2022年醫(yī)學(xué)專題-流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry-FCM)描述

流式細(xì)胞術(shù)

（FlowCytometry,FCM)作者(zuòzhě)：笛風(fēng)第一頁，共八十一頁。1、流式細(xì)胞儀(FlowCytometer):是集光電子物理，光電測量，計(jì)算機(jī)，細(xì)胞熒光化學(xué)，單抗技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。2、流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry):利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速流動(dòng)的細(xì)胞或生物顆粒(kēlì)進(jìn)行多參數(shù)、快速（每秒可達(dá)1000-10000個(gè)）的定量分析和分選（純度可達(dá)99%以上）的技術(shù)?；靖拍畹诙?，共八十一頁。流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)(jiégòu)

?激光光源及光束形成系統(tǒng)?流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)?光學(xué)系統(tǒng)：透鏡、濾光片、小孔，聚焦光源，收集不同波長的熒光信號(hào)。?信號(hào)檢測與分析(fēnxī)：光電倍增管（PMT）、補(bǔ)償電路。熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并將信號(hào)放大。?存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)：計(jì)算機(jī)。?細(xì)胞分選系統(tǒng)第三頁，共八十一頁。流式免疫(miǎnyì)分型技術(shù)要點(diǎn)標(biāo)本的獲取和運(yùn)輸(yùnshū)標(biāo)本的制備和染色儀器的校準(zhǔn)和質(zhì)控流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)獲取與儲(chǔ)存第四頁，共八十一頁。FCM的主要測定(cèdìng)指標(biāo)FSC,SSC,FL1,FL2,FL3(FL4)其中(qízhōng)： FSC：反映細(xì)胞的大小 SSC：反映細(xì)胞內(nèi)顆粒性第五頁，共八十一頁。FCM標(biāo)記(biāojì)方法單標(biāo)：一種單抗/tube:FL1,FSC,SSC（三參數(shù)(cānshù)）雙標(biāo)：（兩種單抗/tube）：FL1,FL1,FSC,SSC（四參數(shù)）三/四標(biāo)：（三種單抗/tube）（四種單抗/tube）： FL1-FL3/4,FSC,SSC第六頁，共八十一頁。熒光(yíngguāng)素種類FITC(異硫氰酸熒光(yíngguāng)素）：綠色530nmPE（藻紅蛋白）：橙黃色575nmPerCP(多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色 675nmPI(碘化丙啶）：橙紅色620nm 488nm波長的氬離子激光激發(fā)APC(別藻蘭蛋白）：紅色660nm630nm波長的氦氖激光或紅色二極管激光激發(fā)第七頁，共八十一頁。

PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原(kàngyuán)FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原，適用范圍廣biotin-avidin不適合弱抗原的檢測抗體(kàngtǐ)的選擇第八頁，共八十一頁。數(shù)據(jù)(shùjù)顯示方式單參數(shù)(cānshù)直方圖雙參數(shù)二維點(diǎn)圖等高圖二維密度圖三維圖第九頁，共八十一頁。流式常見(chánɡjiàn)圖形(HistogramPlot)第十頁，共八十一頁。流式細(xì)胞的主要(zhǔyào)信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的標(biāo)記方法(fāngfǎ)是熒光素分子標(biāo)記的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合第十一頁，共八十一頁。流式常見(chánɡjiàn)圖形(HistogramPlot)適用于：單參數(shù)(cānshù)分析第十二頁，共八十一頁。流式常見(chánɡjiàn)圖形(DotPlot)適用(shìyòng)于：多參數(shù)分析第十三頁，共八十一頁。第二節(jié)流式細(xì)胞術(shù)的科研(kēyán)應(yīng)用分析群體細(xì)胞所需時(shí)間(shíjiān)短多參數(shù)分析定性或定量第十四頁，共八十一頁。流式應(yīng)用常見(chánɡjiàn)范圍細(xì)胞(xìbāo)大小細(xì)胞的顆粒度細(xì)胞表面分子：CD系列細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞核內(nèi)分子：P53細(xì)胞功能檢測：細(xì)胞周期、凋亡第十五頁，共八十一頁?？贵w(kàngtǐ)標(biāo)記的方法第十六頁，共八十一頁?？贵w(kàngtǐ)的選擇首選直接標(biāo)記抗體熒光(yíngguāng)分子PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原間接標(biāo)記：適用范圍廣,biotin-avidin不適合弱抗原的檢測第十七頁，共八十一頁。實(shí)驗(yàn)對(duì)照(duìzhào)的設(shè)計(jì)空白對(duì)照：ALL陰性對(duì)照：常用同型抗體對(duì)照單色分析(fēnxī)：設(shè)同型抗體對(duì)照多色分析：同型對(duì)照，單陽性對(duì)照（用于儀器校正）陽性對(duì)照：檢測陰性時(shí)第十八頁，共八十一頁?？瞻讓?duì)照和陰性(yīnxìng)對(duì)照的比較：第十九頁，共八十一頁。實(shí)驗(yàn)(shíyàn)標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：胰酶消化抗體或標(biāo)記分子的染色(rǎnsè)：抗原抗體反應(yīng)非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉封閉：血清和同型抗體第二十頁，共八十一頁。流式檢測應(yīng)用(yìngyòng)實(shí)例凋亡(diāowánɡ)細(xì)胞內(nèi)分子檢測第二十一頁，共八十一頁。凋亡檢測(jiǎncè)-每一步都有檢測(jiǎncè)試劑盒第二十二頁，共八十一頁。細(xì)胞周期G1MG2SQuiescentcellsG0第二十三頁，共八十一頁。細(xì)胞周期不能區(qū)分(qūfēn)凋亡與死亡細(xì)胞

Sub-G0/G1peaks---PIstaining第二十四頁，共八十一頁。Caspases第二十五頁，共八十一頁。AnnexinVAssay建議用于懸浮(xuánfú)細(xì)胞第二十六頁，共八十一頁。AnnexinVAssay能夠區(qū)分死亡(sǐwáng)與凋亡第二十七頁，共八十一頁。流式“TUNEL”第二十八頁，共八十一頁。第二十九頁，共八十一頁。第三十頁，共八十一頁。IntracellularCytokine-Protocol第三十一頁，共八十一頁。第三十二頁，共八十一頁。SORTING（細(xì)胞(xìbāo)分選）第三十三頁，共八十一頁。DIMERXantigenspecificTcellassaymethodformonitoringcellularresponse

第三十四頁，共八十一頁。CBA(CytometricBeadArray)第三十五頁，共八十一頁。TraditionalAnalysis--Percentpositive第三十六頁，共八十一頁。DeterminationoftheCD4PEABConlymphocytes

110100100010000LinearFluorescenceinFL2102103104cellandbeadneglymphFL2;(49,000ABC)MoleculesPEperBead105第三十七頁，共八十一頁。第三節(jié)流式細(xì)胞術(shù)的臨床(línchuánɡ)應(yīng)用白血病免疫分型HLA-B27:強(qiáng)直性脊柱炎淋巴細(xì)胞亞群造血(zàoxuè)干細(xì)胞計(jì)數(shù)：造血(zàoxuè)干細(xì)胞移植網(wǎng)織紅細(xì)胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗(yàn)第三十八頁，共八十一頁。流式細(xì)胞白血病免疫(miǎnyì)分型第三十九頁，共八十一頁。流式細(xì)胞的免疫(miǎnyì)分型是白血病分型的重要指標(biāo)FAB標(biāo)準(zhǔn)，形態(tài)學(xué)和免疫表型結(jié)合(jiéhé)適合于白血病的分型診斷，但不適合用于確診是不是白血病。Minimalresidualdiseases(MRD)第四十頁，共八十一頁。FCM應(yīng)用(yìngyòng)1、細(xì)胞增殖周期測定和DNA倍體分析2、凋亡檢測3、免疫功能的檢測4、血液學(xué)應(yīng)用5、HLA-B27的檢測：用于診斷強(qiáng)直性脊柱炎。6、其他(qítā)：溶液中細(xì)胞因子的測量。7、細(xì)胞分選第四十一頁，共八十一頁。細(xì)胞增殖周期測定(cèdìng)和DNA倍體分析1）細(xì)胞增殖周期：分為G0、G1、S、G2、M期。S期是DNA合成期，在S期內(nèi)，DNA進(jìn)行復(fù)制，使細(xì)胞的DNA含量由2倍體（2C46條染色體）變?yōu)?倍體（4C）。G1和G2期為DNA合成前、后間期，此期無DNA的合成，但RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行合成。M期為有絲分裂期，在此期一個(gè)細(xì)胞分裂為2個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)的92條染色體分裂成2組46條染色體，使每個(gè)細(xì)胞內(nèi)具有46條染色體。在M期分裂成兩個(gè)子細(xì)胞之前，G2和M期細(xì)胞的DNA含量均為恒定的4C。M期以后部分細(xì)胞進(jìn)入(jìnrù)G1期，繼續(xù)進(jìn)行增殖，部分細(xì)胞進(jìn)入(jìnrù)G0期，即靜止期，不再繼續(xù)增殖。因此，F(xiàn)CM分析一個(gè)群體細(xì)胞峰DNA倍體與細(xì)胞周期時(shí)，將DNA含量直方圖分為三部分，即G0/G1,S,G2/M期三個(gè)細(xì)胞峰。G0/G1和G2/M細(xì)胞峰DNA的含量成正態(tài)分布，S期細(xì)胞峰則是一個(gè)加寬的正態(tài)分布。第四十二頁，共八十一頁。2）利用DNA的熒光染料，如PI（Propidiumiodide碘化丙啶），與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合(jiéhé)，可反映細(xì)胞內(nèi)DNA含量。采用DNA直方圖顯示。具有2CDNA含量細(xì)胞為G0/G1期細(xì)胞，4CDNA含量細(xì)胞為G2/M期細(xì)胞，DNA含量介于兩者之間的細(xì)胞為S期細(xì)胞。第四十三頁，共八十一頁。3）DNA倍體：主要比較(bǐjiào)G0/G1期細(xì)胞DNA含量的變化。用DNA指數(shù)（DI）表示。DNA指數(shù)=測量樣本G0/G1期DNA含量/正常人淋巴細(xì)胞G0/G1期DNA含量以正常人淋巴細(xì)胞作為對(duì)照。正常細(xì)胞DNA指數(shù)為1.00，DNA指數(shù)＞1，為超2倍體，＜1為亞2倍體，兩者可統(tǒng)稱為非整倍體。非整倍體細(xì)胞中腫瘤的特異性標(biāo)志，實(shí)體腫瘤中出現(xiàn)頻率較高。第四十四頁，共八十一頁。第四十五頁，共八十一頁。第四十六頁，共八十一頁。第四十七頁，共八十一頁。第四節(jié)凋亡(diāowánɡ)檢測1）FCM-DNA檢測（DNA亞G1峰的檢測）：利用PI染色(rǎnsè)，檢測具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。其原理為在凋亡過程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標(biāo)本制備中的固定處理時(shí)，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。注：檢測的凋亡細(xì)胞數(shù)代表晚期的凋亡細(xì)胞比例，且易受標(biāo)本中的死細(xì)胞和碎片的干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性?？蓞⒖次恼拢?content/cell/20040914791.htm/content/cell/20040914792.htm第四十八頁，共八十一頁。2）DNA鏈損傷“TUNEL”法3）Annexin-V-FITC/PI雙染法4）線粒體細(xì)胞膜電位(diànwèi)的檢測5）凋亡相關(guān)基因的檢測——免疫標(biāo)記法檢測基因第四十九頁，共八十一頁。第五十頁，共八十一頁。第五十一頁，共八十一頁。第五節(jié)免疫功能(gōngnéng)的檢測（1）利用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)PB中淋巴細(xì)胞比例，及淋巴細(xì)胞中T、B、NK細(xì)胞的比例，及T細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測。如CD3+（總T細(xì)胞）；CD19+（總B細(xì)胞），CD3-/（CD16+5（NK細(xì)胞）。3+/CD4+（Th/Ti）：輔助/誘導(dǎo)；CD3+/CD4+/CD5RA+：na?ve輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞；CD3+/CD4+/CD45R0+：記憶性輔助/誘導(dǎo)T細(xì)胞；D3+/CD8+（Ts/Tc）：抑制/殺傷；CD3+/CD8/45RA+：na?ve抑制/殺傷T細(xì)胞；CD3+/CD8+/CD45R0+：記憶性抑制/殺傷T細(xì)胞。胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測：CD4+/IL-4+，Th1細(xì)胞，CD4+/IFN-γ+。（2）臨床應(yīng)用：原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病(jíbìng)、淋巴細(xì)胞增殖病、腫瘤療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測等。第五十二頁，共八十一頁。第六節(jié)FCM在血液學(xué)中的應(yīng)用(yìngyòng)1）白血病和淋巴瘤的免疫分型，目前對(duì)白血病和淋巴瘤的診斷，國際上提出MIC分型，即通過形態(tài)（M）、免疫分型（I）、細(xì)胞遺傳學(xué)（C）檢測，對(duì)白血病和淋巴瘤進(jìn)行綜合診斷，免疫分型是重要的檢測項(xiàng)目之一。現(xiàn)在多應(yīng)用(yìngyòng)多參數(shù)的流式細(xì)胞術(shù)，不同抗體分別被幾種熒光素標(biāo)記：第一熒光（FL1）：FITC（異硫氰酸熒光素，F(xiàn)luoresceinisothiocyanate），F(xiàn)L2：PE（藻紅蛋白，Phycoerythrin）FL3：PerCP（多甲藻黃素葉綠素蛋白，peridininchlorophyllprotein），F(xiàn)L4：APC（別藻蘭蛋白allophycocyanin,）第五十三頁，共八十一頁。2）CD34+造血干/祖細(xì)胞的檢測。主要用于干細(xì)胞移植(yízhí)及基因治療方面的檢測。3）活化血小板及網(wǎng)織血小板的檢測，在栓塞性疾病，如腦血管和心肌梗塞的患者，可出現(xiàn)活化的血小板增多。而血小板減少的患者，如果出現(xiàn)網(wǎng)織血小板增多，則說明血小板減少的原因?yàn)檠“迤茐倪^多所致。第五十四頁，共八十一頁。4）陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）的發(fā)病機(jī)制為X染色體上的PIG-A基因發(fā)生突變，引起(yǐnqǐ)糖化肌醇脂（GPI）錨合成障礙，使GPI錨連蛋白缺乏，已證實(shí)的GPI錨連蛋白有10余種，用于PNH診斷的主要為CD55和CD59兩種，如果在紅細(xì)胞或WBC上出現(xiàn)CD55或/和CD59的減少，可診斷為PNH。第五十五頁，共八十一頁。第五十六頁，共八十一頁。第五十七頁，共八十一頁。5）網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(jìshù)6）白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)第五十八頁，共八十一頁。第七節(jié)其他(qítā)應(yīng)用溶液中細(xì)胞因子的測量:利用吸附有特異性抗體的微球，與溶液中的細(xì)胞因子結(jié)合(jiéhé)，而檢測溶液中是否存在該種因子HLA-B27的檢測：用于診斷強(qiáng)直性脊柱炎。第五十九頁，共八十一頁。第八節(jié)細(xì)胞(xìbāo)分選

FCM可將樣本中所需要的細(xì)胞亞群從群體細(xì)胞中分離出來，即所謂分選(Sorting)。被測細(xì)胞的任何參數(shù)均可作為分選的依據(jù)。分選的方式一般有靜電分選和捕獲管分選，分選方式不同則決定分選的速度，分選純度一般可達(dá)99%以上。除細(xì)胞分選外還可進(jìn)行染色體分選。分選的細(xì)胞可用于克隆化培養(yǎng)(péiyǎng)、原位雜交、分子生物學(xué)研究等。從孕婦外周血中分離富集胎兒有核紅細(xì)胞用于產(chǎn)前診斷，染色體分選可用于基因診斷。第六十頁，共八十一頁。淋巴(línbā)20-25%:T:70%,B:20%,NK:10%;

單核2-6%+粒細(xì)胞:40-60%有核紅:20-25%

正常(zhèngcháng)BM各系細(xì)胞比率第六十一頁，共八十一頁。是白細(xì)胞(xìbāo)（包括血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞(xìbāo)等）在正常分化成熟的不同階段以及活化過程中在這些不同譜系（lineage）細(xì)胞(xìbāo)胞漿或細(xì)胞(xìbāo)膜表面出現(xiàn)或消失的標(biāo)記，參與機(jī)體重要的生理和病理過程。八十年代在WHO和國際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUIS)組織下，將識(shí)別同一分化抗原的來自不同實(shí)驗(yàn)室的單克隆抗體歸為一個(gè)分化群CD:clusterofdifferentiation/clusterdesignation

白細(xì)胞分化抗原第六十二頁，共八十一頁。1.系列交叉(cross-lineage):AML表達(dá)CD2,CD192.表達(dá)不同步(asynchronous):早期與晚期抗原同時(shí)表達(dá)3.表達(dá)量異常(yìcháng)(over-orunder-expression):4.與細(xì)胞大小不匹配(abnormallightscatterprofile):如大CD2+細(xì)胞或小CD13+細(xì)胞AL免疫(miǎnyì)表型特點(diǎn):紊亂表型第六十三頁，共八十一頁。鑒別淋髓系列

區(qū)分亞型

雙表型、雜合型

Mo、M7、AUL

提示細(xì)胞遺傳學(xué)異常

部分與預(yù)后(yùhòu)相關(guān)

MDR監(jiān)測AL免疫(miǎnyì)表型檢測意義第六十四頁，共八十一頁。Gating第六十五頁，共八十一頁。FCM設(shè)門法FSC/SSC:不能將淋巴、單核及幼稚細(xì)胞(xìbāo)區(qū)分開CD45/SSC:CD45是WBC抗原,RBC.PLT為陰性。CD45在成熟細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)，幼稚細(xì)胞表達(dá)弱。在淋巴，單核及粒細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度不同。 優(yōu)點(diǎn)：能將淋巴單核及幼稚細(xì)胞區(qū)分開，特異分析白血病細(xì)胞免疫表型。第六十六頁，共八十一頁。第六十七頁，共八十一頁。正常血細(xì)胞分化發(fā)育過程中免疫標(biāo)志變化特點(diǎn)(tèdiǎn)以及白血病細(xì)胞免疫標(biāo)志特點(diǎn)(tèdiǎn)常用各系血細(xì)胞CD抗原(kàngyuán)1、T系：CD1-CD8（CD6不用）2、B系：CD10,CD19-CD24,FMC73、髓系：CD11b,CD13-CD16,CD33,CD644、干祖：CD34,CD117,CD38,HLA-DR第六十八頁，共八十一頁。正常B細(xì)胞(xìbāo)標(biāo)志CD19CD22TdTCd34CD10CD20FMC7CD23DRI期++++++II期++--+-/++III期++---++IV期++---++++泛B標(biāo)志：CD19,HLA-DR,cCD79a/CD22幼稚B標(biāo)志：CD34,TdT,CD10成熟B標(biāo)志：CD23,FMC7第六十九頁，共八十一頁。B-ALL的分型亞型CD19CD34TdTCD10CylgSmIg急性早期B前體細(xì)胞白血病EarlyB-precursorALL++++--急性前B細(xì)胞白血病PreB-ALL+-/++++-急性B細(xì)胞白血病B-ALL+----/++第七十頁，共八十一頁。正常(zhèngcháng)T細(xì)胞標(biāo)志：根據(jù)在胸腺內(nèi)發(fā)育階段分類CD7CD2CD5CD34CD1aCD3c/mCD4CD8I期+++++/-II期+++-++/-III期+++-++/+++IV期+++--+/++/-+/-泛T:CD2,CD5,CD7,cCD3幼稚T:CD34,TdT,CD1a,CD4/8成熟T:CD3,CD4,CD8第七十一頁，共八十一頁。T-ALL的分類(fēnlèi)分型CD7CD2TdTCD3c/m急性早期T前體細(xì)胞白血病EarlyTprecursorALL+-++/-急性T細(xì)胞白血病T-ALL++-+/+T-ALL特點(diǎn)：1，幼稚T細(xì)胞數(shù)量增多：CD34+,TdT+↑2，泛T標(biāo)志丟失3，CD4/8雙陽或CD4/8單陽第七十二頁，共八十一頁。正常(zhèngcháng)單核細(xì)胞標(biāo)志全單核細(xì)胞標(biāo)志：CD33,CD13,HLA-DR幼稚(yòuzhì)單核細(xì)胞標(biāo)志：CD34,CD117成熟單核細(xì)胞標(biāo)志：CD14,CD64HLA-DRCD33CD13CD34CD117CD14CD64幼稚單+++++--成熟單+++--++第七十三頁，共八十一頁。正常(zhèngcháng)粒細(xì)胞標(biāo)志cMPOCD13CD34CD117HLA-DRCD33CD11bCD15CD64CD10幼稚粒+++++++----成熟粒++---+++++全粒細(xì)胞標(biāo)志：CD13,CD33,Cmpo幼稚粒細(xì)胞標(biāo)志：CD34,CD117,HLA-DR成熟粒細(xì)胞標(biāo)志：CD15,CD11b,CD10,CD64第七十四頁，共八十一頁。成熟(chéngshú)粒、單核細(xì)胞主要區(qū)別成熟(chéngshú)粒細(xì)胞：CD33+HLA-DR-CD14-CD64+dim成熟單核細(xì)胞：CD33++HLA-DR+CD14+CD64++第七十五頁，共八十一頁。干祖細(xì)胞標(biāo)志T祖細(xì)胞B祖細(xì)胞髓祖細(xì)胞CD34+++TdT++-CD117-/+-+HLA-DR+/-++CD38++/-+第七十六頁，共八十一頁。診斷(zhěnduàn)白血病主要標(biāo)志：B-ALL: CD34,HLA-DR,CD19,CD10+/-,cCD79aT-ALL: CD34,CD38,CD7,CD2+/-,CD5+/-,cCD3AML: CD34,CD117,CD33,CD13,cMPO M3:CD34-,HLA-DR- M2:CD19+:t(8,21) M4/M5:CD14+ M6:GlyA+,CD71+ M7:IIb/IIIa(CD41,CD61)+第七十七頁，共八十一頁。雙表型急性白血病診斷(zhěnduàn)的積分系統(tǒng)

(EGIL,1998)分值B系T系髓系2CD79aCD3MPO**cCD22anti-TCRα/βcIgM