分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)流程及相關(guān)試劑、儀器概述分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)概述生物樣品（細(xì)胞、組織、細(xì)菌）細(xì)胞調(diào)節(jié)神經(jīng)科學(xué)分子診斷DNA分離RNA分離質(zhì)粒DNA噬菌體DNA基因組DNA總RNAmRNAcDNA重組DNAPCR遺傳鑒定DNA測序DNA標(biāo)記突變基因表達(dá)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)概述（續(xù)）基因表達(dá)報(bào)告基因載體基因轉(zhuǎn)化報(bào)告基因檢測真核轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄翻譯蛋白蛋白分析蛋白分離分子生物學(xué)主要實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)起始材料的選取和準(zhǔn)備mRNA的提取、純化目標(biāo)片段的克隆和分析DNA、RNA的提取、純化和分析克隆化基因的表達(dá)及表達(dá)蛋白的純化和功能分析基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)及轉(zhuǎn)基因結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)起始材料的選取和準(zhǔn)備常規(guī)材料組織器官原生質(zhì)體\細(xì)胞細(xì)菌\真菌\酵母特殊材料少量起始材料特殊病變組織亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)起始材料的選取和準(zhǔn)備水稻卵細(xì)胞的分離分離準(zhǔn)備工作材料的速凍長期保存人工氣候箱、制冰機(jī)超凈工作臺(tái)、顯微操作系統(tǒng)RNase-free耗材、液氮罐超低溫冰箱RNase抑制劑卵細(xì)胞mRNA的提取、純化Oligotex系列試劑盒細(xì)胞裂解勻漿去蛋白和細(xì)胞殘?jiān)鼫卦〔⒔Y(jié)合洗脫去鹽和回收旋渦混勻器離心機(jī)恒溫水浴鍋離心機(jī)、旋渦混勻器200℃烘箱DEPC、RNase-freeDNaseI、RNase-free耗材目標(biāo)片段的克隆和分析利用SMARTcDNA文庫構(gòu)建試劑盒構(gòu)建水稻卵細(xì)胞cDNA文庫目標(biāo)基因的獲得通過噬菌體載體自切割或T-Vector、平末端載體克隆獲得目標(biāo)質(zhì)粒利用測序儀和通用引物對克隆的目的基因測序通過SMART技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫第一鏈的合成第二鏈的合成和擴(kuò)增酶切、純化和片段分離cDNA檢測插入載體并包裝文庫質(zhì)量檢測文庫擴(kuò)增及保藏恒溫水浴鍋、制冰機(jī)RTase、RNase抑制劑PCR儀高保真Taq酶恒溫水浴鍋、離心機(jī)限制性內(nèi)切酶、過濾柱電泳儀器、凝膠成像系統(tǒng)瓊脂糖恒溫水浴鍋超凈工作臺(tái)、烘箱、PCR儀培養(yǎng)基超低溫冰箱DMSO目標(biāo)基因的克隆利用特異探針，通過核酸雜交的方法或利用特異的抗體，通過抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)行文庫目標(biāo)基因的篩選利用GSP（基因特異引物）通過PCR擴(kuò)增出目標(biāo)基因通過5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的目標(biāo)基因通過核酸酸雜交和和免疫反反應(yīng)篩庫庫將培養(yǎng)于于平板的的噬菌斑斑通過印印跡轉(zhuǎn)于于尼龍膜膜，并于于核酸交交聯(lián)儀中中固定。。在雜交交箱中利利用特定定探針雜雜交。最最后在恒恒溫?fù)u床床中洗膜膜（探針針標(biāo)記：：放射性性和非放放射性））將噬菌體培養(yǎng)養(yǎng)于平板，于于42℃培養(yǎng)幾小時(shí)時(shí)后，于37℃用IPTG誘導(dǎo)融合合蛋白的表達(dá)達(dá)并印記于尼尼龍膜上，利利用抗原-抗抗體反應(yīng)進(jìn)行行雜交利用PCR技技術(shù)獲得目標(biāo)標(biāo)基因利用GSP，，以文庫為模模板通過PCR擴(kuò)增出目目標(biāo)基因，并并通過電泳、、凝膠成像系系統(tǒng)檢測利用文庫載體體序列和已知知的目標(biāo)基因因的序列設(shè)計(jì)計(jì)通用引物和和GSP，通通過5’RACE和3’’RACE擴(kuò)擴(kuò)增出目標(biāo)基基因的5’和和3’端序列列。并通過電電泳、凝膠成成像系統(tǒng)檢測測DNA、RNA的提取、、純化和分析析包含有目標(biāo)基基因的質(zhì)粒的的獲得水稻基因組DNA的提取取、純化和分分析水稻各器官TotalRNA的提提取、純化和和分析包含有目標(biāo)基基因的質(zhì)粒的的獲得對于通過篩庫庫技術(shù)獲得的的目標(biāo)基因通過噬菌體載載體的自切割割作用生成目目標(biāo)質(zhì)粒對于通過PCR技術(shù)獲得得的目標(biāo)基因因通過回收純化化后利用T載載體等克隆并并轉(zhuǎn)化細(xì)菌鋪板培養(yǎng)后通通過藍(lán)白斑，，原位裂解雜雜交分離出含含有目標(biāo)質(zhì)粒粒的單個(gè)菌落落對于通過PCR技術(shù)獲得得的目標(biāo)基因因PCR或RACE電泳凝膠成像系統(tǒng)長波紫外觀察箱切膠膠回收試劑盒T載體、平末端載體轉(zhuǎn)化細(xì)菌并鋪板培養(yǎng)篩選目標(biāo)菌落提取目標(biāo)質(zhì)粒對于通過PCR技術(shù)獲得得的目標(biāo)基因因PCR或RACE瓊脂水平電泳泳凝膠成像系統(tǒng)統(tǒng)、手提紫外外燈長波紫外觀察察箱PCR回收試試劑盒膠回收試劑盒盒PCR儀電泳儀器恒溫水浴鍋、、離心機(jī)Taq酶、薄薄壁管、礦物物油瓊脂糖對于通過PCR技術(shù)獲得得的目標(biāo)基因因（續(xù)）純化產(chǎn)物PCR產(chǎn)物測測序T載體、平末末端載體連接接細(xì)菌轉(zhuǎn)化、鋪鋪板培養(yǎng)藍(lán)白斑篩選、、菌落原位雜雜交質(zhì)粒提取、酶酶切分析、測測序測序儀低溫冰箱雜交箱、恒溫溫?fù)u床、低溫溫冰箱超凈工作臺(tái)、、電轉(zhuǎn)化儀離心機(jī)、恒溫溫水浴鍋感受態(tài)細(xì)胞、、培養(yǎng)基、抗生素X-gal、、IPTG、、尼龍膜和探針針限制性內(nèi)切酶酶質(zhì)粒提取、分分析常規(guī)質(zhì)粒提取取方法：通過過細(xì)菌的適當(dāng)當(dāng)裂解釋放出出質(zhì)粒，利用用酚和氯仿抽抽提掉蛋白，，再利用無水水乙醇沉淀質(zhì)質(zhì)粒DNA質(zhì)粒提取試劑劑盒：裂解方方法一致。裂裂解完成后利利用過濾柱純純化出質(zhì)粒DNA質(zhì)粒提取后，，根據(jù)以后實(shí)實(shí)驗(yàn)要求利用用不同的限制制性內(nèi)切酶在在水浴鍋中進(jìn)進(jìn)行酶切電泳，用凝膠膠成像系統(tǒng)分分析測序水稻基因組DNA的提取取、

純化和和分析利用SDS法法或Qiagen提供的的基因組提取取試劑盒提取取水稻基因組組DNA：利利用SDS在在高鉀離子濃濃度的情況下下能沉淀蛋白白和多糖等雜雜質(zhì)的原理提提取基因組DNA利用酚-氯仿仿抽提或過濾濾柱純化基因因組DNA水稻基因組文文庫的構(gòu)建利用特異的探探針，通過Southernblotting檢測目標(biāo)標(biāo)基因的拷貝貝數(shù)水稻各器官TotalRNA的提提取、純化和和分析分離所需的水水稻各器官組組織，并利用用Qiagen的RNeasy系列列試劑盒提取取總RNA：：將材料裂解解后，通過過過濾柱純化出出總RNA在RNase-free的情況下，，通過甲醛變變性膠電泳檢檢測總RNA的質(zhì)量利用特異性的的探針，通過過Northernblotting檢測目目標(biāo)基因在各各器官的表達(dá)達(dá)情況Southernblotting和NorthernblottingSouthernblotting基因組DNA完全消化探針制備瓊脂水平電泳泳比活性測定印跡轉(zhuǎn)膜DNA交聯(lián)限制性內(nèi)切酶酶、恒溫水浴浴鍋手提紫外燈、、電泳儀器真空轉(zhuǎn)膜儀紫外交聯(lián)儀同位素檢測儀儀探針制備試劑劑盒尼龍膜Southernblotting和Northernblotting（（續(xù)）制備好的尼龍龍膜探針（放射性性或非放射性性）雜交雜交箱放射自顯影熒光同位素檢測儀儀磷屏成像系統(tǒng)統(tǒng)熒光掃描成像系統(tǒng)克隆化基因的的表達(dá)及表達(dá)達(dá)蛋白的純化化和功能分析析克隆化基因的的表達(dá)表達(dá)蛋白的純純化功能分析克隆化基因的的表達(dá)基因的克?。海豪酶弑Ｕ嬲娴腡aq酶酶和合適的反反應(yīng)系統(tǒng)，通通過PCR獲獲得與目標(biāo)基基因完全一致致的DNA片片段（通過測測序確證）體內(nèi)表達(dá)：選選擇合適的表表達(dá)載體插入入目標(biāo)片段。。利用化學(xué)方方法或電轉(zhuǎn)化化儀等手段轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入細(xì)胞表達(dá)達(dá)體外轉(zhuǎn)錄和翻翻譯系統(tǒng)：兔兔網(wǎng)織紅細(xì)胞胞裂解物、小小麥胚芽提取取物等表達(dá)蛋白的純純化SDS聚丙烯烯酰胺膠回收收：利用SDS聚丙烯酰酰胺膠分離不不同大小的的的蛋白。利用6×HIS、GST（谷胱甘甘肽）等和親親和樹脂純化化：通過表達(dá)達(dá)目標(biāo)基因的的融合蛋白，，利用親和層層析洗脫出目目標(biāo)蛋白自動(dòng)核酸/蛋蛋白純化工作作站目標(biāo)蛋白功能能分析抗體的制備：：多抗、單抗抗DNA-蛋白白質(zhì)相互作用用研究：Gel-shift實(shí)驗(yàn)、、蛋白質(zhì)磷酸酸化分析、酵酵母單雜交系系統(tǒng)等蛋白質(zhì)-蛋白白質(zhì)相互作用用研究：酵母母雙雜交系統(tǒng)統(tǒng)、噬菌體表表面展示技術(shù)術(shù)等蛋白體內(nèi)表達(dá)達(dá)研究Westernblotting：利用抗原原-抗體反應(yīng)應(yīng)，對蛋白質(zhì)質(zhì)混合物中的的目標(biāo)蛋白進(jìn)進(jìn)行鑒別和定定量免疫組織化學(xué)學(xué)研究：通過過切片技術(shù)和和免疫反應(yīng)，，利用特異抗抗體檢測特定定蛋白在組織織細(xì)胞內(nèi)的表表達(dá)和定位蛋白質(zhì)芯片系系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因結(jié)結(jié)果分析轉(zhuǎn)基因載體的的構(gòu)建：載體體、農(nóng)桿菌、、特殊抗生素素植株的轉(zhuǎn)化：：葉盤轉(zhuǎn)化法法、基因槍植株的篩選：：熒光檢測、、GUS染色色、PCR法法基因功功能分分析：：激光光共聚聚焦顯顯微鏡鏡、FISH等等部分分分子生生物學(xué)學(xué)