《時(shí)空組學(xué)樣本制備操作規(guī)范》

Q/LB.□XXXXX-XXXX目次TOC\o"1-1"\h\t"標(biāo)準(zhǔn)文件_一級(jí)條標(biāo)題,2,標(biāo)準(zhǔn)文件_附錄一級(jí)條標(biāo)題,2,"前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 14縮略語(yǔ) 25樣本要求 25.1樣本前處理 25.2樣本處理 25.3切片 35.4儲(chǔ)存 36組織樣本石蠟包埋 36.1樣本前處理 36.2石蠟包埋 46.3切片 46.4儲(chǔ)存 4附錄A（資料性）植物和動(dòng)物組織樣本的處理方法 5A.1植物組織樣本的處理方法 5A.2動(dòng)物組織樣本的處理方法 5附錄B（資料性）動(dòng)物和植物組織切片厚度 7B.1動(dòng)物和植物組織切片厚度 7附錄C（資料性）FAA固定液和蔗糖-PBS溶液（3%）配制方法 8C.1FAA固定液 8C.2蔗糖-PBS溶液（3%） 8參考文獻(xiàn) 9前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由深圳市生命科技產(chǎn)學(xué)研資聯(lián)盟提出并歸口。本文件起草單位：本文件主要起草人：本文件為首次發(fā)布。時(shí)空組學(xué)樣本制備操作規(guī)范范圍本標(biāo)準(zhǔn)提供了時(shí)空組學(xué)冷凍組織樣本和石蠟組織樣本的制備建議。本標(biāo)準(zhǔn)適用于開(kāi)展時(shí)空組學(xué)研究的相關(guān)機(jī)構(gòu)。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T37864-2019/ISO20387:2018生物樣本庫(kù)質(zhì)量和能力通用要求術(shù)語(yǔ)和定義GB/T37864-2019/ISO20387:2018界定的以及下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

時(shí)空組學(xué)stereo-seq是指主要研究細(xì)胞在組織樣品中的相對(duì)位置關(guān)系，用于揭示細(xì)胞空間分布關(guān)系對(duì)疾病、器官發(fā)育等生物學(xué)進(jìn)程的影響。

組織樣本tissuesample以研究為目的，從生物體中切取的組織。

石蠟包埋paraffinembedding將組織樣本置于石蠟中，產(chǎn)生堅(jiān)硬的周圍基質(zhì)，以便切割出薄層顯微切片的過(guò)程。

OCT包埋optimalcuttingtemperaturecompoundembedding是指利用一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物包埋劑將需要包埋的組織包裹起來(lái)以提供性能支撐或化學(xué)保護(hù)的過(guò)程。

處理processing在生命周期的所有階段對(duì)生物樣本和相關(guān)數(shù)據(jù)執(zhí)行的全部活動(dòng)。[來(lái)源：GB/T37864-2019/ISO20387:2018,3.36]

儲(chǔ)存storage將生物樣本保持在特定條件下以備將來(lái)使用。[來(lái)源：GB/T37864-2019/ISO20387:2018,3.47]切片slice指用特制刀具將生物體的組織切成適用于時(shí)空組學(xué)實(shí)驗(yàn)的薄片。透明clearing是指利用透明劑的性質(zhì)將脫水劑從組織中置換出來(lái)，使石蠟?zāi)軌蝽樌M(jìn)入材料中的過(guò)程。浸蠟waxing指組織透明后，在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程?？s略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。OCT：OCT包埋（Optimalcuttingtemperaturecompound）FAA：酒精醋酸福爾馬林混合固定液（Formalin-aceticacid-alcohol）組織樣本冷凍包埋ACSF：人工腦脊液（Artificialcerebrospinalfluid）PBS：磷酸緩沖鹽溶液（Phosphatebufferedsaline）樣本要求樣本應(yīng)為新鮮組織或速凍組織塊。樣本前處理對(duì)于不同的組織，宜采用不同方式獲取組織樣本。在樣本處理過(guò)程中不應(yīng)有組織的擠壓和形變，應(yīng)根據(jù)預(yù)期要求選擇對(duì)組織樣本進(jìn)行固定或不固定直接包埋處理。固定組織樣本處理植物組織樣本固定處理參考附錄A.1.1。動(dòng)物組織樣本固定處理參考附錄A.2.1。樣本直接包埋前處理植物組織樣本直接包埋前處理參考附錄A.1.2。動(dòng)物組織樣本直接包埋前處理參考附錄A.2.2。樣本運(yùn)輸如需運(yùn)輸樣本，應(yīng)采取干燥運(yùn)輸方式。如實(shí)驗(yàn)室條件允許，建議在新鮮樣本離體30分鐘內(nèi)進(jìn)行速凍、直接包埋或固定處理，最大程度上避免組織內(nèi)部RNA降解。干燥運(yùn)輸方式是指將新鮮組織放置在干燥無(wú)菌容器內(nèi)，置于干冰上保持低溫運(yùn)輸。經(jīng)過(guò)固定處理后的組織應(yīng)保存在固定液中常溫運(yùn)輸。樣本處理樣本包埋前組織表面不應(yīng)有液體殘留。直接冷凍包埋直接冷凍包埋應(yīng)采用液氮異戊烷包埋或干冰包埋。液氮異戊烷包埋液氮異戊烷包埋宜采用如下步驟：操作人員提前準(zhǔn)備好不同尺寸的不銹鋼燒杯，其中大燒杯加入1/3液氮，小燒杯加入1/3的異戊烷。將盛有異戊烷的小燒杯放入盛有液氮的大燒杯中，應(yīng)孵育至少10分鐘；提前在包埋盒底部加入一層厚度約3mm的OCT，液氮冷凍至OCT泛白。應(yīng)盡量保持OCT表面平整；預(yù)先確定組織包埋的方向，將組織放入包埋盒中預(yù)鋪的OCT上，調(diào)整方向后加入預(yù)冷的OCT完全覆蓋組織，在此過(guò)程中應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡；用鑷子夾起包埋盒放入用液氮預(yù)冷過(guò)的異戊烷中，等待OCT完全變硬；組織包埋完成后，在包埋盒的四面標(biāo)記組織方向和預(yù)切片方向；需將OCT包埋的組織塊放入-80℃的密封容器中長(zhǎng)期保存，或即刻進(jìn)行冷凍切片和切片放置。干冰包埋干冰包埋宜采用如下步驟：操作人員提前將包埋盒放置于干冰中進(jìn)行預(yù)冷，并提前將OCT放置干冰上預(yù)冷10分鐘；提前在包埋盒底部加入一層厚度約3mm的OCT，應(yīng)盡量保持OCT表面平整；待包埋劑冰凍至不透明狀后，按照預(yù)定的方向?qū)⒔M織放置在OCT上，并鋪上OCT，多次操作直至組織完全覆蓋；組織包埋完成后，在包埋盒的四面標(biāo)記組織方向和預(yù)切片方向；需將OCT包埋的組織塊放入-80℃的密封容器中長(zhǎng)期保存，或即刻進(jìn)行冷凍切片和切片放置。切片OCT試劑填充樣品盤后，將OCT包埋的組織塊置于樣品盤上，應(yīng)切面朝外放置在冷凍切片機(jī)上。切片前，應(yīng)將OCT包埋的組織塊放入冷凍切片機(jī)的腔體中溫度平衡30分鐘以上。組織塊過(guò)冷會(huì)導(dǎo)致切片破裂，組織塊過(guò)熱會(huì)導(dǎo)致切片壓縮或皺縮。冷凍切片機(jī)腔體和凍頭的溫度應(yīng)參考切片機(jī)說(shuō)明書(shū)設(shè)定至符合預(yù)期要求，載玻片宜冷卻至少30分鐘至低溫。應(yīng)使用冷凍切片機(jī)去除多余的OCT，持續(xù)切片至組織清晰可見(jiàn)。切片時(shí)宜將較大的組織樣本分割為較小的樣本以覆蓋捕獲區(qū)域。建議對(duì)冷凍組織切片進(jìn)行質(zhì)檢，以確定組織中RNA的完整性。組織切片厚度見(jiàn)附錄B。獲得所需的組織切片后，宜使用低溫恒溫刷小心將組織切片展平。將預(yù)先進(jìn)行溫度平衡的載玻片捕獲區(qū)域刀口貼到組織切片上，用手指貼放在載玻片的背面使整個(gè)組織貼片完全貼附在載玻片上。切片和組織切片放置過(guò)程中需全程在冷凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行。儲(chǔ)存應(yīng)使用已在4℃溫度下提前預(yù)冷的OCT覆蓋剩余OCT冷凍組織塊的暴露組織面，使其凍結(jié)并放入密封盒，保存在-80℃的冰箱中。組織樣本石蠟包埋樣本前處理樣本固定進(jìn)行石蠟包埋的組織在取材后應(yīng)迅速置于FAA固定液中進(jìn)行固定，F(xiàn)AA固定液配制方法見(jiàn)附錄C.1。脫水脫水程序宜采用逐級(jí)脫水，從較低濃度酒精，逐漸替換到高濃度酒精緩慢進(jìn)行，避免組織出現(xiàn)變硬、變脆或發(fā)生收縮的現(xiàn)象。等級(jí)脫水為50%濃度酒精→70%濃度酒精→80%濃度酒精→95%濃度酒精→無(wú)水酒精（兩次），每級(jí)停留時(shí)間視組織的大小和類型做適當(dāng)調(diào)整。透明透明程序宜采用逐級(jí)的方式進(jìn)行，減少材料收縮。逐級(jí)透明為2/3純酒精+1/3二甲苯→1/2純酒精+1/2二甲苯→1/3純酒精+2/3二甲苯→二甲苯（兩次）。透明時(shí)間視組織的大小和類型做適當(dāng)調(diào)整。如樣本材料放入二甲苯中有白色渾濁現(xiàn)象發(fā)生時(shí)，需把樣本材料退回至純酒精中再次進(jìn)行脫水。浸蠟在樣本材料最后一次進(jìn)行二甲苯透明后即可浸蠟，浸蠟宜從低溫到高溫、從低熔點(diǎn)到高熔點(diǎn)逐級(jí)進(jìn)行。整個(gè)浸蠟過(guò)程應(yīng)在水浴或融蠟恒溫箱中進(jìn)行，避免使用明火加熱石蠟。浸蠟逐級(jí)過(guò)程為石蠟（軟蠟：熔點(diǎn)45℃～50℃）→石蠟（硬蠟：熔點(diǎn)56℃～58℃）→石蠟（硬蠟：熔點(diǎn)56℃～58℃），直至石蠟飽和為止。石蠟包埋石蠟包埋宜采用如下步驟：操作人員將融化的石蠟（硬蠟）倒入包埋模具中；將浸蠟后的組織塊按切面或指定面朝下，用加熱后的鑷子輕輕夾取埋入含有熔蠟的包埋模具中；將組織塊平整的置放于包埋模具的底面中央，應(yīng)避免氣泡的產(chǎn)生；當(dāng)蠟塊冷至蠟面出現(xiàn)一層透明蠟?zāi)r(shí)，浸入冷水中迅速使其冷卻；從包埋模具中取出包埋蠟塊，應(yīng)將樣品編號(hào)封于蠟塊上，以免樣品混淆。用刀片修正成為規(guī)則的正方形或長(zhǎng)方形，并可粗視到材料切面。切片切片機(jī)的使用應(yīng)參照廠商提供的使用方法，組織切片厚度見(jiàn)附錄B。切片機(jī)刀口運(yùn)行方向應(yīng)與材料切面平行，根據(jù)樣本類型和預(yù)期要求調(diào)整所需切片厚度，并進(jìn)行切片。切片應(yīng)完整、均勻、無(wú)刀痕顫痕、無(wú)褶皺開(kāi)裂和缺損，建議進(jìn)行鏡檢。選取合適的石蠟切片放入37℃～50℃的溫水中使其展開(kāi)后附于載玻片上。附著的過(guò)程應(yīng)避免切片與載玻片之間產(chǎn)生氣泡。應(yīng)將載玻片斜置，使多余的水分流出并進(jìn)行烘烤。載玻片一端宜貼上樣本條形碼標(biāo)簽，并進(jìn)行HE染色并封片。儲(chǔ)存石蠟組織塊在每次切片后應(yīng)及時(shí)將切面用蠟封蓋，避免組織與空氣直接接觸。宜采用蠟封固切片和-20℃低溫保存組織切片來(lái)避免抗原損失，或石蠟組織塊4℃低溫保存，在需要時(shí)切片使用。

（資料性）

植物和動(dòng)物組織樣本的處理方法植物組織樣本的處理方法植物組織樣本固定處理植物組織樣本固定處理步驟如下：操作人員提前準(zhǔn)備好大小合適的容器，配制2次使用量的卡諾氏固定液（乙醇：冰醋酸=3:1），置于冰上或在-20℃的溫度下預(yù)冷；固定液體積不應(yīng)超過(guò)容器容積的四分之三。配制2次使用量的蔗糖-PBS緩沖液（3%），配制方法見(jiàn)附錄C.2；使用酒精對(duì)工具進(jìn)行消毒并擦干，剪取植物材料，迅速放入預(yù)冷的卡諾氏固定液中，置于冰上或-20℃溫度下固定1小時(shí)；去凈固定液，加入新鮮的預(yù)冷過(guò)的卡諾氏固定液中，置于冰上或-20℃溫度下固定1小時(shí)；濾去固定液，加入預(yù)冷的蔗糖-PBS溶液（3%），冰上放置1小時(shí)；濾去溶液后，重新加入新的預(yù)冷蔗糖-PBS溶液（3%），在4℃的溫度下放置過(guò)夜；準(zhǔn)備包埋盒并進(jìn)行信息標(biāo)記，加入OCT后置于冰上預(yù)冷；濾去液體后，同鑷子輕夾出樣本，吸干表面液體后將樣本剪切成合適包埋的尺寸，放入包埋盒中；固定后的植物樣本非常綿軟，在夾出及修剪尺寸時(shí)要注意力度。調(diào)整樣本方向，將樣本橫切面垂直于包埋盒一側(cè)的側(cè)壁，使橫切面貼在側(cè)壁上方便后續(xù)切片；將裝有樣本的包埋盒水平放置于小冰盒中，并將其水平放置于真空抽濾的干燥器，真空抽濾5分鐘（-0.1Mpa）；將包埋盒水平放置于有蓋容器中，蓋上蓋子于4℃的溫度下放置過(guò)夜后即可進(jìn)行包埋，包埋操作程序見(jiàn)5.2。植物組織樣本直接包埋前處理植物組織樣本包埋前處理步驟如下：使用酒精對(duì)工具進(jìn)行消毒并擦干；取植物樣本，用剪刀剪下測(cè)試部位，并將樣本剪切至便于包埋的尺寸；以葉片為例，可將一片葉子沿垂直于主葉脈方向剪成寬度約0.5cm的小條，盡量控制葉片寬度短于包埋盒長(zhǎng)度，若葉片過(guò)大可按需要修剪。用鑷子夾起剪切好的植物樣本，快速放入在冰上預(yù)冷的OCT包埋盒中，并調(diào)整樣本方向；以葉片為例，將葉片條豎起，橫切面正對(duì)包埋盒的底面，將葉片條沿著包埋盒的一遍豎直排列在OCT中，用鑷子將葉片條輕輕往下壓，使葉片橫切面盡量貼到包埋盒底部，盡量保持葉片條垂直于包埋盒底部，不傾斜；以花序?yàn)槔?，用鑷子將花序輕輕下壓，使花序以側(cè)面方向貼到包埋盒底面，并用鑷子輕壓每朵消化，使其盡量貼到包埋盒底面。將裝有植物樣本的包埋盒水平放置到冰盒中，再將冰盒水平放置于真空抽濾的干燥器中真空抽濾5分鐘（-0.1Mpa）；抽濾后，材料位置會(huì)發(fā)生一定變化，再次用鑷子輕壓樣本，使樣本貼在包埋盒底面上，以方便后續(xù)切片；參照5.2進(jìn)行包埋處理。動(dòng)物組織樣本的處理方法動(dòng)物組織樣本處理（灌流取樣法）動(dòng)物組織樣本處理步驟如下：根據(jù)動(dòng)物類型選擇合適的麻醉劑，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行深度麻醉，應(yīng)確保對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的四肢或肌肉進(jìn)行動(dòng)作時(shí)，無(wú)任何疼痛或應(yīng)激反應(yīng)；將動(dòng)物頭部固定在立體定位儀上，沿胸骨柄剪開(kāi)胸腔，剪開(kāi)心包膜，暴露心臟。與心尖成30°～45°夾角剪開(kāi)左心室，隨即剪開(kāi)右心耳，將灌注針頭從左心室插入主動(dòng)脈，固定針頭；灌注常溫通氧的人工腦脊液（ACSF，0.6L/kg），并記錄開(kāi)始灌注時(shí)間；常溫ACSF灌注結(jié)束后，開(kāi)始灌注提前預(yù)冷通氧的ACSF，記錄開(kāi)始灌注時(shí)間；預(yù)冷ACSF灌注10分鐘后，觀察灌注效果，準(zhǔn)備取樣本組織；樣本組織獲取后需立即進(jìn)行包埋，處理過(guò)程應(yīng)盡快完成，確保組織的新鮮度。以腦組織為例，在記錄灌注時(shí)間時(shí)，同時(shí)剪去動(dòng)物頭部皮膚準(zhǔn)備開(kāi)顱。ACSF灌注10分鐘后，揭開(kāi)硬腦膜觀察灌注效果，準(zhǔn)備取腦組織。取腦組織時(shí)，借助立體定位儀和顯微操作器將腦組織沿正中矢狀面分為左右半腦。先取下右半腦進(jìn)行矢狀面包埋。隨后，在左半腦AP方向中點(diǎn)的位置，沿冠狀面將左半腦一分為二，并立即進(jìn)行左半腦的冠狀面包埋。動(dòng)物組織樣本直接包埋前處理動(dòng)物組織樣本包埋前處理步驟如下：針對(duì)不同組織可采用不同方式獲取新鮮組織樣本；將新鮮組織放入清洗液中清洗2～3次，去除表面雜質(zhì)。清洗后需用無(wú)菌無(wú)紡布/無(wú)菌無(wú)塵紙擦干表面液體（如需要）；新鮮組織離體后需使用無(wú)菌無(wú)紡布/無(wú)菌無(wú)塵紙將組織表面的血跡或黏液等液體擦拭干凈；如浸泡或清洗組織，需吸干組織表面液體，避免在組織表面形成冰塊影響后續(xù)包埋切片。使用酒精對(duì)工具進(jìn)行消毒并擦干；根據(jù)組織大小提前準(zhǔn)備好合適的包埋盒，將樣本剪切至便于包埋的尺寸；參照5.2進(jìn)行包埋。

（資料性）

動(dòng)物和植物組織切片厚度動(dòng)物和植物組織切片厚度動(dòng)物和植物組織切片厚度見(jiàn)表B.1。表B.1動(dòng)物和植物組織樣本切片厚度樣本類型組織切片厚度動(dòng)物腦10μm心臟10μm腎臟10μm肺10μm胃10μm大腸10μm小腸10μm脾臟10μm卵巢10μm睪丸10μm眼睛10μm甲狀腺10μm股四頭肌10μm乳房10μm～20μm植物葉芽10μm葉、根、莖10μm～20μm種子20μm

（資料性）

FAA固定液和蔗糖-PBS溶液（3%）配制方法FAA固定液福爾馬林（38%甲醛） 5mL冰醋酸 5mL70%酒精 90mL甘油（丙三醇） 5mL稱取上述試劑，進(jìn)行混合搖勻。蔗糖-PBS溶液（3%）首先配制0.5?PBS緩沖液，不同體積的緩沖液配制見(jiàn)表C.1。表C.10.5?PBS緩沖液配制表組分名稱緩沖液體積所對(duì)應(yīng)的組分取樣量5mL10mL100mL10?PBS緩沖液250μL500μL5mL無(wú)核酸酶水補(bǔ)充至5mL補(bǔ)充至10mL補(bǔ)充至100mL根據(jù)不同體積稱取相對(duì)應(yīng)的蔗糖重量，加入新的容器中，蔗糖重量稱取見(jiàn)表C.2。表C.2蔗糖稱取表組分名稱緩沖液體積所對(duì)應(yīng)的組分取樣量5mL10mL100mL蔗糖0.15g0.3g3g稱取蔗糖后，加入配制好的0.5?PBS緩沖液定容至對(duì)應(yīng)體積，置于冰上預(yù)冷。0.5?PBS緩沖液加入蔗糖后體積會(huì)發(fā)生輕微變化，建議最后以定容體積為準(zhǔn)。

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