肺結(jié)核實(shí)驗(yàn)室診斷(馬小玲)課件

結(jié)核分枝桿菌的試驗(yàn)室診斷安徽省立醫(yī)院檢驗(yàn)科馬筱玲1結(jié)核疫情及診斷進(jìn)展

2黛玉臉色蒼白，瘦骨嶙峋，經(jīng)不斷

咳嗽及吐血后，香消玉殞，結(jié)束了一場(chǎng)哀怨凄絕的愛情故事。3

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室

診斷方法介紹5概述結(jié)核病人的細(xì)菌學(xué)檢查不僅是發(fā)現(xiàn)傳染源的主要途徑和手段，也是結(jié)核病確診和制訂抗癆方案，考核療效、評(píng)價(jià)治療效果的可靠標(biāo)準(zhǔn)。由于結(jié)核菌的遺傳特性決定其生長周期長，致使常規(guī)細(xì)菌學(xué)檢查方法存在著靈敏度低、操作復(fù)雜，需時(shí)間較長和影響因素較多，不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺陷，使細(xì)菌學(xué)診斷發(fā)展緩慢，無法充分滿足臨床診斷的需要。6實(shí)驗(yàn)室診斷方法病原學(xué)診斷輔助診斷

7病原學(xué)診斷一、涂片抗酸染色鏡檢法，二、液基夾層杯結(jié)核桿菌檢驗(yàn)三、熒光染色法四、培養(yǎng)法五、液體培養(yǎng)＋顯微鏡觀察藥敏試驗(yàn)六、快速培養(yǎng)檢測(cè)法，七、色譜法八、分子生物學(xué)法

九、噬菌體生物擴(kuò)增法8涂片優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、價(jià)廉

10痰菌假陰性原因病變是封閉或開放；病變性質(zhì)和其中能夠排出的菌量和排出時(shí)間間歇；結(jié)核分枝桿菌形態(tài)多樣性；12優(yōu)點(diǎn)：1、操作方便，易于掌握。2、片中結(jié)核菌分布均勻，染色效果清晰3、液基結(jié)核菌制片技術(shù)較離心濃縮集菌法有顯著提高：該方法將所有消化后標(biāo)本的抗酸桿菌均完整地保留于液基薄片中，從而顯著提高了檢出率。4、安全性有所提高：消化，制片，烤片，染色均在彭氏杯中完成，操作人員不直接接觸標(biāo)本。采用結(jié)核專用消化液，可有效殺滅結(jié)核分支桿菌，更好的提高了操作的安全性。14三、熒光染色法：是涂片法中陽性率較高，較快速的方法，集菌與熒光染色相結(jié)合，則熒光顯微鏡下的抗酸桿菌陽性率可達(dá)50%，熒光法的缺點(diǎn)：假陽性率較高，保存時(shí)間短，不到4個(gè)月15四、培養(yǎng)法一般都用改良羅氏固體培養(yǎng)基接種后第3第7天觀察，以后每周觀察一次菌落生長情況，第8周若仍無生長，報(bào)告為陰性。優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確，靈敏度略高于涂片法；可以鑒定死菌與活菌；可進(jìn)一步進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn).缺點(diǎn)：診斷周期長，最快也需要6周。有一定的污染率1617培養(yǎng)假陰性的原因個(gè)別細(xì)菌營養(yǎng)要求的特異性；細(xì)菌和細(xì)菌營養(yǎng)代謝異質(zhì)性；細(xì)菌培養(yǎng)前處理對(duì)細(xì)菌活性影響；18檢測(cè)方法1．菌懸液的制備2.接種及培養(yǎng)3.結(jié)果判定與報(bào)告敏感（一）：含藥培養(yǎng)基上無菌落生長。報(bào)告菌落數(shù)：當(dāng)含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)在20個(gè)以下時(shí)，報(bào)告菌落個(gè)數(shù)。耐藥（1+）：含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積1/4；耐藥（2+）：含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積1/2；耐藥（3+）：含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)約占斜面面積3/4；耐藥(4+)：含藥培養(yǎng)基上菌落呈菌苔樣生長。20

本法弊端

操作繁瑣需時(shí)久，4周結(jié)果準(zhǔn)確性差21

液體培養(yǎng)

+

顯微鏡觀察23結(jié)論本試劑檢測(cè)簡(jiǎn)便，快速，3天就可獲得多耐藥結(jié)核桿菌的檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)具有較高的敏感性和特異性，與常規(guī)方法符合率較高，可用于多耐藥結(jié)核病的快速檢測(cè)。痰標(biāo)本直接藥敏試驗(yàn)比常規(guī)方法提早6～8周，更具有快速診斷價(jià)值。本試劑費(fèi)用低廉，不需特殊儀器設(shè)備，適合基層推廣應(yīng)用。本法安全、對(duì)預(yù)防耐藥結(jié)核病的流行與傳播、防止實(shí)驗(yàn)室工作人員的感染具有重要意義。241.BDBACTECMGIT960培養(yǎng)系統(tǒng)

基本原理

培養(yǎng)瓶底部含有包被于樹脂上的熒光顯示劑，由于該顯示劑為氧抑制性，當(dāng)分支桿菌生長使氧消耗后，熒光顯示劑被激活，而發(fā)出熒光。檢測(cè)儀測(cè)試熒光強(qiáng)度，并判定結(jié)果。優(yōu)點(diǎn)：快速7-14天培養(yǎng)陽性

簡(jiǎn)便比常規(guī)法操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)陽性率高于L-J法缺點(diǎn)：無法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于L-J法，產(chǎn)品依賴進(jìn)口，價(jià)格較貴262．BacTALERT3D培養(yǎng)系統(tǒng)原理：該系統(tǒng)采用產(chǎn)色檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)系統(tǒng)中分支桿菌生長情況。因其所用的培養(yǎng)瓶底部有顏色感應(yīng)器，當(dāng)培養(yǎng)瓶中有細(xì)菌生長，C02產(chǎn)生、pH下降時(shí)，顏色感應(yīng)器由綠色變成黃色。儀器自動(dòng)連續(xù)檢測(cè)，檢測(cè)的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)，根據(jù)計(jì)算結(jié)果自動(dòng)顯示培養(yǎng)瓶中有無分支桿菌生長。優(yōu)點(diǎn)：快速7-14天培養(yǎng)陽性

簡(jiǎn)便比常規(guī)法操作簡(jiǎn)便，培養(yǎng)陽性率高于L-J法缺點(diǎn)：無法觀察菌落形態(tài)，污染率略高于L-J法，產(chǎn)品依賴進(jìn)口，價(jià)格較貴。27七、色譜法

分為氣相色譜(GC)、氣液相色譜、高效液相色譜(HPLC)等GC等能檢測(cè)分枝桿菌代謝過程中的揮發(fā)性物質(zhì)如脂肪酸所產(chǎn)生的CO2含量，出現(xiàn)不同的色譜峰，從而可鑒定結(jié)核桿菌和大部分NTM菌種，且可測(cè)藥敏。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、快速、定量、重復(fù)性好，GC與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用更好；缺點(diǎn)：儀器昂貴，維護(hù)不易，無法普及。

281、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)：PCR能快速擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌DNA，PCR檢測(cè)假陽性和假陰性問題是影響其應(yīng)用的關(guān)鍵問題。對(duì)于存在的問題對(duì)策如下：擴(kuò)增產(chǎn)物特異性鑒定－探針雜交高質(zhì)量試劑（建立國家級(jí)檢定考評(píng)）規(guī)范化操作（培訓(xùn)操作人員）質(zhì)量控制（標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室）302、核酸探針(DNA-probe)DNA探針是一小段帶標(biāo)記而能識(shí)別特異性核苷酸序列的單鏈分子。3、染色體核酸指紋法：有多種方法，如限制性內(nèi)切酶圖譜(REA)和限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)分析等，RFLP用于菌株菌種鑒定和流行病學(xué)調(diào)查研究。314、16s～23srDNA(rRNA)序列法用于分枝桿菌的菌種鑒定，差不多所有種的分枝桿菌都可鑒定出來。5、耐藥基因的檢則：已查出的結(jié)核桿菌耐藥基因有rpoB(對(duì)利福平)，Kat、inhA、ahpC(對(duì)異煙肼)，embl(對(duì)乙胺丁醇)，rpsL、rrs(對(duì)鏈霉素)，pncA(對(duì)吡嗪酰胺)和gyrA(對(duì)氟喹諾酮類，gyrB則為低度耐藥)等。32九、噬菌體生物擴(kuò)增法（PhaB）該法1997建立，并用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性測(cè)定。近年來進(jìn)展很快。33檢測(cè)原理

分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌，并在菌體內(nèi)增殖，裂解菌體，釋放出的子代噬菌體，即可感染隨后加入的指示細(xì)胞（也是一種分枝桿菌），并使指示細(xì)胞裂解，在培養(yǎng)皿上出現(xiàn)噬菌斑。若先將待檢菌株與某種藥物作用一段時(shí)間后在加噬菌體檢測(cè)，并以不加藥管為對(duì)照，根據(jù)含藥管和不含藥管出現(xiàn)的噬菌斑情況即可判斷細(xì)菌的耐藥性。34噬菌體

－病毒核酸衣殼只能在活的易感細(xì)胞內(nèi)生長溶原性感染和溶菌性感染35M.tuberculosiscell特異性噬菌體識(shí)別MTB,并與之結(jié)合36噬菌體DNA進(jìn)入MTB細(xì)胞,并在其內(nèi)擴(kuò)增;同時(shí)生產(chǎn)蛋白外殼,開始產(chǎn)生新的病毒顆粒DNA37添加特異性殺病毒劑去除所有MTB胞外的噬菌體,胞內(nèi)噬菌體不受損傷。38終止殺病毒反應(yīng)，添加非致病性，快生長分枝桿菌（敏感細(xì)胞）39結(jié)核分枝桿菌破裂，釋放噬菌體。40MTB細(xì)胞周圍的敏感細(xì)胞，并在其胞內(nèi)增殖41經(jīng)過多個(gè)“感染—增殖—細(xì)胞消融”循環(huán)，在瓊脂培養(yǎng)基中的菌苔上形成肉眼可見，清晰的噬菌斑4243結(jié)核分枝桿菌殺病毒劑殺滅未感染MTB的噬菌體敏感細(xì)胞敏感細(xì)胞敏感細(xì)胞敏感細(xì)胞MTB裂解,釋放出來的噬菌體感染敏感細(xì)胞噬菌體感染結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生噬菌斑先以特異性噬菌體感染、裂解標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌，再用殺病毒劑清除所有未感染MTB的噬菌體，而結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)的噬菌體繼續(xù)擴(kuò)增，進(jìn)而裂解細(xì)胞，釋放噬菌體。裂解釋放的噬菌體感染隨即添加的敏感細(xì)胞，在其胞內(nèi)擴(kuò)增并裂解敏感細(xì)胞，敏感細(xì)胞菌苔上肉眼可見的噬菌斑。如待檢標(biāo)本不含結(jié)核分枝桿菌，噬菌體被殺病毒劑完全清除，故無噬菌體感染敏感細(xì)胞，敏感細(xì)胞菌苔上無噬菌斑出現(xiàn)。44質(zhì)控

陽性對(duì)照≥20個(gè)噬菌斑

陰性對(duì)照≤10個(gè)噬菌斑結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本

陽性結(jié)果≥20個(gè)噬菌斑

陰性結(jié)果≤19個(gè)噬菌斑陰性：無噬菌斑陽性：可數(shù)噬菌斑陽性：噬菌斑部分融合陽性：噬菌斑完全融合45適用范圍可檢測(cè)痰液、胸水、腹水、腦脊液、尿、骨髓等多種標(biāo)本用于結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)診斷抗癆治療效果的評(píng)價(jià)※尤其是初診病人的鑒別診斷※用于結(jié)核菌耐藥性的快速檢測(cè)用于HIV高危人群的鑒別診斷

FromEngland!46藥敏試驗(yàn)47

M.tbbacillusSensorcellSensorcellSensorcellSensorcellSensorcell指示細(xì)胞指示細(xì)胞指示細(xì)胞指示細(xì)胞指示細(xì)胞l

室溫5分鐘37℃1小時(shí)18-24小時(shí)加入殺毒劑加入培養(yǎng)基和指示細(xì)胞藥物＋細(xì)菌↓24-48小時(shí)加入噬菌體MTBMTB48RFP敏感株結(jié)果

無RIF含RIF49RFP耐藥株結(jié)果

無RIF含RIF50上海市結(jié)核（肺）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

方法評(píng)價(jià)－優(yōu)點(diǎn)快速：24～48小時(shí)比較靈敏：200～300條/ml檢測(cè)活菌：相對(duì)定量：安全：51上海市結(jié)核（肺）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室方法評(píng)價(jià)－缺點(diǎn)操作步驟多影響因素多有假陽性和假陰性

假陰性率10～88％假陽性率2～48％52上海市結(jié)核（肺）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室假陽性和假陰性原因噬菌體的交叉感染－6種NTM檢測(cè)結(jié)果陽性

（偶然、胞內(nèi)、金色、丁酸、恥垢、草分枝）操作因素對(duì)結(jié)果的影響

53輔助診斷一、免疫學(xué)診斷方法二、血清學(xué)診斷三、酶學(xué)診斷54一、免疫學(xué)診斷方法PPD皮試，用于鑒別診斷有參考意義。T細(xì)胞亞群和一些細(xì)胞因子：CD3、CD4/CD8、IL-2(R)、干擾素、腫瘤壞死因子等檢查，以了解細(xì)胞免疫狀態(tài)，或作為考核指標(biāo)前后對(duì)比。55二.血清學(xué)診斷－結(jié)核抗體檢測(cè)(1)結(jié)明試驗(yàn)(MycoDot)，分枝桿菌細(xì)胞壁富含脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，為一種抗原，能誘發(fā)宿主產(chǎn)生相應(yīng)抗體，激發(fā)遲發(fā)超敏反應(yīng)，不提供保護(hù)性免疫。LAM-IgG有試劑盒供應(yīng)，操作方便，敏感性70%左右，特異性90%左右，適用于菌陰肺結(jié)核病和肺外結(jié)核??；菌陰肺結(jié)核病如果證明試驗(yàn)陽性，示有活動(dòng)性，可給予化療。本法20分鐘可出結(jié)果。(2)金免疫斑點(diǎn)滲濾試驗(yàn)(DIGFA，金標(biāo)法)，用H37RvPPD-IgG作為抗原，產(chǎn)生與LAM-IgG同樣結(jié)果，國產(chǎn)、價(jià)格較廉。(3)38KD蛋白質(zhì)抗原，是主要免疫原，用以區(qū)別結(jié)核感染還是NTM感染，正在研究中。56測(cè)定方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）免疫滲濾試驗(yàn)（DIGFA）免疫層析試驗(yàn)（DICA）57

假陽性率15～90％假陰性率5～65％58結(jié)核抗體檢測(cè)臨床應(yīng)用1）輔助診斷結(jié)核病2）作鑒別診斷3）用于療效觀察4）在結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用5）作為器官移植并發(fā)結(jié)核感染的監(jiān)測(cè)指標(biāo)

59結(jié)核抗體檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)：

簡(jiǎn)便、