescencecytochemistry)

采用熒光素標(biāo)記的已知抗體或抗原作為探針，檢測待測細(xì)胞或組織內(nèi)的靶抗原或抗體，形成帶有熒光素的抗原抗體復(fù)合物。利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，根據(jù)組織細(xì)胞中熒光物質(zhì)的存在，確定抗原或抗體的性質(zhì)并定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)熒光抗體法：用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。較常用熒光抗原法：用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。熒光抗體法+熒光抗原法=免疫熒光細(xì)胞（組織）技術(shù)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)包括熒光抗體法和熒光抗原法熒光抗體法：免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)包括熒光抗體法和熒光抗原法免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法：

直接法、間接法、補體法免疫熒光染色標(biāo)本制備：

涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物、組織切片……

經(jīng)適當(dāng)固定后染色，或不固定直接染色。

存檔蠟塊：不能再用以免疫熒光染色

存檔的HE染色標(biāo)本：褪去蓋片和顏色，再作免疫熒光或其它免疫細(xì)胞化學(xué)的染色。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法：主要內(nèi)容

一、熒光的特征

二、熒光素

三、熒光素標(biāo)記抗體的方法

四、熒光抗體的質(zhì)量鑒定

五、免疫熒光組化染色方法

六、熒光顯微鏡

七、非特異性熒光的消除方法

八、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的對照染色九、激光掃描共聚焦顯微鏡主要內(nèi)容

一、熒光的特征

二、熒光素

三、熒光素標(biāo)記抗一、熒光的特征

分子都含有電子，電子在不停地運動著。根據(jù)量子理論，運動著的電子可以處于一系列不連續(xù)的能量狀態(tài)中，電子遵守一定的規(guī)則，要以從一個能級向另一能級躍遷，并伴隨著與能級差相對應(yīng)的特定能量的吸收或釋放。激發(fā):

當(dāng)電子吸收能量躍遷到較高能級，這個過程叫激發(fā)。

發(fā)射:

以輻射方式躍遷時，能量轉(zhuǎn)化成相應(yīng)波長的光，這個過程叫發(fā)射。一、熒光的特征

分子都含有電子，電子在不停地?zé)晒?/p>

(fluorescence)

躍遷到激發(fā)態(tài)的電子，大多處于單重激發(fā)態(tài)。如果電子直接從單重激發(fā)態(tài)以輻射方式躍遷到基態(tài)，由于單重激發(fā)態(tài)很不穩(wěn)定，半衰期很短，發(fā)射持續(xù)的時間也很短，這種發(fā)射光，叫熒光。即指一個分子或原子吸收了給予的能量后即刻引起發(fā)光，停止能量供給，發(fā)光也瞬時停止(一般持續(xù)lO-7～lO-8s)。熒光(fluorescence)即指一個分子或原子吸收了給二熒光素

能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物稱為熒光素；必須具備：吸收激發(fā)光的光能并發(fā)射熒光。

1具備用于標(biāo)記抗體的熒光素條件

(1)應(yīng)具有與蛋白質(zhì)分子形成共價鍵的化學(xué)基團，結(jié)合后不易離解，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易排除。(2)熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后熒光素質(zhì)量下降不多。

(3)標(biāo)記后對抗體的免疫學(xué)性質(zhì)和生化性質(zhì)無影響。

(4)結(jié)合方法簡便而快速，并且較穩(wěn)定。(5)熒光素容易溶解，溶解后不會和其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。(6)熒光顏色與背景組織的自發(fā)熒光顏色對比鮮明，能清晰判斷結(jié)果。二熒光素

能夠產(chǎn)生熒光并能作為染料的化合物(1)異硫氰酸熒光素(FITC)

呈黃色、橙黃或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫下能保存2年以上，在低溫中可保存多年。易溶于水和酒精。呈現(xiàn)黃綠色熒光。在堿性條件下，F(xiàn)ITC的異硫氰酸基在水溶液中與免疫球蛋白的自由氨基經(jīng)碳酰胺化而形成硫碳氨基鍵,成為標(biāo)記熒光免疫球蛋白，即熒光抗體。一個IgG分子最多能標(biāo)記15-20個FITC分子2熒光素的種類：最大吸收光譜：490～495nm，最大發(fā)射光譜：520～530nm。分子量：389.4KD(1)異硫氰酸熒光素(FITC)2熒光素的種類：最大吸收光(2)四乙基羅達(dá)明(RB200)

褐紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。呈明亮橙紅色熒光。RB200在五氯化磷(PCl5)作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯，在堿性條件下易與蛋白質(zhì)的賴氨酸一氨基反應(yīng)結(jié)合而標(biāo)記在蛋白分子上。最大吸收光譜:570nm最大發(fā)射光譜:596～600nm分子量：580KD(2)四乙基羅達(dá)明(RB200)最大吸收光譜:570nm(3)四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(TMRITC)

紫紅色粉末，羅達(dá)明的衍生物，易溶于水，性質(zhì)較穩(wěn)定。呈橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對比清晰，與蛋白質(zhì)結(jié)合方式同F(xiàn)ITC。它可用于雙標(biāo)記示蹤研究。

最大吸收光譜:550nm

最大發(fā)射光譜:620nm

(4)4-乙酰胺-4-異硫氰酸-2-硫酸芪（SITS）---藍(lán)色熒光(5)得克薩斯紅（Texasred）(6)藻紅素R(7)花青（Cyanine,Cy2綠色,Cy3紅色,Cy5）…(3)四甲基異硫氰酸羅達(dá)明(TMRITC)三、熒光素標(biāo)記抗體的方法

(一)FITC標(biāo)記抗體的方法

1Marsshall法

(1)原理：當(dāng)FITC在堿性溶液中與抗體反應(yīng)時，主要是抗體分子上的賴氨酸-氨基與FITC上硫碳胺鍵結(jié)合，一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基，一般最多能結(jié)合15～20個。熒光素FITC-N＝C＋N-蛋白質(zhì)→FITC-N–C–N-蛋白質(zhì)

‖‖SHHHSH

(2)操作流程

抗體與熒光素比例為50-100:1

抗體的準(zhǔn)備：20mg/ml(抗體+生理鹽水+碳酸鹽緩沖液）碳酸鹽緩沖液為總量的1/10。

熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白總量，每毫克加入0.01mgFITC

三、熒光素標(biāo)記抗體的方法

(一)FITC標(biāo)記抗體的方法

1

結(jié)合（標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體溶液中（5-10min)。避免粘于瓶壁或攪拌棒上，繼續(xù)攪拌12-18h，4℃

透析：離心去沉淀，裝入透析袋pH8.0緩沖鹽水透析過夜，0-4℃

過柱：葡萄糖凝膠G50或G25柱分離游離熒光素保存4℃-40℃等量甘油分裝保存。

2Chadwick法3改良法4透析標(biāo)記法

結(jié)合（標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光素加入抗體溶液中四、熒光抗體的質(zhì)量控制

主要進(jìn)行特異性和敏感性兩個方面的鑒定。1特異性染色效價測定--與相應(yīng)抗原標(biāo)本染色直接染色：倍比稀釋熒光抗體1:2，1:4,1:8…,“+++”的最大稀釋度為染色滴度，實際染色可取低1-2稀釋度，如染色滴度1:64，實際為1:32或1:16；間接染色：“++”的最大稀釋度為染色滴度。2非特異性染色測定--與相類似抗原標(biāo)本染色3吸收試驗---在熒光抗體中加入過量抗原，吸收后再用相應(yīng)抗原陽性標(biāo)本染色，結(jié)果無明顯陽性熒光。4F/P比值的測定方法F（熒光素）和P（抗體蛋白）的克分子比值反映熒光抗體的特異性染色質(zhì)量，

F/P=1-2，過高------非特異染色增強；過低------熒光很弱，降低敏感性。四、熒光抗體的質(zhì)量控制

主要進(jìn)行特異性和敏感性兩個方面的鑒定熒光抗體的保存0-4℃或-20℃低溫保存，防止抗體活性降低和蛋白變性；加入防腐劑：硫柳汞或疊氮鈉；小量分裝；真空干燥后更易長期保存。熒光抗體的保存0-4℃或-20℃低溫保存，防止抗體活性降低和

1直接法

（1）基本原理用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成熒光特異性抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可見抗原存在部位呈現(xiàn)特異性熒光。特點：適合做細(xì)菌、螺旋體、原蟲、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較低五、熒光抗體染色方法適用標(biāo)本：涂片、印片、細(xì)胞單層培養(yǎng)物或組織切片，經(jīng)適當(dāng)固定或不固定；方法：直接法、間接法、補體法1直接法五、熒光抗體染色方法

（2）器材

熒光顯微鏡，恒冷箱切片機，剪刀，鑷子，載玻片。（3）材料和試劑

FITC—sIg；0.01MPBS(Ph7.2)；100%丙酮；甘油緩沖液。（4）操作步驟

1）恒冷箱切片，厚5μm，風(fēng)吹干燥30min。

2）100％冷丙酮固定lOmin。

3）0.01MPBS漂洗3次，5min/次。

4）滴加1：50—100的FITC—sIg，室溫或37℃濕盒內(nèi)染色30min。

5）0.01MPBS漂洗3次，5min/次。

6）封片，鏡檢。

7）陰性對照：采用正常血清染色，結(jié)果為陰性。（5）結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光部分為陽性細(xì)胞。（2）器材

2間接法（1）基本原理先用未標(biāo)記特異性抗原與細(xì)胞或組織內(nèi)抗體反應(yīng)，再用此抗原的特異性熒光抗體與結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)抗體上的抗原相結(jié)合，抗原夾在細(xì)胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。優(yōu)點：只需制備一種熒光抗體可檢出多種抗原，敏感性較高，能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（麻疹）等的研究和檢查，廣泛應(yīng)用于自身抗體和感染病人血清的檢驗。缺點：非特異性著色機會較多，染色時間長。2間接法（2）操作步驟：

1）切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)；

2）滴加未標(biāo)記的特異性抗原作用切片于37℃，30min；

3）PBS漂洗3次，5min/次；

4）滴加FITC—sIg再作用切片于37℃，30min；

5）PBS漂洗3次，5min/次。

6）緩沖甘油封固，鏡檢。

7）封片，陰性對照：用正常血清代替一抗，其余步驟同上。結(jié)果

黃綠色熒光處即陽性細(xì)胞分布部位。（2）操作步驟：結(jié)果3補體法用特異性抗體和補體混合液與標(biāo)本上的抗原反應(yīng)，補體就結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上，再用熒光標(biāo)記的抗補體的抗體與補體結(jié)合，從而形成抗原—抗體—補體—抗補體熒光復(fù)合物。熒光顯微鏡下所見陽性熒光即為抗原所在部位。特點：很敏感，且不受特異性抗體種屬的限制，適用于各種動物抗體的檢查方法。方法：1）涂片或冰凍切片固定，PBS水洗；

2）滴加免疫血清和補體等量混合液，37℃，30min；

3）PBS洗滌；

4）滴加抗補體熒光抗體37℃，30min；

5）水洗，緩沖甘油封固。適用：腎穿刺組織活檢診斷等；形態(tài)小的立克體、病毒顆?；虻蜐舛瓤乖?補體法4雙重免疫熒光染色法適用：在同一細(xì)胞組織標(biāo)本上需要同時顯示兩種抗原。方法：如A抗原的抗體---FITC標(biāo)記，

B抗原的抗體---RB200標(biāo)記。

(1)一步雙染法

將兩種標(biāo)記抗體按適當(dāng)比例混合（A+B)；直接法進(jìn)行染色反應(yīng)。(2)二步雙染法

先用RB200標(biāo)記的B抗體,不必洗去；再用FITC標(biāo)記的A抗體染色；按間接法進(jìn)行。

結(jié)果：

A抗原呈黃綠色熒光；B抗原呈桔紅色熒光。4雙重免疫熒光染色法(1)一步雙染法5膜抗原熒光抗體染色方法原理和步驟：直接法或間接法；適用：可對活細(xì)胞在試管內(nèi)進(jìn)行染色，常用于T和B細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、瘤細(xì)胞抗原、受體等。結(jié)果：陽性熒光主要在細(xì)胞膜上。

6熒光抗體再染色法熒光抗原染色法抗原用熒光素標(biāo)記，少用。5膜抗原熒光抗體染色方法原理和步驟：直接法或間接法；六、熒光顯微鏡檢查方法

1熒光顯微鏡超高壓光源、濾板系統(tǒng)(包括激發(fā)和壓制濾板)、光學(xué)系統(tǒng)和攝影系統(tǒng)等主要部件組成，是利用一定波長的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光。（1）光源

光源的亮度應(yīng)根據(jù)熒光素的類型選擇。小功率汞燈可滿足激勵一般熒光染料的要求。對于免疫熒光染色需用大功率超高壓汞燈。其工作時，兩個電極間放電，引起球內(nèi)水銀蒸發(fā)，經(jīng)過5～15min，球內(nèi)氣壓升至50～70標(biāo)準(zhǔn)大氣壓，此時達(dá)到最高亮度，成為穩(wěn)定工作狀態(tài)。（2）濾板系統(tǒng)：包括激發(fā)濾片，阻斷濾片、隔熱濾片，分光鏡和其他中性濾片。是熒光顯微鏡的重要組成部分，是獲得特定波長光，清晰的熒光影像和發(fā)揮顯微鏡最佳性能之關(guān)鍵。了解濾片性能，正確地選擇濾片是觀察熒光效應(yīng)的前提和必要條件。六、熒光顯微鏡檢查方法

1熒光顯微鏡（1）光源熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng)激勵法分光鏡激發(fā)濾光片截止濾光片

用途UDM400BP330-385BP360-370BA420自動熒光觀察法，DAPI(聯(lián)脒基吲哚)：DNAHoechest33358,33342染色體VDM455BP400-410BA455兒茶酚胺觀察BVDM455BP400-440BA475芥子喹吖因；染色體BP420-440硫磺素S：淋巴細(xì)胞吖淀黃素：核酸BDM500BP450-480BA515異硫氰酸熒光素：熒光抗體觀察BP470-490吖啶橙：DNA，RNABP420-480金胺結(jié)核桿菌IBDM505PB460-490BA515IFBP470-490GDM570BP510-550BA590羅丹明BP530-550四甲基羅丹明異硫氰酸鹽：熒光抗體觀察BP480-550碘化丙啶：DNAIGDM565BP520-550BA580IFDM600BP545-580BA610IF德克薩斯紅：熒光抗體觀察熒光顯微鏡的濾片系統(tǒng)激勵法分光鏡激發(fā)濾光片截止濾光片2標(biāo)本制作要求

(1)載玻片厚度應(yīng)在0.6～1.2mm之間（有時需石英玻璃載玻片)

(2)蓋玻片應(yīng)光潔，厚度在0.17mm左右（有時需干涉蓋玻片)

(3)標(biāo)本不能太厚，如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部，而物鏡直接觀察到的上部不能充分激發(fā)光；細(xì)胞重疊或雜質(zhì)掩蓋易非特異著色。

(4)封片劑常用甘油，必須無自發(fā)熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/LpH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液等量混合作封片劑（室溫過夜，待氣泡消失可使用)。熒光信號增強封片劑

mowiol40-884.8g

甘油12ml

蒸餾水12ml

0.2mol/LTris(pH8.5)24ml混合加熱溶解，5000g離心，15min，最后加入DABcos，終濃度2.5，溶解后，分裝存于-20℃中。

(5)鏡油:無熒光；可用甘油、液體石蠟替代。2標(biāo)本制作要求

(1)載玻片厚度應(yīng)在0.6～1.2mm之3使用熒光顯微鏡注意事項

(1)嚴(yán)格按說明書操作，不要隨意改變程序；

(2)應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。汞燈點燃5-15min，光源穩(wěn)定后觀察；

(3)防止紫外線對眼睛的損害。在調(diào)整光源時應(yīng)戴上防護眼鏡；

(4)檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈強度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本在紫外線照射3-5min后，熒光減弱；最多不超2-3h;(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時間，保護光源。光源關(guān)閉后必須在30min后才能再啟動光源，一天中應(yīng)避免數(shù)次點燃光源；(6)標(biāo)本染色后應(yīng)立即觀察。

(7)熒光高度的判斷標(biāo)準(zhǔn)，分四級“－”為陰性，“＋”為僅能見明確可見的熒光；“＋＋”為可見有明亮的熒光；“＋＋＋”為可見耀眼的熒光。3使用熒光顯微鏡注意事項

(1)嚴(yán)格按說明書操作，不要隨第四章免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)課件4熒光圖像的記錄方法熒光圖像：具有形態(tài)學(xué)特征、熒光的顏色和亮度熒光顯微鏡攝影：基本同普通顯微鏡攝影技術(shù)高速感光膠片如ASA200以上或24℃以上半自動或全自動顯微攝影系統(tǒng)裝置，或CCD與計算機聯(lián)接，將圖像存在軟盤上缺點：紫外光對熒光猝滅作用大（如FITC標(biāo)記物，紫外光照射30s，熒光亮度降低50%），曝光速度要求高。

4熒光圖像的記錄方法熒光圖像：具有形態(tài)學(xué)特征、熒光的顏色和

七、非特異性染色的產(chǎn)生及消除方法

產(chǎn)生的原因：（1）部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。（3）組織中還可能存在類屬抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合。（4）制備的免疫血清中混雜抗其他組織成分的抗體。（5）抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，過量標(biāo)記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染色。（6）熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)取?/p>

七、非特異性染色的產(chǎn)生及消除方法

產(chǎn)生的原因：非特異性染色的消除方法1動物臟器粉末吸收法：常用：肝粉（豬、鼠）、骨髓粉、鼠腦粉、雞胚粉……

原理：對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸收作用，消除非特異著色方法：每毫升熒光抗體中加入肝粉50-100mg——混勻——4℃過夜——離心——取上清——臨用前加入熒光抗體進(jìn)行吸收2透析法

原理：熒光素如FITC分子可通過半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過，可將未結(jié)合的熒光素透析除去。方法：將標(biāo)記完畢的熒光蛋白液裝入透析袋浸入pH7.2-7.4的PBS中，4℃，每日更換3-4次PBS，約5-7天，透析液無熒光即