擬南芥漆酶基因AtLAC4參與生長及非生物脅迫響應(yīng)課件

擬南芥漆酶基因AtLAC4參與生長及非生物脅迫響應(yīng)符曉婕摘要植物漆酶基因家族在擬南芥中共有17個成員,目前各基因的具體功能尚不十分清楚。該研究利用過量表達的方法初步分析了擬南芥AtLAC4的功能。GUS染色顯示AtLAC4在擬南芥的維管組織中有較強的表達,并在葉片排水器中特異表達。AtLAC4過量表達導(dǎo)致植株木質(zhì)素含量增多、次生壁加厚、植株變小和蓮座葉葉柄變短。ABA對AtLAC4的表達具有明顯的誘導(dǎo)作用,AtLAC4過量表達植株對外源ABA敏感;干旱處理后,AtLAC4過量表達植株的耐旱能力比野生型明顯增強。作為多酚氧化酶家族的漆酶還能夠使酚類化合物聚合,參與對傷害的防御反應(yīng),使植物免受昆蟲和病原體的侵襲。擬南芥中漆酶基因家族共有17個成員。McCaig等運用構(gòu)建系統(tǒng)進化樹等生物信息學(xué)方法將此17個基因歸類至6個漆酶亞家族中。關(guān)于漆酶家族成員生物學(xué)功能的研究則報道較少。Zhou和Berthet等對擬南芥的研究發(fā)現(xiàn),AtLAC4可能在木質(zhì)素及植物次生壁合成過程中起重要作用。但是其在植物生長發(fā)育中的具體生物學(xué)功能尚不十分清楚,需要更多的實驗數(shù)據(jù)來闡明。本文主要以過量表達AtLAC4植株和AtLAC4啟動子與β-glucuronidase(GUS)報告基因融合表達植株為材料,研究在植物生長發(fā)育過程中和響應(yīng)外界環(huán)境時該基因的功能,為AtLAC4基因及植物漆酶基因家族的功能研究提供證據(jù)。1.1植物材料與處理擬南芥種子先經(jīng)70%乙醇表面消毒30秒,之后加入10%次氯酸鈉消毒10分鐘,無菌水沖洗4–5次后均勻播種于MS平板上。4°C保濕黑暗冷藏3天打破休眠,之后移至擬南芥培養(yǎng)室中培養(yǎng)。10天后移至土壤中生長,培養(yǎng)溫度為(22±2)°C,光暗周期為16小時光照/8小時黑暗,光照強度為120–150μmol·m–2·s–1。取MS培養(yǎng)基上生長14天的野生型擬南芥,分別用無菌水、100μmol·L–1赤霉素、100μmol·L–1萘乙酸、100μmol·L–1脫落酸、1mmol·L–1水楊酸、30mmol·L–1蔗糖、15%聚乙二醇、5μmol·L–1CuSO4以及4°C處理3個小時,然后取樣,用于提取RNA進行基因表達檢測。以野生型為對照,觀察各轉(zhuǎn)基因植株及突變體在不同生長發(fā)育時期的生長狀況,拍照并測定相關(guān)數(shù)據(jù)。種子萌發(fā)以胚根突破種皮為標(biāo)準(zhǔn).葉柄長度統(tǒng)計時,分別取16株野生型35S:AtLAC4植株的第5–10片蓮座葉進行測定。取生長20天左右的野生型和過量表達植物進行干旱脅迫處理,連續(xù)處理10天和20天后進行表型觀察。所有表型分析實驗均在相同條件下重復(fù)進行3次。利用引物5′AGTTCTAGAATGGGGTCTCATATGGTTTG-3′和5′-ATTGGATCCTTAGCACTTGGGAAGATC-3′將AtLAC4基因的CDS連接到T載體上;測序正確后,利用XbaI和BamHI將CDS連接到植物過量表達載體中。分別以pCAMB-IA1303和改造過的pCAMBIA1390質(zhì)粒為對照,用連接成功的植物表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404,并用花粉管浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥,潮霉素篩選轉(zhuǎn)基因植株并進行PCR檢測,選取單位點插入的純合轉(zhuǎn)基因株系用于后續(xù)實驗。1.4GUS組織化學(xué)染色在含有1mmol·L–1EDTA、0.1%TritonX-100、100μg·mL–1氯霉素、2mmol·L–1鐵氰化鉀和2mmol·L–1亞鐵氰化鉀的50mmol·L–1磷酸緩沖液(pH7.0)中,加入100mg·mL–1X-Gluc母液(N,N-二甲基甲酰胺溶解),使X-Gluc終濃度為1mg·mL–1。取幼苗或組織剪成小塊置于1mL配制好的上述染色液中,37°C溫育12小時,期間搖動數(shù)次,70%乙醇脫色至透明。2結(jié)果與分析

2.1AtLAC4的時空表達結(jié)果表明,AtLAC4基因啟動子驅(qū)動GUS可以在萌發(fā)3天種子的子葉和胚根(圖1A)、萌發(fā)5天幼苗的根維管束(圖1B)、10天幼苗的子葉葉脈(圖1C)、45天植株花器官中的萼片、雌蕊柱頭、雄蕊花絲以及角果與果柄連接處(圖1J,K)等明顯表達,且AtLAC4在以上部位的表達模式與Berthet等(2011)的研究結(jié)果基本一致。此外,AtLAC4基因啟動子驅(qū)動GUS在植物的莖尖(圖1I)、根與花序軸的維管組織(圖1E,G)、下胚軸與根的連接處以及根的維管組織中(圖1F)也有非常強的表達,并在真葉(圖1D)和蓮座葉葉緣排水器(圖1H)中有非常特異的表達。(A),(B)分別為3天和5天的幼苗;(C)10天幼苗的子葉;(D)10天幼苗真葉葉緣排水器;(E)花序軸維管組織;(F),(G)根維管組織;(H)蓮座葉葉緣排水器;(I)莖尖;(J)幼嫩的角果;(K)花器官。2.2AtLAC4過量表達引起植株變小我們利用轉(zhuǎn)基因方法共獲得24個AtLAC4過量表達轉(zhuǎn)基因株系,并選取其中潮霉素篩選過程中幼苗黃綠比符合1:3并且純合的2個轉(zhuǎn)基因株系進行后續(xù)的功能分析。首先,我們對篩選的純合35S:AtLAC4轉(zhuǎn)基因植株進行AtLAC4基因表達水平檢測。RT-PCR結(jié)果(圖2B)表明,轉(zhuǎn)基因植株中AtLAC4基因表達水平明顯升高。表型分析發(fā)現(xiàn),與野生型擬南芥相比,AtLAC4過量表達會引起植株變小。(A)35天和40天的35S:AtLAC4轉(zhuǎn)基因植株的表型,其中40天為去除花莖的植株(1)在由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)化為生殖生長的過程中,特別是在抽薹后(30–40天),AtLAC4過量表達植株的花莖比野生型伸長得慢,蓮座葉的直徑明顯小于野生型(圖2A);(2)40天的植株去除花莖后,AtLAC4過量表達植株各蓮座葉所形成的蓮座大小明顯小于野生型(圖2A)。2.3AtLAC4過量表達植株木質(zhì)素相對含量增多在AtLAC4過量表達植株變小的同時,我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的葉片硬度比野生型的要大。已有的研究表明,漆酶基因可能與木質(zhì)素的合成有關(guān)。因此我們推測,AtLAC4過量表達植株葉片變硬可能與木質(zhì)素的含量增加有關(guān)。木質(zhì)素是一種復(fù)雜的酚類聚合物主要存在于植物木質(zhì)組織中的次生壁上。在鹽酸存在的情況下,木質(zhì)素可與間苯三酚聚合形成一種紫紅色化合物。染色愈深且染色細(xì)胞愈多說明木質(zhì)素含量越高.取40天的野生型和35S:AtLAC4擬南芥的花序軸靠近基部一節(jié)的相同部位,進行徒手切片,然后以鹽酸為介質(zhì)分別對其進行間苯三酚染色。2.4非生物脅迫和激素對AtLAC4表達的影響首先,我們對AtLAC4基因的啟動子區(qū)域進行了生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其啟動子區(qū)域含有大量與植物激素以及非生物脅迫相關(guān)的順式作用元件。我們推測AtLAC4可能與激素及其它非生物脅迫相關(guān),并進一步考察了相關(guān)激素及非生物脅迫對AtLAC4表達的影響。選取在MS培養(yǎng)基上生長14天的擬南芥幼苗,經(jīng)GA3、NAA、ABA、SA、蔗糖(Suc)、聚乙二醇(PEG)和CuSO4等各種激素和非生物脅迫因素處理3小時,利用RT-PCR檢測AtLAC4基因的表達情況。結(jié)果表明,與對照相比,ABA和SA能夠促進AtLAC4的表達,而蔗糖、低溫和Cu2+則抑制其表達(圖4)。其中ABA對AtLAC4基因表達的誘導(dǎo)作用最為明顯,ABA處理組AtLAC4的表達量與對照相比增加了3倍多(圖4B),表明AtLAC4基因可能在響應(yīng)ABA信號過程中起作用。圖4外界因素與激素對AtLAC4表達的影響(A)RT-PCR電泳檢測(4°C(無菌水),CuSO4(5μmol·L–1));(B)RT-PCR結(jié)果的量化,比值=目的帶吸光度峰值/Actin吸光度峰值。CK:對照(無菌水);GA:赤霉(100μmol·L–1);NAA:萘乙酸(100μmol·L–1);ABA:脫落酸(100μmol·L–1);SA:水楊酸(1mmol·L–1);Suc:蔗糖(30mmol·L–1);PEG:15%聚乙二醇在含有ABA的培養(yǎng)基上萌發(fā)4天后,野生型種子的萌發(fā)率可達40%,而AtLAC4過量表達植株種子的萌發(fā)率僅為8%(圖5B)。到萌發(fā)12天時,雖然二者的萌發(fā)率已基本相近,但是AtLAC4過量表達植株的胚根生長明顯受到抑制(圖5A)。以上結(jié)果表明,AtLAC4過量表達植株對外源ABA的敏感性增加,進一步說明At-LAC4基因可能在植物響應(yīng)ABA過程中起一定作用。2.6AtLAC4過量表達植株耐旱能力增強一般來說,對ABA敏感的植物往往耐旱能力較強。為了進一步研究AtLAC4過量表達植株對ABA敏感性的增加是否通過ABA信號途徑增強了植物的耐旱能力,我們分析了AtLAC4過量表達植株在干旱條件下與野生型植株的差異.結(jié)果發(fā)現(xiàn),生長20天的植株經(jīng)過干旱處理10天后,AtLAC4過量表達植株的表型與野生型相比差別更加明顯,過量表達植株的蓮座葉明顯變小,葉柄變短(圖6A,B),可能是因為干旱脅迫誘導(dǎo)ABA合成后,ABA進一步上調(diào)了AtLAC4基因的表達量,從而引起木質(zhì)素的含量增加,導(dǎo)致過量表達植株的表型更加明顯。當(dāng)干旱脅迫處理第20天時,相同生長時期的野生型擬南芥基本上已經(jīng)全部萎蔫,而AtLAC4過量表達植株仍然能夠正常生長(圖6C),表明AtLAC4過量表達植株的耐旱能力比野生型明顯增強。3討論

3.1AtLAC4參與植物木質(zhì)素的合成植物的維管組織起源于原形成層細(xì)胞,這些細(xì)胞來源于植物的頂端分生組織。木質(zhì)素是維管組織細(xì)胞次生壁的重要組分,主要存在于次生細(xì)胞壁中,影響維管的厚度和硬度。木質(zhì)素含量越高,細(xì)胞的次生壁也越厚,其含量的高低對植物維管系統(tǒng)的發(fā)育起重要決定作用。AtLAC4基因在莖、葉柄、根以及胚軸維管組織中的表達非常明顯,并且在莖尖頂端分生組織處有非常強烈的表達,這些表達部位與維管組織的起始和發(fā)育部位十分一致,表明AtLAC4可能在維管系統(tǒng)的發(fā)育過程中起重要作用。在我們的研究中,采用間苯三酚對花序軸橫切面進行染色,發(fā)現(xiàn)At-LAC4過量表達植株的木質(zhì)化細(xì)胞與野生型相比明顯增多,木質(zhì)素含量明顯升高且次生壁明顯加厚.以上研究結(jié)果表明,AtLAC4在調(diào)控木質(zhì)素的合成過程中確實起著重要作用3.2AtLAC4與外源激素及非生物脅迫的關(guān)系對漆酶家族啟動子順式作用元件的生物信息學(xué)分析表明,AtLAC4的啟動子中ABA應(yīng)答元件的數(shù)目最多。我們通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),ABA能使AtLAC4表達明顯增強(圖4)。因此,我們研究了ABA對AtLAC4轉(zhuǎn)基因植株種子萌發(fā)的影響,結(jié)果表明,AtLAC4過量表達植株種子的萌發(fā)受到明顯抑制且對ABA的敏感性增強(圖5)。其原因可能是在35S:AtLAC4轉(zhuǎn)基因植株中,AtLAC4的過量表達增強了ABA對種子休眠的作用。根據(jù)AtLAC4啟動子驅(qū)動GUS時空表達的結(jié)果來看,其在葉緣排水器及根部維管組織中有較強的表達,說明AtLAC4可能與植物的抗旱性有關(guān)。我們進一步對野生型及AtLAC4過量表達植株進行干旱處理,結(jié)果表明AtLAC4過量表達植株的耐干旱能力明顯增強(圖6)。我們還發(fā)現(xiàn)干旱處理后AtLAC4過量表達植株與野生型的差異更加明顯(圖6),表明干旱可能促進ABA的合成,進而促進AtLAC4的表達。過量表達植株中AtLAC4表達顯著增強,從而導(dǎo)致植株更加矮小。AtLAC4過量表達植株的木質(zhì)素含量升高可能導(dǎo)致維管組織發(fā)育模式的改變,從而影響了植物對水分以及植物激素(如ABA)的運輸能力,導(dǎo)致過量表達植株對A