EP6.0-2.6.12微生物限度檢查

EP6.0-2.6.12微生物限度檢查EP6.0-2.6.12微生物限度檢查EP6.0-2.6.12微生物限度檢查xxx公司EP6.0-2.6.12微生物限度檢查文件編號：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準審核制定方案設(shè)計，管理制度2.6.12非無菌產(chǎn)品的微生物限度檢查（總的需氧菌菌落計數(shù)）本章包括兩種檢驗方法。第一種方法給出的是測定適用性的參考方法。因些在一個專論中依照本法就意味著依從第一種方法，除非特別指出要使用第二種方法。第二種方法也是歐洲藥典的官方組成部分，并且值得注意的是第二種方法特別適用于銷售認可。一旦該相關(guān)專論被修訂就意味著將用第二種方法替代第一種方法。第二種方法包含日本藥典和美國藥典的共同部分使其能夠協(xié)調(diào)。A．歐洲藥典方法該試驗方法所講的是在需氧條件下生長的嗜溫性細菌和真菌類微生物的定量檢測。設(shè)計該試驗的最初目的是以審疑的態(tài)度為了測定一種物質(zhì)按照歐洲藥典的檢測方法是否符合微生物的特定限定要求。如果是以這種目的來測定的話，根據(jù)下述方法，包括所需的樣品數(shù)和按照下面方法來解釋結(jié)果。該法也用來測定藥典所描述的抗菌保留的有效性（5.1.3）。此外，該法也可以用來監(jiān)測原料質(zhì)量同時也可以用來作為微生物質(zhì)量檢測的指導(dǎo)方針（5.1.4）。如果是用來指導(dǎo)以下目的，如生產(chǎn)廠家的原料檢測和/或終產(chǎn)品的檢測或終點判定，則包括所需樣品數(shù)和結(jié)果解釋的試驗方法就必須在生產(chǎn)廠家和主管當(dāng)局之間達成一致。執(zhí)行該方法所設(shè)計的實驗條件就必須避免所測產(chǎn)品受到意外污染。避免污染所采取的措施不側(cè)夠影響任何所測的微生物。如果所測產(chǎn)品有抗菌活性，則該產(chǎn)品活性必須補充分中和掉。如果因為該種目的使用滅活劑則必須證明該滅活劑對微生物的有效性和無毒性。測定總的需氧微生物數(shù)通過微孔濾膜法或?qū)Ｕ撝兴枋龅钠桨寰溆嫈?shù)法。當(dāng)沒有其它方法可以釆用來測定細菌數(shù)時保留最大可能數(shù)（MostProbableNumber,MPN）.選擇哪種應(yīng)該根據(jù)產(chǎn)品的特性和可預(yù)計的微生物數(shù)等因素來選擇。任何選擇的方法必須通過合理的驗證。當(dāng)根據(jù)5.1.3或5.1.4使用時，可以使用平板澆注法和表面擴散法，和微孔濾膜法。樣品制備：抽樣檢驗方法：所選樣品必須遵循抽樣樣品規(guī)則。抽樣檢驗的結(jié)果依賴于下列因素：如樣品批號，不可接受的高污染產(chǎn)品的健康危害，產(chǎn)品特性，可預(yù)料的污染程度等。除了特別說明外，取10g或10ml物質(zhì)或制劑檢測，釆取上面提到的預(yù)防措施。從大批樣品中隨機選擇樣品或從制劑容器中隨機抽取。如有必要，為了獲得所需的樣品，將容器中大量的內(nèi)容物混勻以保證每一份樣品都能包含在內(nèi)，是否要這樣做依賴于所檢測物質(zhì)或制劑的性質(zhì)?，F(xiàn)舉例說明適用于產(chǎn)品的抽樣檢驗方法，而在該法中關(guān)于微生物分布狀態(tài)的同質(zhì)性方面可能存在問題，該例包括三類抽樣檢驗方法。在該例中有從每批中分別抽取五份樣品。以下是三種方法：（i）可接受的樣本：例如：樣品包括不少于mCFU(菌落數(shù))/gorml,m代表在相關(guān)專論中特定指出的限度。（ii）邊緣樣本：例如：大于mCFU而小于10mCFU/gorml.（iii）有缺陷的樣本：例如：包含大于10mCFU/gorml.水溶性產(chǎn)品：溶解或稀釋10g或10ml待測產(chǎn)品于氯化鈉蛋白胨（pH7.0）緩沖液劇烈振蕩至少30分鐘（得制備液A）或另一種合適的液體中。一般來說要準備好1/10的稀釋液。但是，根據(jù)產(chǎn)品特性或所需的敏感性可以考慮其它比例的溶液。如果產(chǎn)品有抗菌活性，必須添加滅活劑到稀釋液中。如有必要，調(diào)節(jié)pH到大約7，并準備一系列10倍的稀釋液用于樣品稀釋。不溶于水的非脂溶性產(chǎn)品：將10g或10ml待測產(chǎn)品懸浮于氯化鈉蛋白胨（pH7.0）緩沖液或另一種合適的液體中。一般來說要準備好1/10的稀釋液，但根據(jù)一些產(chǎn)品特性或所需的敏感性需要更大體積的液體。可以添加合適的表面活性劑如1g聚山梨醇酯80來幫助不易潤濕的底物懸浮液穩(wěn)定。如果產(chǎn)品有抗菌活性，必須添加滅活劑到稀釋液中。如有必要，調(diào)節(jié)pH到大約7，并準備一系列10倍的稀釋液用于樣品稀釋。脂溶性產(chǎn)品：取10g或10ml待測產(chǎn)品與不多于一半質(zhì)量的滅菌聚山梨醇酯80或另一種滅菌表面活性劑混勻，如有必要可加熱，但不超過40℃，如有例外情況下也不應(yīng)高于45℃。仔細混勻，如有必要可以維持溫度在水浴中或恒溫器中。加充足的預(yù)熱過的氯化鈉蛋白胨（pH7.0）緩沖液制成一倍或10倍原產(chǎn)品的稀釋液。仔細混勻同時維持溫度使其能在最短時間內(nèi)形成乳液狀，但無論如何不要超過30分鐘。此外必須準備一系列10倍氯化鈉蛋白胨（pH7.0）緩沖液包含有合適濃度的滅菌聚山梨醇酯80或其它滅菌表面活性劑。貼劑：用無菌鑷子除去10批貼劑的表面保護膜（“線性釋放”），將它們平放，粘性表面向上放于無菌玻璃或塑料皿中。如有必要，粘性表面用無菌紗布（或纖維聚合物過濾膜）覆蓋，然后轉(zhuǎn)移這10批到最少500ML的氯化鈉蛋白胨（pH7.0）緩沖液中，該溶液添加有適當(dāng)?shù)臏缁钚匀缇凵嚼娲减?0和/或卵磷酯。劇烈振蕩至少30分鐘（得制備液A）。用同樣的方法準備另10批樣品，將它們放在最少500ML肉湯稀釋液D中，劇烈振蕩至少30分鐘（得制備液B）。樣品檢測濾膜法：所用濾膜膜孔直徑不大于0.45微米，并且濾膜高效截留細菌的能力已知。選擇該種濾膜是因為用這種方法使細菌仍然側(cè)夠保持高效性同時不影響所測樣品的成分。例如硝酸纖維素濾膜可以使用于水溶液，油溶液和弱醇溶液。醋酸纖維素濾膜可以用于弱醇溶液。設(shè)計過濾器的目的就是轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中的過濾物。按照樣品制備方法立即轉(zhuǎn)移適量的制備樣品（最好取有代表性的1g樣品，如果所預(yù)期的菌落數(shù)多可以少點）分別到兩層濾膜和濾器上。每個過濾器洗三次，每次用大約100ml合適的液體如氯化鈉蛋白胨（pH7.0）緩沖液。在該溶液中可以加入適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┤缇凵嚼娲?0或抗菌試劑的滅活性。如果用于驗證，則不少于三次洗滌。如果主要是為了測定列舉的細菌，則轉(zhuǎn)移一個濾膜到合適的瓊脂糖表面如介質(zhì)B或其它介質(zhì)上，如果主要是為了測定列舉的真菌類，則轉(zhuǎn)移濾膜到適當(dāng)?shù)沫傊潜砻嫒缃橘|(zhì)C。培養(yǎng)瓊脂糖介質(zhì)B的平板在30-35℃，介質(zhì)C的平板在20-25℃，培養(yǎng)5天，除非在短期內(nèi)可得到可靠的菌落數(shù)。平板計數(shù)法要選擇最多菌落數(shù)不多于100個菌落的平板，計算每克或每ml產(chǎn)品中的菌落數(shù)。當(dāng)檢測貼劑時，通過兩層的無菌濾膜分別過濾50ml的制備液A。將一個濾膜放置到瓊脂糖B介質(zhì)中用來計算總的需氧微生物菌落數(shù)，另一個濾膜到瓊脂糖C用來計算真菌的菌落數(shù)。平板菌落計數(shù)法平板灌注法利用直徑9cm的有蓋培養(yǎng)皿，向每個培養(yǎng)皿中加1ml上述按樣品制備方法制備的樣品，然后再加15-20ml適合培養(yǎng)細菌的液態(tài)的瓊脂糖培養(yǎng)基（如介質(zhì)B），或15-20ml適合培養(yǎng)真菌的液態(tài)的瓊脂糖培養(yǎng)基（如介質(zhì)C），在不高于45℃的條件下培養(yǎng)。如果使用更大的有蓋培養(yǎng)皿，瓊脂糖的量要相應(yīng)增加。對每一種介質(zhì)，每種濃度的稀釋液要準備至少2個有蓋培養(yǎng)皿。除非在短期內(nèi)可以得到較好的菌落，一般情況下將平板在30-35℃下培養(yǎng)5天（真菌在20-25℃下培養(yǎng)5天）。對每一種稀釋液選擇一種相應(yīng)的平板，最多菌落數(shù)不少于300（對于真菌不少于100）。計算菌落平均值和計算每克或每ML表面延伸法利用直徑9cm的有蓋培養(yǎng)皿，在每個平皿中，45℃下，加15-20ml適合培養(yǎng)細菌的液態(tài)的瓊脂糖培養(yǎng)基（如介質(zhì)B），或15-20ml適合培養(yǎng)真菌的液態(tài)的瓊脂糖培養(yǎng)基（如介質(zhì)C），然后使其固化。如果使用更大的有蓋培養(yǎng)皿，瓊脂糖的量要相應(yīng)增加。干燥平板，例如在層流柜中或恒溫培養(yǎng)箱中。涂定量但不超過0.1ML的按照上述制備方法制取的樣品于上述平板的表面上。對每一種介質(zhì)，每種濃度的稀釋液要準備至少2個有蓋培養(yǎng)皿。同平板灌注法一樣培養(yǎng)和計算菌落數(shù)。最大可能數(shù)（MPN）計算法表2.6.12.1－細菌的最大可能數(shù)在每一稀釋條件下3個試管陽性試管數(shù)MPN/g類型95％可信任限度0.1g0.01g0.001g12000<3--0103x<1171003x1211017x2271107x22812011x4352009x23820114x54821015x55021120x86122021x86330023x712930138x1018031043x2021031175x2028032093x30390321150x50510322210x80640330240x1001400331460x20024003321100x3004800333>1100--類型1：正常結(jié)果，95％可信類型2：不太可能的結(jié)果，只有4％的可信度這些結(jié)果不用于重要決定，比類型2還不可能的結(jié)果并未提到，這種結(jié)果也總是不可接受。MPN的精確度和準確度不低于微孔濾膜法或平板菌落計數(shù)法。特別對于列舉的霉菌通常會得到不可信的結(jié)果。因為上述原因，MPN法通常只有在沒有其它合適的方法可用時才用來測定細菌。如果該法可行，則方法如下：按照樣品制備法準備至少3個梯度的10倍稀釋液。對每一個稀釋液，在3個試管中分別接種1G/ML的樣品液在9-10 ML合適的液體介質(zhì)中（如肉湯介質(zhì)A）。如有必要，表面活性劑如聚山梨醇酯80或抗生素試劑滅活劑可以加到該介質(zhì)中。因此如果準備了3個梯度的稀釋液則需要接種9個試管。所有試管在30-35℃下培養(yǎng)5天。記錄每種稀釋液的試官微生物的生長情況。如果根據(jù)所測產(chǎn)品特性結(jié)果不好讀或不確定，可以在同樣的肉湯中再次培養(yǎng)，或在合適的瓊脂糖介質(zhì)中培養(yǎng)（如瓊脂糖介質(zhì)B），在同樣的溫度下培養(yǎng)18-24h,然后使用該結(jié)果。從表2.6.12-1表格中確定每克或每ML產(chǎn)品中細菌的最大可能數(shù)。高效的培養(yǎng)介質(zhì)和有效的計數(shù)方法將合適的細菌試驗株分別在含有合適的液態(tài)介質(zhì)（如肉湯介質(zhì)A）的容器中在30-35℃下培養(yǎng)18-24h。真菌試驗株在合適的瓊脂糧介質(zhì)（如無抗生素的介質(zhì)C）中在20-25℃下培養(yǎng)48小時如白色念珠菌，對曲霉菌在20-25℃下培養(yǎng)7天。金黃色葡萄球菌例如ATCC6538（NCIMB9518,CIP4.83）大腸桿菌例如ATCC8739（NCIM8545,CIP53.126）枯草芽孢桿菌例如ATCC6633（NCIM8054,CIP52.62）白色念珠菌例如ATCC10231（NCPF3179，IP48.72）黑曲霉菌例如ATCC10231（IMI149007，IP1431.83）用每ML氯化鈉蛋白胨（pH7.0）緩沖液中大約含有100個形成菌落的懸浮液作為對照品。用分別含有各種微生物的懸浮液作為計數(shù)法的控制，懸浮液分別加有被測產(chǎn)品和不加被測產(chǎn)品。當(dāng)用微孔濾膜法或平板計數(shù)法時，對于任何測定的微生物接種所得計算值不相差5倍。對于從MPN法接種所得的計算值要在95％可信限度內(nèi)。為了檢驗介質(zhì)和稀釋液的無菌狀態(tài)，用無菌的氯化鈉蛋白胨（pH7.0）緩沖液作為測試液。在其上必須沒有微生物生長。結(jié)果解釋細菌數(shù)與瓊脂糖介質(zhì)B中的菌落平均數(shù)相等。真菌數(shù)與瓊脂糖介質(zhì)C中的菌落平均數(shù)相等?？偟男柩蹙鷶?shù)是上述兩種菌之和。如果有證據(jù)表明同種類型的微生物在這兩種介質(zhì)中生長則結(jié)果就是正確的。MPN法所計算的值是細菌數(shù)。專論中所規(guī)定的限度解釋如下：102微生物：最大可接受限度：5*102103微生物：最大可接受限度：5*103等。如果使用抽樣方式，如三步抽樣法過程如下：對每五個樣品分別計算總的需氧菌數(shù)。如果按照下面條件操作，則物或制備液通過了測試：沒有單個的總需氧菌數(shù)超過了所預(yù)計限度的10倍或更多（如沒有不可接受的樣品）不超過2個的總需氧數(shù)在預(yù)計限度和10倍限度之內(nèi)（如沒有兩個邊緣樣品）所推薦使用的溶液和培養(yǎng)介質(zhì)將2.6.13中講到。B．協(xié)調(diào)法：非無菌產(chǎn)品的微生物限度試驗：微生物列舉試驗1.簡介：該試驗方法所講的是在需氧條件下生長的嗜溫性細菌和真菌類微生物的定量檢測。設(shè)計該試驗的最初目的是為了確定一種物質(zhì)或制備液是否符合微生物質(zhì)量已制定的規(guī)定。如果是這種目的，則需要遵從下面的說明，包括所需樣品數(shù)，從而根據(jù)下面所提到的方法來解釋結(jié)果。該法不適用于包含微生物作為活性成分的產(chǎn)品?？梢允褂米詣邮占ㄗ鳛樘娲?，與藥典所用方法具有同樣效力。2.一般操作過程設(shè)計方法時所用條件要避免外在微生物對產(chǎn)品的污染。必須釆取措施避免污染以便它們不影響任何所測微生物。如果所測產(chǎn)品有抗菌活性，必須將這種活性去除或中和掉。如果因此使用了滅活劑，必須證明它們對微生物的高效性和無毒性。如果在樣品制備中加了表面活性劑，必須證明它們對微生物的無毒性和與滅活劑的兼容性。3.舉例方法按規(guī)定用微孔濾膜法或平板菌落計數(shù)法。MPN法對微生物測定來說是最不精確的方法，但是，如果某些產(chǎn)品所含極少的微生物量，該法是最合適的方法。方法選擇基于下列因素：如產(chǎn)品的特性和所要求的微生物量。所選方法必須能夠測定充足的樣品從而來判斷該法的適應(yīng)性。所選方法的合適性必須確定。4.促生長實驗和計數(shù)法4-1總則在不加產(chǎn)品的條件下該試驗?zāi)軌驒z測微生物的能力必須已確定。如果測試條件改變或產(chǎn)品改變，必須證實方法的適應(yīng)性，因為這些改變可能影響試驗的最終結(jié)果。4-2試驗菌株的準備使用測試菌株標準穩(wěn)定的懸浮液或按下面方法制備。批種子培養(yǎng)技術(shù)（seedlotculturemaintenancetechniques,seed-lotsystems）的使用以至于用于接種的微生物從最初的主批種子轉(zhuǎn)移走不多于5通道。細菌和真菌試驗株的生產(chǎn)分別見表格2.6.12-2。使用氯化鈉蛋白胨（pH7.0）緩沖液或pH7.2的磷酸緩沖液制作試驗用懸浮液。對于曲霉菌需要加入0.05％聚山梨醇酯80到緩沖液中。如果在2-8℃下保存則該懸浮液要在2-24小時內(nèi)使用。作為一種可替代的制備方法，稀釋含有曲霉菌或枯草芽孢桿菌的新鮮懸浮液，該懸浮液中加有植物細胞，從而可以制得一種穩(wěn)定的孢子懸浮液，對于接種試驗來說需要將該孢子懸浮液調(diào)整到一個合適的體積下。該孢子懸浮液可以在2-8℃保存到適合驗證的時間。4-3陰性對照為了驗證試驗條件必須使用可選用的稀釋液作為陰性對照來替代測試液。在該陰性對照品中必須沒有微生物生長。4-4生長促進介質(zhì)測試每一批準備好的介質(zhì)和每一批介質(zhì)，要么準備脫水介質(zhì)要么準備含有所描述的成分。用表2.6.12-2中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接種到含有大豆豆蛋白胨消化肉湯的液體/平板和大豆豆蛋白胨消化瓊脂上，對每一種使用各自的含有介質(zhì)的液體/平板。用表2.6.12-2中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接種到薩布羅－葡萄糖瓊脂糖平板，對每一種使用各自含用介質(zhì)的平板。接種條件見表2.6.12-2。對固體介質(zhì)而言，對標準接種物來講，所得的生長值不超過計算值的兩倍。與用先前的測試方法和驗證的批介質(zhì)所得的測試結(jié)果相比，新制備的接種物將會出現(xiàn)微生物的生長值。與用先前的測試方法和驗證的批介質(zhì)所得的測試結(jié)果相比，如果清淅可見的微生物生長可見，則液體介質(zhì)是合適的。4-5對于所測產(chǎn)品合適的計數(shù)方法4-5-1樣品制備樣品制備方法選擇依賴于所測產(chǎn)品的物理特性。如果下面所描述的方法均不合適的話，可選用替代方法。水溶性產(chǎn)品溶解或稀釋（通常1-10倍的稀釋液需要準備）待測產(chǎn)品于氯化鈉蛋白胨（pH7.0）緩沖液,pH7.2的磷酸緩沖液或干酪豆素消化液肉湯。如有必要，調(diào)節(jié)pH6-8。如果必要，可以準備更多倍的同樣稀釋劑的稀釋液。表2.6.12.-2-微生物制備和使用微生物受試菌株制備促生長在產(chǎn)品存在的情況下的計數(shù)方法的適應(yīng)性需氧菌總數(shù)總酵母菌和霉菌數(shù)需氧菌總數(shù)總酵母菌和霉菌數(shù)金黃色葡萄球菌如：ATCC6538NCIMB9518CIP4.83NBRC13276酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉湯30-3518-24小時酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉湯≤100CFU30-35≤3天酪蛋白大豆消化瓊脂/MPN酪蛋白大豆消化肉湯≤100CFU30-35≤3天銅綠假單胞菌如：ATCC9027NCIMB8626CIP82.118NBRC13275酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉湯30-3518-24小時酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉湯≤100CFU30-35≤3天酪蛋白大豆消化瓊脂/MPN酪蛋白大豆消化肉湯≤100CFU30-35≤3天枯草桿菌如：ATCC6633NCIMB8054CIP52.62NBRC3134酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉湯30-3518-24小時酪蛋白大豆消化瓊脂或酪蛋白大豆消化肉湯≤100CFU30-35≤3天酪蛋白大豆消化瓊脂/MPN酪蛋白大豆消化肉湯≤100CFU30-35≤3天白色念珠菌如：ATCC10231NCPF3179IP48.72NBRC1594沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯20-252-3天酪蛋白大豆消化瓊脂≤100CFU30-35≤5天沙氏葡萄糖瓊脂≤100CFU20-25≤5天酪蛋白大豆消化瓊脂≤100CFU30-35≤5天MPN：不能適用沙氏葡萄糖瓊脂≤100CFU20-25≤5天黑曲霉菌如：ATCC16404IMI149007IP1431.83NBRC9455沙氏葡萄糖瓊脂或馬鈴薯葡糖萄糖瓊脂20-255-7天或者到達到很好的芽孢形成酪蛋白大豆消化瓊脂≤100CFU30-35≤5天沙氏葡萄糖瓊脂≤100CFU20-25≤5天酪蛋白大豆消化瓊脂≤100CFU30-35≤5天MPN：不能適用沙氏葡萄糖瓊脂≤100CFU20-25≤5天不溶于水的非脂類產(chǎn)品。讓受檢產(chǎn)品（通常以1：10稀釋制備）懸浮在pH7.0的緩沖氯化鈉蛋白胨溶液，pH7.2的磷酸緩沖液或酪蛋白大豆消化肉湯中。加入例如1g/l的聚山梨醇酯80的表面活性因子來輔助幾乎不可濕的物質(zhì)的懸浮。如果需要的話，把pH調(diào)節(jié)為6-8。如果需要的話，用同樣的稀釋液進一步稀釋。脂類產(chǎn)品。把受檢產(chǎn)品溶解在豆蔻酸異丙脂中，通過過濾滅菌或把產(chǎn)品與最小需要量的無菌聚山梨醇酯80或其他的非抑制表面活性劑混合，如果需要的話加熱到不超過40℃，或者在特殊情況下不超過45℃氣溶的液體或固體。把產(chǎn)品無菌轉(zhuǎn)移到一個膜過濾裝置或者一個物均區(qū)容器中來進一步取樣。使用總含量或每個檢查容器中的計量的確定的量。透皮貼劑。去掉透皮貼劑的保護覆蓋墊(‘隔離襯墊‘)并把它們向上貼在無菌玻璃或塑料盤上。用無菌多孔物質(zhì)例如無菌紗布來覆蓋粘貼面，來避免貼劑粘在一起并把貼劑轉(zhuǎn)移到含有如聚山梨醇酯80和/或卵磷脂的滅活劑的所選的適當(dāng)體積的稀釋液中。至少用力搖晃制備溶液30分鐘。4-5-2接種和稀釋。假如如上述制備的樣品（4-5-1）到一個控制的（不包括被檢物質(zhì)）足夠量的微生物混懸溶液中來獲得一個不超過100CFU的接種體。接種體的混懸液的體積不能超過稀釋產(chǎn)品的體積的1%。為說明產(chǎn)品的可接受微生物回收率，實驗中應(yīng)該使用制備樣品的最低可能稀釋因子。如果因為抗微生物活性或者很差的溶解性而不可能，需要進一步探索合適的方案。如果樣品的生長的抑制時不可避免的，在中和，稀釋或過濾后應(yīng)假如微生物混懸液的代表性試樣。4-5-3中和/抗微生物活性的去除。把如4-5-2所述的稀釋制備的樣品按照4-5-4中描述的規(guī)程進行接種回收的微生物的數(shù)量和與對照制備中回收的微生物的數(shù)量作比較。如果生長被抑制（抑制因子大于2），修改列舉的檢查的過程來保證結(jié)果的有效性。過程的修改可能包裹，例如，（1）稀釋液體積或培養(yǎng)基的增加，（2）特殊的或一般的中和因子與稀釋液的結(jié)合，（3）膜過濾，或（4）上述措施的組合。中和因子。中和因子可能被用來中和抗菌因子的活性（表2.6.12.-3）。它們可能在滅菌前被加入到所選稀釋液或更好的培養(yǎng)基中。如果使用的話，它們的功效和對微生物無毒性必須通過使用中和因子不使用產(chǎn)品的空白實驗進行說明。表2.6.12.-3干擾物質(zhì)的一般中和因子干擾物質(zhì)可能的中和方法戊二醛，汞硫酸氫鈉（亞硫酸氫鈉）酚，醇，醛，吸著物稀釋醛氨基乙酸季銨化合物(QACs)，對羥基苯甲酸酯（對羥基苯甲酸酯），二-二雙胍類卵磷脂QACs，碘，對羥基苯甲酸酯聚山梨醇酯汞劑Thioglycollate硫乙醇酸鹽汞劑，鹵素，醛硫代硫酸鹽EDTAMg2+或Ca2+若找不到中和方法，就可認為分離接種微生物失敗歸因為產(chǎn)品的微生物活性。這一信息說明產(chǎn)品不可能被上述微生物微生物污染。然而，產(chǎn)品可能只存在于在此提到的微生物中，但不存在于其他在此提到的微生物中。然后，以與微生物生長和標準所允許的最高濃度系數(shù)進行試驗。4-5-4.在產(chǎn)品存在的情況下微生物的回收。對以上列出的微生物進行分離試驗。僅計算加入測試菌的微生物。4-5-4-1.膜過濾。使用孔徑不大于0.45μm的濾膜過濾。選擇濾膜材料類型時，要求濾膜對微生物的滯留能力不受到所觀察樣品成份的影響。每種上述微生物使用一張濾膜。將適量按4-5-1至4-5-3制備的樣品（含1g產(chǎn)品，若預(yù)期CFU較大，則小于1g）用膜過濾，立即過濾并用適量稀釋液沖洗濾膜。將膜轉(zhuǎn)移到豆酪素消化瓊脂表面上，以確定厭氧菌總數(shù)(TAMC)。將濾膜轉(zhuǎn)移到沙氏葡糖瓊脂上，以確定總酵母菌/霉菌（TYMC）按表2.6.12-2接種，進行計數(shù)。4-5-4-2.平皿計數(shù)法。至少在對各培養(yǎng)基復(fù)制菌使用平皿計數(shù)法，對結(jié)果取平均值。4-5-4-2-1.澆碟法在直徑9cm的Petri碟中加入1ml按4-5-1至4-5-3法制備的樣品以及15-20ml豆酪素消化瓊脂或沙氏葡糖瓊脂。培養(yǎng)基溫度均不超過45℃。若使用更大的Petri碟，則瓊脂的量也要相應(yīng)增加。對于每個表2.6.12.-2中列出的微生物，至少要使用2個Petri培養(yǎng)基。根據(jù)表2.6.12.-2進行接種。取各培養(yǎng)基的菌落數(shù)的數(shù)學(xué)平均值計算在原接種CFU的量。4-5-4-2-2.表面涂布法在各直徑9cm的Petri碟中加入15-20ml豆酪素消化瓊脂或沙氏葡糖瓊脂，放置使其凝固。培養(yǎng)基溫度均不超過45℃。若使用更大的Petri碟，則瓊脂的量也要相應(yīng)增加。在層流通風(fēng)柜或培養(yǎng)箱中干燥。對于每個表2.6.12.-2中列出的微生物，至少要使用2個Petri培養(yǎng)基。量取不少于0.1ml按4-5-1至4-5-3制備的樣品涂布于培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)并按4-5-4-2-1描述的方法計數(shù)。4-5-4-3．最大概率數(shù)法（MPN）MPN法的精確性不及膜過濾法和平皿計數(shù)法。在對霉菌計數(shù)時結(jié)果尤為不可靠。因此，在無法使用其他方法時，才可以考慮使用MPN法對TAMC計數(shù)。如果認定可以使用該法，則按以下方法進行。按4-5-1至4-5-3制備一系列濃度的產(chǎn)品，至少3個10倍稀釋液。對于每個濃度梯度的溶液，將3等分試樣接種于含9-10ml豆酪素消化培養(yǎng)基的試管內(nèi)。若有必要，應(yīng)向培養(yǎng)基中加入表面活性試劑，例如吐溫-80，或微生物抑制劑。這樣，若使用3個梯度的稀釋度，則共接種9個試管。在30-35℃培養(yǎng)不超過3天。若因產(chǎn)品本身的性質(zhì)難以讀出結(jié)果或不能確定，則在同一培養(yǎng)基或豆酪素消化瓊脂上在同一溫度下傳代培養(yǎng)1-2天，取得到的結(jié)果。根據(jù)表2.6.12.-4確定每克或每毫升產(chǎn)品的微生物最大概率數(shù)。4-6.結(jié)果和解釋在確定膜過濾法和平皿計數(shù)法的適用性時，需要得到與4-5-2中無產(chǎn)品存在的對照值相差系數(shù)不大于2的任意試驗菌平均數(shù)。在確定MPN法適用性時，接種值的計算值與對照值必須在95％置信區(qū)間內(nèi)。若不符合上述標準或試驗菌大于以上方法所述，則使用最接近標準的方法和試驗條件。5.產(chǎn)品試驗5-1.試驗使用量除另有規(guī)定外，參照上述方法取10g或10ml待測品。液體或固體的氣溶膠，取10個容器的樣品。若為透皮貼片，取10片。在活性物質(zhì)按以下方式制備的情況下，試驗用量可以減少：單位劑量（如片劑，膠囊和注射劑）少于或等于1mg，或每克或每毫升（對于不以單位劑量為形式的制劑）中活性物質(zhì)少于1mg的。在這些情況下，試驗用量不少于10個單位劑量或10g或10ml產(chǎn)品中的物質(zhì)含量。對于作為活性物質(zhì)的原料，若樣品的量受限制，或批量很?。ㄈ纾荷儆?000ml或1000g），則實驗兩應(yīng)為批量的1％，除非另有規(guī)定允許使用更小的量。對于批量總數(shù)小于200（如臨床試驗使用的樣品），則樣品可減少為2個單位，若批量小于100，可為1個單位。從原料藥或制劑、容器中隨機取樣?；旌弦欢咳萜髦械漠a(chǎn)品，以便得到足夠量的樣品。5-2.產(chǎn)品試驗5-2-1.膜過濾使用規(guī)定的過濾裝置使濾渣轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基上。根據(jù)第4節(jié)的所述，使用適用的方法制備樣品，并將適量樣品各轉(zhuǎn)移到2張膜上，并立即過濾。選取以下合適的方法沖洗各膜。將膜轉(zhuǎn)移到豆酪素消化瓊脂表面上，以確定厭氧菌總數(shù)(TAMC)。將濾膜轉(zhuǎn)移到沙氏葡糖瓊脂上，以確定總酵母菌/霉菌（TYMC）。接種于豆酪素消化瓊脂上，在30-35℃下培養(yǎng)3-5天，接種于沙氏葡糖瓊脂上，在20-25℃下培養(yǎng)5-7天。計算每克或每毫升產(chǎn)品的CFU。對于透皮貼片，根據(jù)4-5-1所述，各通過2張無菌膜分別過濾制劑體積的10％。將一張膜轉(zhuǎn)移至豆酪素消化瓊脂上確定TAMC，另一張轉(zhuǎn)移到沙氏葡糖瓊脂上確定TYMC。5-2-2.平皿計數(shù)法5-2-2-1.澆碟法根據(jù)第4部分所述制備樣品。每一培養(yǎng)基的每一稀釋度至少制備2個Pet