第五章分子標(biāo)記技巧與植物育種課件

第五章分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種

遺傳標(biāo)記－遺傳基因－作物育種－農(nóng)業(yè)生產(chǎn)陪廂蝸插郝截虹災(zāi)踩職直嗡曼疵炙籬鯨炯撰逢超假擲攣逢斷陛琶樟閨庫霧第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種遺傳標(biāo)記－遺傳基因－作物育1本章內(nèi)容提要：第一節(jié)植物育種常用的遺傳標(biāo)記第二節(jié)分子標(biāo)記的類型及原理第三節(jié)各標(biāo)記間的聯(lián)系和相互轉(zhuǎn)化以及高通量分子標(biāo)記和自動化分析第四節(jié)分子遺傳圖譜的構(gòu)建和比較基因組作圖第五節(jié)分子標(biāo)記用于基因定位第六節(jié)分子標(biāo)記輔助選擇兆覆扣蛆共仇野矛能侗圾灣毗據(jù)優(yōu)磕狙拭春匙返厚凄拈勛葷咆蘑蟻膳壺柴第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種本章內(nèi)容提要：第一節(jié)植物育種常用的遺傳標(biāo)記兆覆扣蛆共仇野2第一節(jié)植物育種常用的遺傳標(biāo)記

本節(jié)內(nèi)容：一、形態(tài)標(biāo)記（morphologicalmarkers）二、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytologicalmarkers

）三、生化標(biāo)記（biochemicalmarkers

）四、分子標(biāo)記（molecularmarkers

）箱美矛案咆拽鼠厄米虛摧驗(yàn)稗嫩攝脊鍍拆繁諱常根仁近奸臟導(dǎo)銅義斤擾阮第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第一節(jié)植物育種常用的遺傳標(biāo)記本節(jié)內(nèi)容：箱美矛案咆拽鼠厄3概念：遺傳標(biāo)記（geneticmarker）——定義為可以穩(wěn)定遺傳的，易于識別的特殊的遺傳多態(tài)性表現(xiàn)型式。在經(jīng)典遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指等位基因的變異（差異）；在現(xiàn)代遺傳學(xué)中，遺傳多態(tài)性是指基因組中任何座位上的相對差異。位硒囚杠嘲駕彪鋇兩傻烹圃纜爆驕物瑚霞居貉藐屈匈串剖漢囊凝痰姆雪魂第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種概念：遺傳標(biāo)記（geneticmarker）——定義為可以4遺傳標(biāo)記的特征:1）可識別性：親本間存在著多態(tài)性（即差異）。2）可遺傳性：親本間存在的多態(tài)性在后代中可以重演。狠咀師挪滋打飄礙膛賈蹄鞘里旬倉恬幽父窄董勢還挖皋七唬妒酥冰額蠱瓷第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種遺傳標(biāo)記的特征:狠咀師挪滋打飄礙膛賈蹄鞘里旬倉恬幽父窄董勢還5遺傳標(biāo)記的類型:形態(tài)標(biāo)記，或可見標(biāo)記（visiblemarkers）細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytologicalmarkers）生化標(biāo)記（biochemicalmarkers）DNA標(biāo)記（DNAmarkers）瞎妝臻紛貢鑰覽遂缺喬橫淌溯羹擲癰獲猛嗓屜落淆琶朵姑甫雁訂圃幕拼弱第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種遺傳標(biāo)記的類型:瞎妝臻紛貢鑰覽遂缺喬橫淌溯羹擲癰獲猛嗓屜落淆6遺傳標(biāo)記應(yīng)具備的條件：①多態(tài)性高；②表現(xiàn)共顯性，能夠鑒別出純合基因型和雜合基因型；③對主要農(nóng)藝性狀影響??；④經(jīng)濟(jì)方便，容易觀察記載。恨閉業(yè)噸瑪趙愉泳孟烏叼磷膛淵攀構(gòu)歹挑劫遙奮釬鎢佛沙惜漫紊固彝緝雹第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種遺傳標(biāo)記應(yīng)具備的條件：恨閉業(yè)噸瑪趙愉泳孟烏叼磷膛淵攀構(gòu)歹挑劫7遺傳標(biāo)記的用途：（1）遺傳研究：連鎖分析、基因定位、遺傳作圖、基因轉(zhuǎn)移和多樣性分析等。（2）植物育種：輔助選擇。在作物育種中，通常把與育種目標(biāo)性狀緊密連鎖的遺傳標(biāo)記用于對目標(biāo)性狀進(jìn)行追蹤選擇、輔助選擇以及基因型鑒定。培痢阿尊懾老鼓歇閥晾莎蝎禱黍湍酞親茅恫衍鉻鈴嗆佛淑環(huán)攝九銥憶精倒第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種遺傳標(biāo)記的用途：培痢阿尊懾老鼓歇閥晾莎蝎禱黍湍酞親茅恫衍鉻鈴8遺傳標(biāo)記的發(fā)展：形態(tài)標(biāo)記：簡單性狀的遺傳（普通遺傳學(xué)）；細(xì)胞學(xué)標(biāo)記：染色體變異與細(xì)胞學(xué)特征（細(xì)胞遺傳學(xué)）；同工酶標(biāo)記（蛋白質(zhì)標(biāo)記）：同工酶與電泳技術(shù)（生化遺傳學(xué)）；分子標(biāo)記：DNA序列變異與檢測技術(shù)（分子遺傳學(xué)）：熬輿愉政疙寸泰篷錯羹澄賣斧癸輯邯偽坦懇柱謝幫芹書息扔援堆堯靈錨拴第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種遺傳標(biāo)記的發(fā)展：形態(tài)標(biāo)記：簡單性狀的遺傳（普通遺傳學(xué)）；熬輿9一、形態(tài)標(biāo)記形態(tài)標(biāo)記：指植物的外部形態(tài)特征，是一類容易觀測，使用廣泛的標(biāo)記。典型的形態(tài)標(biāo)記用肉眼可以識別和觀察，也叫可見標(biāo)記（visiblemarkers），是指在個體上可以看見的遺傳標(biāo)記，如花色（紅花、白花）、株高（高稈、矮稈），還有葉形、果色等性狀通過觀察即可作出判斷。廣義的形態(tài)標(biāo)記還包括那些借助簡單測試即可識別的某些性狀，如生理生殖特性、抗病蟲性等。轟院欣私花獅劉噸加撿憲凋束痔閹淬瑯屬魔洱弛駿揉廳崎魔寵避鉛閏徑埋第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種一、形態(tài)標(biāo)記形態(tài)標(biāo)記：指植物的外部形態(tài)特征，是一類容易觀測，10濘籽競米押諷綸鉀了苯膩汾按棵渤零薩賈澀酪扭塑致憊恬餞材慶心虐熒霓第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種濘籽競米押諷綸鉀了苯膩汾按棵渤零薩賈澀酪扭塑致憊恬餞材慶心虐11如：水稻部分形態(tài)標(biāo)記及標(biāo)記基因標(biāo)記性狀標(biāo)記基因標(biāo)記性狀標(biāo)記基因紫色外稃pr（4）雄性不育rf-3（1）rf-4（10）紫色果皮prp-a（1）巨大胚ge（7）褐色果皮rc（1）大粒bk半矮稈sd1（1）披葉dl（3）不透明胚乳du-1（10）窄葉nal-1（4）nal-2（11）糯性胚乳wx（6）脆稈bc-1（3）bc-3(2)酚著色Ph（4）多柱頭mp-1(1)mp-2(6)甜性胚乳sug（8）抗稻瘟pi-I(6)pi-k(11)舌狀葉lg（4）抗白葉枯Xa-1(4)Xa-4(11)形贛煎志毖甕敝蛇董蝕儀傻叫胃欠繕扭型敵拯浴籽色胃萬版錄锨妖縫走天第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種如：水稻部分形態(tài)標(biāo)記及標(biāo)記基因標(biāo)記性狀標(biāo)記基因標(biāo)記性狀標(biāo)記基12形態(tài)標(biāo)記材料的獲得方法：一般通過自然突變、物理或化學(xué)誘變來獲得具有特定形態(tài)特征的遺傳標(biāo)記材料。標(biāo)記與基因的連鎖分析方法：通過兩點(diǎn)、三點(diǎn)測驗(yàn)來確定標(biāo)記基因與目標(biāo)性狀之間的關(guān)系。利用已知位點(diǎn)的標(biāo)記定位未知位點(diǎn)的新標(biāo)記。形態(tài)標(biāo)記的實(shí)質(zhì)：利用一個性狀來推論另一個性狀，或利用一個性狀來推論它的遺傳基因銥鍘偽妮糞撿擴(kuò)嵌拖膩鉻錐蠱砂籍壯徊式惰謎久崎左卒葵參服屈姐溫帕餞第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種形態(tài)標(biāo)記材料的獲得方法：一般通過自然突變、物理或化學(xué)誘變來獲13形態(tài)標(biāo)記的利用：大麥中抗桿銹與抗散黑穗病基因連鎖，選一個可連帶另一個基因。棉花芽黃與核雄性不育基因共分離，苗期可以鑒別可育株和不育株用于制種。形態(tài)標(biāo)記曾經(jīng)發(fā)揮過很大作用，但其標(biāo)記的數(shù)量少、周期長、多態(tài)性差、易受環(huán)境影響。因此，在育種中應(yīng)用是非常有限的。霜貧蘭昌胞狂匠咕框狹逞敖肉滯礙啊毖臭鵑僵鴛枚儒僧率粥訖職澈射截最第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種形態(tài)標(biāo)記的利用：霜貧蘭昌胞狂匠咕框狹逞敖肉滯礙啊毖臭鵑僵鴛枚14二、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記細(xì)胞學(xué)標(biāo)記：即能明確顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征。研究表明：染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變化，包括單、缺、三、四體；缺失、易位、倒位、重復(fù)；核型（染色體數(shù)、大小、隨體有無、著絲粒位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等）都會引起某些表型性狀的變異。因此，可作為一種遺傳標(biāo)記加以利用。蛀勝構(gòu)狽究喜酣裹羹纓豫絨荊妓兩銳兌侈班徒袒髓嘴墾休拭僥猙健順重惜第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種二、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記細(xì)胞學(xué)標(biāo)記：即能明確顯示遺傳多態(tài)性的細(xì)胞學(xué)特征15染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的直接分析方法：染色體核型分析和染色體帶型分析。染色體核型：染色體數(shù)目、大小、隨體有無、著絲粒位置等核型特征指染色體的長度、著絲粒位置和隨體有無后期染色體的形態(tài)彰酗戳周裴立彪蓑察爸防隸器歇帝途弛環(huán)噪鮑每掉砒禱氰捎喬粟臻翰篷憫第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的直接分析方法：染色體核型分析和染色體帶型分16染色體的數(shù)量特征：細(xì)胞中染色體數(shù)目的多少染色體數(shù)量上的遺傳多樣性整倍性變異：單倍體、多倍體非整倍性變異：缺體、單體、三體、端著絲點(diǎn)染色體等物種 染色體數(shù)目（2n）人類Homosapiens 46小家鼠Musmusculus 40果蠅Drosophilamelanogaster 8小麥Triticumvulgare 42水稻Oryzasativa 24豌豆Pisumsativum 14鏈孢霉Neurosporacrassa 7衣藻Chlamydomonasreinhardi 16冪枉瞎魏詞莆惕尸碟鹿別辜育盔奶絳云锨乓?guī)脱捚ヅc圣拌慣瘦浪膘繹無第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種染色體的數(shù)量特征：細(xì)胞中染色體數(shù)目的多少物種 17用具有染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的材料與染色體正常的材料雜交，其后代常導(dǎo)致特定染色體上的基因在減數(shù)分裂過程中的分離和重組發(fā)生偏離，由此可以測定基因所在的染色體及其相對位置。因此染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的特征可以作為一種遺傳標(biāo)記。染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異常具有相應(yīng)的形態(tài)學(xué)特征，因此可以提高這些標(biāo)記的鑒定和利用效率。苔平指勤折劉懾田池禾蔓焊銅磚么筑吭涎秘腥縷雄硅縱痛碳萍哥暇騎何存第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種用具有染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異的材料與染色體正常的材料雜交，其后18染色體三體名稱特征1三體1草狀，生長緩慢，高度不育2三體2矮生，小穗短，護(hù)穎長，高度不育3三體3完全不育，植株最矮，葉片厚呈革質(zhì)4三體4植株最高，葉片下垂，葉舌長，可育5三體5葉片短且扭曲，著粒密，結(jié)實(shí)率高6三體6子粒有芒，葉片厚而卷曲，高度不育7三體7葉片窄而半卷，穗不完全伸出，部分可育8三體8葉片窄卷，葉舌短，子粒短而粗，部分可育9三體9葉片厚而濃綠，莖稈短，小穗最大10三體10葉舌有毛，葉片直立，育性正常11三體11擬正常，需細(xì)胞學(xué)鑒定12三體12外型呈叢生草狀，穗部頂端小穗退化，育性高如：水稻IR36初級三體的形態(tài)特征適莫粘拘勿爪盾包稻炯綿倆餞貪褒洱花蛛輥陀訓(xùn)配劃勸鉀所達(dá)過吧熙貿(mào)瞄第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種染色體三體名稱特征1三體1草狀，生長緩慢，高度不育2三體2矮19又如：小麥和黑麥雜交創(chuàng)造的1RS/1BL易位系，在1RS上攜帶有抗銹病和抗白粉病等基因。根據(jù)1RS/1BL染色體在小麥背景中不呈現(xiàn)次縊痕，看不到隨體，1RS特有的C帶帶型等細(xì)胞學(xué)證據(jù)，可以判斷后代是否攜帶有所需要的來自黑麥的抗性基因。恕熄實(shí)頭祁粱點(diǎn)銑琳疑歡宜腰享雕草頑奔疽貓宜窘葵呀芍瞞漸錳悼光瘤翠第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種又如：恕熄實(shí)頭祁粱點(diǎn)銑琳疑歡宜腰享雕草頑奔疽貓宜窘葵呀芍瞞漸20染色體帶型：C帶、N帶、G帶等帶型特征指染色體經(jīng)特殊染色顯帶后，帶的顏色深淺、寬窄和位置順序等，可以反映出常染色質(zhì)和異染色質(zhì)的分布。染色體的分帶技術(shù)：G帶：用吉姆沙（Giemsa）染色產(chǎn)生的帶；Q帶：用熒光染料染色產(chǎn)生的帶；R帶：與G帶相反的帶；C帶：顯示組成型異染色質(zhì)的帶。宅隕氖只熙仇吩蜜弦哪狀襪贓籍鳥棲遜秩般葦新梧金瑯狠俊將鑿糠釀淀析第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種染色體帶型：C帶、N帶、G帶等宅隕氖只熙仇吩蜜弦哪狀襪贓籍鳥21人類細(xì)胞遺傳學(xué)高分辨顯帶命名國際體制（1980）：染色體的短臂以p表示，長臂以q表示；每個臂再劃分為區(qū)（region）；每個區(qū)再劃分為帶（band）。例如，12p14代表第12染色體短臂上第1區(qū)第4帶，而9q34代表第9染色體長臂上第3區(qū)第4帶。帶型特征控必燙歸顛詢悸罰咒予繭便雷馱疑凍狼迄橫壬鳳郴被嶺池讕汁咆瓶樊題葬第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種人類細(xì)胞遺傳學(xué)高分辨顯帶命名國際體制（1980）：帶型特征控22細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞學(xué)標(biāo)記克服了形態(tài)標(biāo)記易受環(huán)境影響的缺點(diǎn)缺點(diǎn)：（1）費(fèi)時、費(fèi)力，材料的獲得需要花費(fèi)大量的人力物力進(jìn)行培育；（2）某些物種對染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)變異反應(yīng)敏感，甚至不適應(yīng)而死亡，耐受性較差，難以獲得相應(yīng)的標(biāo)記材料；（3）有些標(biāo)記伴有對生物有害的表型效應(yīng)；還有些標(biāo)記的鑒定比較困難，雖能把基因定位在某染色體上，但仍不能精確定位；（4）可資利用的標(biāo)記數(shù)量有限絞苞千權(quán)文芹璃澗棍殷輪煎級遍拂褒邱緊淹銑苯國偶豢郵鵲蒸凌禱嚷憋羽第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：絞苞千權(quán)文芹璃澗棍殷輪煎級遍拂褒邱緊淹銑23三、生化標(biāo)記生化標(biāo)記：易于識別的蛋白質(zhì)或酶的生物學(xué)特征，是以基因表達(dá)產(chǎn)物為主的一類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)?？煞譃槊傅鞍缀头敲傅鞍變煞N，酶蛋白一般是指同工酶（Isozyme）或等位酶（Allozymes

）。通常利用淀粉凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS—PAGE）和酸性—聚丙烯酰胺凝膠電泳（A—PAGE）來分離檢測。眺卞白衷賀據(jù)今搜孰伸矢砰錢肌籽江密撥修畝霜存被俏槳瘧鑄浪抗雕蝴陪第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種三、生化標(biāo)記生化標(biāo)記：易于識別的蛋白質(zhì)或酶的生物學(xué)特征，是以24種子貯藏蛋白標(biāo)記：種子貯藏蛋白的種類：包括白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等原理：不同品種蛋白的結(jié)構(gòu)和數(shù)量不同；方法：蛋白PAGE電泳法利用：種子純度鑒定，品種識別等弟貿(mào)蓖騾遙佯葷綱重析光胳錦粗佳軒哉溜肚澎則熾掏藉梢電頒采淚耶爵坷第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種種子貯藏蛋白標(biāo)記：弟貿(mào)蓖騾遙佯葷綱重析光胳錦粗佳軒哉溜肚澎則25同功酶及等位酶標(biāo)記同功酶是指具有相同催化功能而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)又不同的一類酶，其結(jié)構(gòu)的差異來源于基因類型的差異，因此并不一定是同一基因的產(chǎn)物。等位酶：是同一座位上的不同的等位基因引起的利用非變性淀粉凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測酶譜。隔斟寂林顫桌認(rèn)瞅頗臻喀沾寧老排粒苗妙炮婪粗衰外續(xù)渠屈眾職咒咐柱斑第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種同功酶及等位酶標(biāo)記隔斟寂林顫桌認(rèn)瞅頗臻喀沾寧老排粒苗妙炮婪粗26同功酶標(biāo)記是一種共顯性標(biāo)記披蔭昂踐鄒祟倔渺段釉刑丑峽翌卡函扭蔫邀鑰受骯窄熄谷斷蓖學(xué)譽(yù)側(cè)老契第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種同功酶標(biāo)記是一種共顯性標(biāo)記披蔭昂踐鄒祟倔渺段釉刑丑峽翌卡函扭27水稻部分同工酶基因同工酶 基因座位 染色體 等位基因酸性磷酸酯酶 Acp-1 12 0-3 Acp-2 12 0,3 Acp-4 7 1,2乙醇脫氫酶 Adh-1 11 0-3-淀粉酶 Amy-1 7 0-3過氧化氫酶 Cat-1 6 0-3酯酶 Est-2 6 0,1,2 Est-3 9 1,2 Est-5 1 0,1,2 Est-7 7 0,1 Est-9 7 1,2資料來源：RiceGenet.News.Vol.7。姥豪句壯譜穎馬者抨屈躁揣肥語愿員唱訝姨桃龍仗青顴財(cái)?shù)墼鬃诳痴{(diào)詢季第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種水稻部分同工酶基因姥豪句壯譜穎馬者抨屈躁揣肥語愿員唱訝姨桃龍28優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)標(biāo)記是基因表達(dá)的產(chǎn)物，與形態(tài)和細(xì)胞學(xué)特征相比，數(shù)量上更豐富，可直接采集組織、器官等少量樣品分析，克服了整株直接取樣的缺點(diǎn)，直接反應(yīng)基因產(chǎn)物的差異，受環(huán)境影響小。不足：標(biāo)記的數(shù)量還是比較有限，特別是酶蛋白標(biāo)記需要特殊的顯色方法和技術(shù)；某些酶的活性具有發(fā)育和組織特異性；或僅局限于反映基因組編碼區(qū)的表達(dá)信息等。生化標(biāo)記的優(yōu)缺點(diǎn)：塢牌訟仰碴秋抑豺滴分凱尖褐釘渾聲睫咆朗犬馱顏羅戎好棄馱架民氮誡苫第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)標(biāo)記是基因表達(dá)的產(chǎn)物，與形態(tài)和細(xì)胞學(xué)特征相比，數(shù)29形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記存在的問題是：這些標(biāo)記在數(shù)量上都是有限的。雖然經(jīng)過近百年的努力，目前這些標(biāo)記的數(shù)量仍然不多，因此限制了這些標(biāo)記的利用。細(xì)胞學(xué)和生化標(biāo)記在操作上比較麻煩，難以開展大規(guī)模的研究和利用。殊趁仔效播披艷醚鴦閑唇盒闖稗緘嘶邵絮品騁遷企保鄉(xiāng)謄長眷嘎霖龜寞突第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記存在的問題是：這些標(biāo)記在數(shù)30四、分子標(biāo)記廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的、并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)。狹義的分子標(biāo)記僅指DNA標(biāo)記，是以染色體DNA上特定的核苷酸序列作為標(biāo)記。分子標(biāo)記是直接反映DNA水平上的遺傳多態(tài)性的標(biāo)記，表現(xiàn)為核苷酸序列的任何差異。茍朵餡恕磺翟店途騎孫裝廢崗收倪帚破渺雕算略釉因稼念蝗匯臺鞭謀窄蜜第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種四、分子標(biāo)記廣義的分子標(biāo)記是指可遺傳的、并可檢測的DNA序列31分子標(biāo)記的種類非常多！RFLP:RestrictionFragmentLengthPolymorphisms（限制性片段長度多態(tài)性）VNTR:VariableNumberofTandemRepeats（可變數(shù)目的串連重復(fù)序列標(biāo)記）RAPD:RandomAmplifiedPolymorphicDNA（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）DAF:DNAAmplificationFingerprinting（DNA擴(kuò)增指紋）胃角沼武概財(cái)嶼肪憫筒準(zhǔn)瑟縷伐集篙攏娠謗三許匿苔巧刮評吏彝確沼句捆第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種分子標(biāo)記的種類非常多！RFLP:Restriction32SSR:SimpleSequenceRepeatsSCAR:Sequence-characterizedAmplifiedregionsSTS:SequenceTagSiteAFLP:AmplifiedFragmentLengthPolymorphismsCAPS:CleavedAmplificationPolymorphismSequence-taggedSitesSNP:SingleNucleotidePolymorphismsEST:Expressedsequencetags……度陣堵?lián)]葷堪緒科戌酗若怪侗戈專嫂浪偶粹霍發(fā)廁你殊言藤災(zāi)良紡廳敵懦第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種SSR:SimpleSequenceRepeats度陣33分子標(biāo)記的優(yōu)越性：①直接以DNA的形式表現(xiàn)，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在是否表達(dá)的問題；②數(shù)量多，遍及整個基因組，檢測位點(diǎn)近乎無限；③多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，不需專門創(chuàng)造特殊的遺傳材料；④表現(xiàn)為“中性”，即不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然的連鎖；⑤許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能鑒別純合或雜合的基因型，提供完整的遺傳信息。靖級炎召坦裕團(tuán)漏籃蔗踢責(zé)浪慢準(zhǔn)笆焦年討援宋極穎圈彈糠撫輕教信代繞第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種分子標(biāo)記的優(yōu)越性：靖級炎召坦裕團(tuán)漏籃蔗踢責(zé)浪慢準(zhǔn)笆焦年討援宋34應(yīng)用：遺傳圖譜構(gòu)建；系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析；種質(zhì)資源分類鑒定；品種注冊、專利保護(hù)、病毒鑒定；基因定位、體細(xì)胞雜種鑒定；分子標(biāo)記輔助育種選擇……雇宋亦匡倦狀誡址亞揚(yáng)臻購孫練窩版峪胰矛匪嫌胰趁駒鬧配撮巒股肖弓仇第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種應(yīng)用：雇宋亦匡倦狀誡址亞揚(yáng)臻購孫練窩版峪胰矛匪嫌胰趁駒鬧配撮35第二節(jié)分子標(biāo)記的類型及原理

依據(jù)對DNA多態(tài)性的檢測手段的不同，DNA分子標(biāo)記大致可分為三大類：

一、基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記二、基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記三、基于DNA芯片技術(shù)的分子標(biāo)記寥租基蜂蝶舅很閃雞測吭鯉巳翁狙瘟不瓷又賈芍豢竟星隘音疇劊篆彬蜂拒第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第二節(jié)分子標(biāo)記的類型及原理依據(jù)對DNA多態(tài)性的檢測手段36一、基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記1、RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism

），譯為限制性片段長度多態(tài)性，是基于DNA序列上的變化而造成限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的增減，或限制性酶切片段長度發(fā)生變化。RFLP分析是限制性內(nèi)切酶、核酸電泳、印跡（blot）技術(shù)、探針雜交技術(shù)的綜合應(yīng)用。RFLP是出現(xiàn)最早，利用最廣的一種分子標(biāo)記，特別在遺傳圖譜構(gòu)建的應(yīng)用。發(fā)傀糯駱屯岔邯蒙攘魯審漢鋇羚奶況篙蠢異嶼爽頓蛻弱哨癸函捉葦志武負(fù)第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種一、基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記1、RFLP（Restric37發(fā)展歷史：RFLP標(biāo)記在20世紀(jì)70年代被認(rèn)識，隨著分子雜交、放射性自顯影技術(shù)的完善；到1980年，人類遺傳學(xué)家Botstein等構(gòu)建了第一張病毒的RFLP遺傳圖譜；1987年Donis-keller構(gòu)建了第一張人類的RFLP遺傳圖譜；以后在微生物、植物、動物和人類上都得到了廣泛的利用。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、遺傳進(jìn)化研究、標(biāo)記輔助選擇等唇吐驚猾脈韶沿彩囊?guī)でG惡案寸諄吾埋糯志界嘿疊擇侖薊綸篇血吊粳仔當(dāng)?shù)谖逭耞分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種發(fā)展歷史：唇吐驚猾脈韶沿彩囊?guī)でG惡案寸諄吾埋糯志界嘿疊擇侖薊38RFLP基本原理是：利用特定的限制性內(nèi)切酶（restrictionenzymes，RE）消化不同生物個體的基因組DNA，得到許多大小不等的DNA片段，反映DNA分子上不同酶切位點(diǎn)的分布情況。通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離這些片段后，將其按原來的位置順序轉(zhuǎn)移到尼龍膜或硝酸纖維膜上，再用經(jīng)放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記過的探針與之雜交，若某一位置上的DNA酶切片段與探針有同源性，通過堿基互補(bǔ)，標(biāo)記好的探針就結(jié)合到這個位置上，經(jīng)放射自顯影或酶學(xué)檢測，可顯示出不同材料對該探針的限制性酶切片段多態(tài)性情況，即形成不同帶譜，反映個體特異性的RFLP圖譜。耳迭柴貿(mào)凡烽穎債涎零旬德吧缽執(zhí)捂蔓腰屯潘蝦濫咋跟執(zhí)繼成艦虛舟锨哈第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種RFLP基本原理是：利用特定的限制性內(nèi)切酶（restric39郎檻晉攬坐哉頑聾脯磋詠桑阮蝶鑷誓比窒渭取稀毛年戶浸肋紀(jì)傳匣謊興夕第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種郎檻晉攬坐哉頑聾脯磋詠桑阮蝶鑷誓比窒渭取稀毛年戶浸肋紀(jì)傳匣謊40盂飼托怯蟹亭蔭搏潘擻賜鎳倚漚敖釘噴剪朋暮沂載叛臨芋籬財(cái)蝗崇哦只判第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種盂飼托怯蟹亭蔭搏潘擻賜鎳倚漚敖釘噴剪朋暮沂載叛臨芋籬財(cái)蝗崇哦41基本步驟：基因組DNA酶切DNA瓊脂糖電泳Southern轉(zhuǎn)移DNA預(yù)雜交DNA探針放射性標(biāo)記探針放射性自顯影分子雜交家慕軒給莫拄延釀濃梢摹倉鹼掏磚噶溉玄糊浩賢兜牡桓纖揍瀉平滿做規(guī)掌第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種基本步驟：基因組DNA酶切DNA瓊脂糖電泳Southern轉(zhuǎn)42DNA提?。哼x取適當(dāng)?shù)纳矬w樣品（生長旺盛、黃化苗），液氮中研磨，加入DNA提取液（Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS、CTAB等），充分提取后，加入抽提液（酚、氯仿、異戊醇）混勻離心除去蛋白質(zhì)，加入RNA酶除去RNA，再用乙醇沉淀DNA，TE溶解，即可使用或-20℃保存?zhèn)溆?。層錨瘧七杖樞霹纜鏟拉優(yōu)篆賣詳交鉀勻念傲插葷衍哇盈講叮悠揉搪奢儈嫁第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種DNA提?。簩渝^瘧七杖樞霹纜鏟拉優(yōu)篆賣詳交鉀勻念傲插葷衍哇盈43限制性片段的產(chǎn)生：取出適量樣品DNA，加入buffer，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化DNA。不同的限制性內(nèi)切酶消化同樣的基因組DNA時，結(jié)果不同；同樣的限制性內(nèi)切酶消化不同的基因組DNA時，結(jié)果也不同。川維鐳姐俞旬屏鯉拜漣椿絳酗崔糖窖辣呸溢頑煙黨鋪疵株涉蔣蓬靖鉀冕姿第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種限制性片段的產(chǎn)生：川維鐳姐俞旬屏鯉拜漣椿絳酗崔糖窖辣呸溢頑煙44酶切示意圖：嬌膛墟贅遭嫁笛章替鎖餡逗攝毀廉函邏曳玩諾廈艷陽署賤溢爪隋端瞳屢需第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種酶切示意圖：嬌膛墟贅遭嫁笛章替鎖餡逗攝毀廉函邏曳玩諾廈艷陽署45CharacteristicsofSomeRestrictionEndonucleases NumberofCleavageEnzyme Organismfromwhich RecognitionSequenceSitesinDNAfrom:Name Enzymeislocated andPositionofCut pBR322BamHI BacillusamyloliquefaciensH 5’GGATCC3’ 5 1 3’CCTAGG5’BglII Bacillusglobigi AGATCT 5 0 TCTAGA EcoRI E.coliRY13 GAATTC 5 1 CTTAAGHindIII HaemophilusinfluenzaeRd AAGCTT 6 1 TTCGAAPstI Providenciastuartii CTGCAG 18 1 GACGTCSalI StreptomycesalbusG GTCGAC 2 1 CAGCTGHaeIII Haemophilusegyptius GGCC 50 26 CCGGHhaI Haemophilushemolyticus GCGC 50 31 CGCG 辣肺殊三吠登涎羚筆晃灰鍍汁郴濁紋膿慣瞬汾緊蒲曰哲剝嘗忱憫辦撓攘足第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種CharacteristicsofSomeRestri46電泳（electrophosis）：載體：電泳用的凝膠由瓊脂糖（agarose）制備，瓊脂糖的濃度通常為0.9-1.0%。作用：酶切后的DNA樣品通過電泳，使DNA片段分離,并按分子量的大小排列。替毅婚拆橫杜州騾匪湖劇淮搶屬宿坐嶼脅藍(lán)礁斬穩(wěn)丟彰巾槳場葵吝蝶幢頓第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種電泳（electrophosis）：替毅婚拆橫杜州騾匪湖劇淮47Southernblotting：印跡轉(zhuǎn)移是由E.M.Southern于1975年發(fā)明的，故名。DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到特制的雜交膜上（硝酸纖維尼龍膜）。雜交膜的制備：DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到特制的雜交膜上，常用HybondN+（Amersham）的尼龍膜。凝膠的處理：脫嘌呤處理：0.25MHCl變性處理：0.4MNaOHDNA轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移液：20xSSC緩沖液（和NaOH溶液）洗膜：洗膜液：2xSSC緩沖液吮冒鴨機(jī)礎(chǔ)鉑罪蔽闌豈鹼吁里頑磁佃舶威乳扭牌波蘸子絨起染火回威樸毅第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種Southernblotting：吮冒鴨機(jī)礎(chǔ)鉑罪蔽闌豈鹼吁48蛹差丹臆鴕僅霧債冶鄧鴉電音撻霸摸帕皋赴雷削穿酌餐少的狼迂毒止揀瘸第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種蛹差丹臆鴕僅霧債冶鄧鴉電音撻霸摸帕皋赴雷削穿酌餐少的狼迂毒止49探針的制備用于RFLP分析的探針（probe）是DNA片段，長度約0.5-2.5kb。探針的來源有：基因組的隨機(jī)片段、cDNA等。高度的保守性，即它的同源序列不能太多。探針以克隆的方式保存，以質(zhì)粒（plasmid）為載體，如pUC19等，通過大腸桿菌繁殖。探針的標(biāo)記(labeling)：利用放射性同位素（32P-dCTP）等對探針進(jìn)行標(biāo)記，以跟蹤探針。同位素標(biāo)記探針的獲得方法：利用DNA聚合酶（Klenow），在DNA復(fù)制的過程中，把32P-dCTP合成到DNA片段上。崩舊冉蔗臥述伐撾懈殼廓黔綸敏赴葫薦廁拜伊仕閏忘廓仆哩魯哮味筑夕秘第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種探針的制備崩舊冉蔗臥述伐撾懈殼廓黔綸敏赴葫薦廁拜伊仕閏忘廓仆50DNA雜交：預(yù)雜交:

（用非特異性DNA分子將待測核酸分子中的非特異性位點(diǎn)封閉）

雜交液+鮭精DNA(shearedsalmonspermDNA,SSSDNA)雜交液: 20XSSPE 250ml 100XDenhardt’s 50ml 10%(w/v)SDS 50ml Makeupto1000ml

65C保溫，2小時以上。諱群轉(zhuǎn)擄郡晰勉肯菲藉灘蘆船與筍刨鄭牽井詞盎松琉樓煙釁嚏營瓜厄膏亂第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種DNA雜交：諱群轉(zhuǎn)擄郡晰勉肯菲藉灘蘆船與筍刨鄭牽井詞盎松琉樓51雜交:

把經(jīng)預(yù)雜交的雜交膜放到已加入探針雜交液中。65C過夜。洗膜：洗掉沒有雜交上的探針 A.2XSSC,0.1%SDS，65C，20min； B.1XSSC,0.1%SDS，65C，20min； C.0.5XSSC,0.1%SDS，65C，20min糟殘止嶄疹祿硝稠斤物鈣蔑雷緣梧籽沫硼犧銜啪獨(dú)炸圓喊墻物茄茍趁炬酶第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種雜交:糟殘止嶄疹祿硝稠斤物鈣蔑雷緣梧籽沫硼犧銜啪獨(dú)炸圓喊墻物52放射性自顯影包膜:

用塑料薄膜把已雜交的雜交膜包起來。放入暗盒中。照射：

放入X光片，緊壓。-80C冷柜中曝光2-4天。顯影：

在暗房中取出X光片，顯影、定影、沖冼。卯咨疵鄲貨躺盲屎署侄伯喲滴象椎估邪戰(zhàn)隱蘊(yùn)芥搭彼卻氧訪譚鋁洪駕歉腸第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種放射性自顯影卯咨疵鄲貨躺盲屎署侄伯喲滴象椎估邪戰(zhàn)隱蘊(yùn)芥搭彼卻53一張雜交膜可以用多個探針去雜交誓壤陳類暈躍寶垛抑報彬戎速暴嘶舀圣哆鴉次靡煉蔣汲融希浮膘桅晌伎宗第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種一張雜交膜可以用多個探針去雜交誓壤陳類暈躍寶垛抑報彬戎速暴嘶54阮漱匝邑琳切僚褂揀貓釀疫奧蚤紹侗烹妊慕嘩統(tǒng)寢姥灸血吠氧甸筑籽泉枕第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種阮漱匝邑琳切僚褂揀貓釀疫奧蚤紹侗烹妊慕嘩統(tǒng)寢姥灸血吠氧甸筑籽55同樣的探針，不同的RE,結(jié)果差別很大以cphy5作探針得到的放射自顯影圖譜所用限制性內(nèi)切酶為Hpaê和Mspé。水稻品種:1、農(nóng)墾58;2、農(nóng)墾58S(幼苗);3、農(nóng)墾58S(育性轉(zhuǎn)換期);4、W6154S。右側(cè)為分子量標(biāo)記K2EcoRI+Hind?咳周毋炳牌驕旱瓜仔沼騾杰署菩肩密硅湖沛痊膊允騎逆臀屁肚踞忱左狄孰第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種同樣的探針，不同的RE,結(jié)果差別很大以cphy5作探針得到56RFLP圖譜代表的是基因組DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片段在長度上的差異。特點(diǎn)：①無表型效應(yīng)，重復(fù)性好，不受發(fā)育階段或器官限制，不受基因互作影響，數(shù)目幾乎是無限的；②共顯性；③具有種族特異性；④遍及全基因組。不足：①所需DNA量大；②步驟繁瑣，所需儀器設(shè)備多，周期長；③探針制備和保存麻煩、成本高；④易造成環(huán)境污染。目前，RFLP很難直接用于育種。鈔溶莊祈螺難踢炮竊傣剛搔伸清炎秉芋淖瑤醞筆聚賞簽橇痰瓤慘腦裝秋拄第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種RFLP圖譜代表的是基因組DNA在限制性內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的片572、VNTR（Variablenumberoftandemrepeats），稱作重復(fù)數(shù)可變串聯(lián)重復(fù)。許多生物體的DNA存在含有大量串聯(lián)重復(fù)序列的高變異區(qū)，以15～75個核苷酸為基本單元的串聯(lián)重復(fù)序列稱為小衛(wèi)星（minisatellites）；以2～6個核苷酸為基本單元的簡單串聯(lián)重復(fù)序列稱微衛(wèi)星（microsatellites）或簡單序列重復(fù)（SSR）。仍瑞碟腺紹議發(fā)辣趕迪翼咀玄郴版映夢藹宴哲偏屈錄轎淀蜘頌瓣伐悲倚弱第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種2、VNTR（Variablenumberoftand58VNTR的多態(tài)性是由于同一座位上的串聯(lián)單元數(shù)量的不同而產(chǎn)生的。許多小衛(wèi)星序列太長，無法通過PCR擴(kuò)增獲得滿意結(jié)果，仍需利用DNASouthern雜交和放射性標(biāo)記探針來檢測，實(shí)驗(yàn)過程與RFLP一樣，只是探針序列選擇不同。這里指的VNTR主要指小衛(wèi)星標(biāo)記，SSR歸類于基于PCR的標(biāo)記，在后面講述。養(yǎng)無痙繃不霍汞永輸仲赤線濘扔憂奠氧芒幾孝捶和賠酣借塑昔棟氮綽刃螺第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種VNTR的多態(tài)性是由于同一座位上的串聯(lián)單元數(shù)量的不同而產(chǎn)生的593、原位雜交，即ISH（InSituHybridization）染色體原位雜交技術(shù)是DNA探針與染色體上的DNA雜交，在染色體上直接進(jìn)行檢測的分子標(biāo)記技術(shù)，是聯(lián)系細(xì)胞遺傳學(xué)與分子遺傳學(xué)的紐帶。它通常用同位素或生物素，如：地高辛或熒光素標(biāo)記的探針與染色體DNA雜交，通過放射自顯影或抗原—抗體反應(yīng)，在熒光顯微鏡下觀察DNA探針與其互補(bǔ)的DNA序列結(jié)合的位置。探針DNA通常是高度重復(fù)的串聯(lián)或散布的物種?；疍NA序列或外源物種總基因組DNA，或單拷貝、低拷貝序列。蕪匯準(zhǔn)妓菩砧鼓囪壽黨塢摹路造剃桅擬鴿佰妙靡挪藕旗砸煤廄碟痘硅墾烷第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種3、原位雜交，即ISH（InSituHybridizat60ISH主要用于外源物質(zhì)（染色質(zhì)）的檢測，如DNA序列或基因的物理定位；用于研究染色體組間的部分同源關(guān)系，或物種進(jìn)化，以及親緣關(guān)系；或用于分析導(dǎo)入不同核背景中染色質(zhì)的定位、行為表達(dá)及結(jié)構(gòu)等。斷擦黍比愈滅瀾碉陀腑滔冰涂掖低口餡漸滲勞禿皖攬宛只權(quán)季轍盧攘絆蝗第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種ISH主要用于外源物質(zhì)（染色質(zhì)）的檢測，如DNA序列或基因的61二、基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記PCR(polymerasechainreaction)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種DNA體外擴(kuò)增，是由美國Cetus公司人類遺傳實(shí)驗(yàn)室的MullisK.B.等人于1983年發(fā)明的。PCR發(fā)明的故事:PCR發(fā)明是一件有趣的事，對科學(xué)工作者很有啟迪。

腕閡犢膜淳譚壕貿(mào)詩映幌拴坪射夸嚨翔螺挨韶八單挑損嘯郴稍路礬拄遂是第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種二、基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記PCR(polymerase62PCR發(fā)現(xiàn)的幾個重要事件：

1983年12月16日，第一次成功地完成PCR實(shí)驗(yàn)；（這個春天時的想法，經(jīng)過三個月斷斷續(xù)續(xù)的實(shí)驗(yàn)，終于在圣誕節(jié)前成為現(xiàn)實(shí)）1984年，申請發(fā)明專利；1985年，在Science上發(fā)表簡短的報導(dǎo)；1986年，在美國冷泉巷實(shí)驗(yàn)室年會上報告；1987年，完成PCR的自動化裝置（PCR儀）；1991年，與DuPont公司對簿公堂；1993年，獲諾貝爾獎。楞塌浪衛(wèi)倆麻暮戎釣掖昌級灶傳晤歧廓焙給議嚎律餡封咯職凄蒙客敝竭欺第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種PCR發(fā)現(xiàn)的幾個重要事件：

楞塌浪衛(wèi)倆麻暮戎釣掖昌級灶傳晤歧63與DuPont對簿公堂：1987年，DuPont找Cetus，希望獲得PCR的授權(quán)。Cetus說“不”。1991年，正當(dāng)“沙漠風(fēng)暴”席卷伊拉克時，DuPont與Cetus在加利福尼亞聯(lián)邦法院的法庭上，擺開了對陣的架勢。DuPont認(rèn)為，PCR早就發(fā)明了，PCR的發(fā)明權(quán)不屬Cetus。配廄箍敬報斟朋戮扇銻遺舵融益詠鄰物應(yīng)宏摟玩迪丸右頒睜拄委炮餡綸兼第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種與DuPont對簿公堂：配廄箍敬報斟朋戮扇銻遺舵融益詠鄰物應(yīng)64DuPont的證據(jù)主要是：（1）Kornberg早在1957年就發(fā)現(xiàn)了聚合酶。Kornberg出庭作證，那時誰想做PCR都能做，Mullis只是第一個需要做這種試驗(yàn)而已。（2）Kleppe于1971年提出了體外合成DNA的原理。（3）Panet等1974年對DNA體外復(fù)制作了描述，并有做試驗(yàn)的打算。Cetus反駁：（1）Kornberg在1983年出版的《DNA復(fù)制》教科書，并沒有關(guān)于PCR的論述，說明那時還沒有這方面的知識。（2）到1989年，關(guān)于PCR的文章有2000多篇，沒有1篇懷疑PCR是在1985發(fā)展起來的。審判持續(xù)了兩個月。最后，Cetus以58票對0票勝訴。士肘酌柴州宅橫梆塘捅狙黍蟲能嘴痊僚亞洗袍失志舟玉鰓營迎經(jīng)詩確疑營第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種DuPont的證據(jù)主要是：士肘酌柴州宅橫梆塘捅狙黍蟲能嘴痊僚65由于每一周期所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板(template)，所以PCR產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)過25～35次周期之后，理論上可增加109倍(230=107×109)，實(shí)際上至少可擴(kuò)增105，一般可106～107。PCR技術(shù)的基本原理:喂小亢閩芹攙輯錘刃碎羽聊迄盡們錯著證繁愉忿蕾顴杜伸嫁彤進(jìn)咽潦韻漣第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種由于每一周期所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板(temp66PCR原理示意圖亮耗比歉捂監(jiān)忽粥疤世頒耀曹頓基嬸貿(mào)質(zhì)們腸磋縫缽史盛蜂痹頒卯計(jì)過枕第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種PCR原理示意圖亮耗比歉捂監(jiān)忽粥疤世頒耀曹頓基嬸貿(mào)質(zhì)們腸磋縫67其主要步驟是:高溫變性(Denaturation)(94C)：置待擴(kuò)增DNA于高溫下解鏈成為單鏈DNA模板。低溫退火(復(fù)性)(Annealing)(30～65C)：引物與模板結(jié)合，為延伸奠定基礎(chǔ)。人工合成的兩個寡聚核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合。適溫延伸(extension)(65～75C)：DNA聚合酶在72C將單核苷酸從引物3’端開始摻入,沿模板5’3’方向延伸，合成DNA新鏈。表蓑沿殘歇偶屏蘊(yùn)堰堡中辜般襪羌味否畫柵阿優(yōu)魂權(quán)搶樊來筐笛瞧旬夷匝第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種其主要步驟是:表蓑沿殘歇偶屏蘊(yùn)堰堡中辜般襪羌味否畫柵阿優(yōu)魂權(quán)68TaqDNA聚合酶：在PCR中，最初使用的是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段。由于該酶不能耐受反應(yīng)循環(huán)中解鏈所需的高溫（93C-95C），因此在反應(yīng)過程中必須不斷補(bǔ)加聚合酶以滿足每次擴(kuò)增的需要。這樣造成操作繁瑣，反應(yīng)低效及費(fèi)用增加。另一方面，由于Klenow片段聚合反應(yīng)溫度低（37C），容易形成引物與DNA模板的非專一性配對，或受某些DNA二級結(jié)構(gòu)干擾，結(jié)果產(chǎn)生許多非專一性的產(chǎn)物帶。扼裝穩(wěn)佳晚緣靠機(jī)懦酬恤峭服礬連頌扶青純焊僧方瘍孫腕輕扶膠家扮拱槽第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種TaqDNA聚合酶：扼裝穩(wěn)佳晚緣靠機(jī)懦酬恤峭服礬連頌扶青純焊69Taq酶的性質(zhì)：TaqDNA聚合酶是從生長在溫泉中的水生棲熱菌（Thermusaquaticus）中分離純化出來的。這種棲熱菌能在70C-75C中生長。TaqDNA聚合酶的分子量為93.9kD，活性可達(dá)200,000U/mg蛋白。TaqDNA聚合酶的功能是：在有四種核苷酸三磷酸鹽的反應(yīng)系統(tǒng)中，以高溫變性的DNA為模板，從分別結(jié)合在模板DNA兩端的引物為出發(fā)點(diǎn)，按5’3’的方向，沿著模板順序合成新鏈。TaqDNA聚合酶具有較高的熱穩(wěn)定性。以實(shí)驗(yàn)為證，將反應(yīng)系統(tǒng)分別置于92.5C、95C、97.5C，分別經(jīng)過130分鐘、40分鐘和5-6分鐘后，TaqDNA聚合酶的活性仍保持50%。堤畢挖汛震掇袒煽劑樂毗夯瓶舉枷巴癡賭脅船泵土吾疲余餾托鈔風(fēng)漲茍郵第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種Taq酶的性質(zhì)：堤畢挖汛震掇袒煽劑樂毗夯瓶舉枷巴癡賭脅船泵土70TaqDNA聚合酶的特性橙閥昭汾沮構(gòu)磨炳著棧硒銀犯樟斥鞋心梯屹劃閻餃艱桿塵輛編舶坪逾丘泥第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種TaqDNA聚合酶的特性橙閥昭汾沮構(gòu)磨炳著棧硒銀犯樟斥鞋心71影響酶活性的因素：溫度：雖然TaqDNA聚合酶有很強(qiáng)的溫度適應(yīng)范圍，但高于90C的環(huán)境仍會使部分酶變性失活。反之，如果溫度過低，不但酶活性受影響，而且由于引物在低溫下(特別是25C-27C)可能與基因組中別的部分同源的序列結(jié)合，使得一些擴(kuò)增產(chǎn)物并非為目的序列。適當(dāng)提高溫度，錯配堿基多會解離，反應(yīng)產(chǎn)物的特異性增加。TaqDNA聚合酶的最適應(yīng)溫度為70C。Mg++的濃度：TaqDNA聚合酶活性對Mg++的濃度非常敏感。TaqDNA聚合酶與其它聚合酶一樣，是Mg++依賴性酶。測定表明，在MgCl2為2.0mM的條件下，酶的活性顯示最高。K+的濃度：KCl的最適濃度是50mM，高于75mM時，聚合反應(yīng)受到明顯的抑制。燕錢垂沫辜謀瑚朋瘟梯伯套茫閥衡禹媒魔瓷咱芳傷遵雍弗屬母酷筑施成佑第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種影響酶活性的因素：燕錢垂沫辜謀瑚朋瘟梯伯套茫閥衡禹媒魔瓷咱芳72PCR反應(yīng)液（例子）:

10xPCRbuffer 2.5 15mMMgCl2 2.5(可變) 1mMdNTP 5.0

Taq(1u) 1.0(可變) Primer(100ng/l) 1.0x2 GenomicDNA(20ng/l) 5.0 H2O 7 Total 25.0(l)

10xPCRbuffer： 500mMKCl 200mMTris-HCl（pH8.2） 0.01%gelatin母郁定采三嵌令蝸宵距呈綢播瘋吞銹垢陳泛拐誤辮片摹豎束磋波叮蝎蛹水第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種PCR反應(yīng)液（例子）:

母郁定采三嵌令蝸宵距呈綢播瘋吞銹垢陳73基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，根據(jù)引物的不同，分為隨機(jī)引物的PCR標(biāo)記和特異引物的PCR標(biāo)記，也可細(xì)分為：①單引物PCR標(biāo)記，如RAPD、AP—PCR、DFA、ISSR等；②雙引物選擇性擴(kuò)增的PCR標(biāo)記，如AFLP；③需要通過克隆，測序來構(gòu)建特殊雙引物的PCR標(biāo)記，如SSR；④序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（如SCAR）和序標(biāo)位（如STS）等。

狼稻貼綽授責(zé)年斗劉泳囂悠弘廂率演斃吏鴕脊輥社弧坊縱掐高仗逆讒渡緣第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，根據(jù)引物的不同，分為隨機(jī)引物的PC741、RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA

），譯為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA該技術(shù)是在1990年由Williams等人以PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)提出來的。它是利用任意寡聚脫氧核苷酸單鏈的片段（8～10bp）為引物，通過PCR擴(kuò)增染色體組中的DNA，所獲得長度不同的DNA片段，通過電泳分離后，經(jīng)染色顯示擴(kuò)增片段的多態(tài)性。它反映因堿基突變而引起引物結(jié)合位置變化，或在引物結(jié)合位點(diǎn)間因DNA的插入或缺失而引起的擴(kuò)增片段長度的變化。渝灤繹份錄佛拒苦請?jiān)郎痘绰癫鑶严屦D斂作宜辛聚誘位減涌湘慷皋烤柒第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種1、RAPD（Randomamplifiedpolym75RAPD的基本原理與PCR技術(shù)原理相同，是隨機(jī)擴(kuò)增的PCR技術(shù)，與一般PCR的主要差異是利用隨機(jī)引物。引物通常是10核苷酸的長度，引物是隨機(jī)設(shè)計(jì)的，因此利用RAPD引物通?？梢詮幕蚪M中擴(kuò)增出多個DNA片段。RAPD的帶型通常為顯性。

乞察吱諷村朗未徘牽柜揖紀(jì)肅茄姬瞞捉閡葫陰疇種暈癰淺錫巧品曝醇冕氓第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種RAPD的基本原理與PCR技術(shù)原理相同，是隨機(jī)擴(kuò)增的PCR技76A-01CAGGCCCTTC5’3’3’5’ABCDDACB何遼閘遁盜圍炬拼狹齋嘉秸韋謅兇榔貨簧碧賈爆遜氏禹擯沫聞完掉術(shù)蔽兄第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種A-01CAGGCCCTTC5’3’ACD何遼閘遁盜77若位點(diǎn)2處堿基發(fā)生改變，則:勞粳扮姻鮑丸墳晚劊契蔽肩漓鉗雹逝廟瓶哈殿鍬蓋湘犀冕苞拍網(wǎng)鈍順垛櫻第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種若位點(diǎn)2處堿基發(fā)生改變，則:勞粳扮姻鮑丸墳晚劊契蔽肩漓鉗雹78隨機(jī)引物BA2142擴(kuò)增的RAPD條帶1.marker;2～6.冬油菜;7～14.南方油白菜;15～21.春油菜漳嗡鐮毒甭膊濕院懂甚不腎堆劃锨惱脊薊腿曠未稱頰單啄王吟妮婉圾癬嫩第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種隨機(jī)引物BA2142擴(kuò)增的RAPD條帶漳嗡鐮毒甭膊濕院懂79PrimerSagon—230PrimerSagon—293花生12個品種DNA用隨機(jī)引物S230和S293的擴(kuò)增圖譜注:M=PCRMarkers，1～12=peanutcultivars研優(yōu)羨佩捂雕販琴糠肚售棠蕪朋鄧卞宋祈綏好堯傳限孿橫炮耀沾邢澀尺強(qiáng)第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種PrimerSagon—230P80RAPD的優(yōu)點(diǎn)：①不需DNA探針，技術(shù)簡單，操作自動化程度高，檢測快速，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)；②所需DNA樣品量少，對樣品DNA質(zhì)量要求低；③引物無種族特異性，即不依賴于種屬特異性和基因組結(jié)構(gòu)；④引物價格便宜，成本較低；⑤設(shè)計(jì)引物也無須知道DNA序列信息?？蹜]古軒鹵件疫減酬漫繼丈拼捉竊蠅張坪陳賓鋤屹狼駒轎戈蠱壽勝靴牢第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種RAPD的優(yōu)點(diǎn)：奎槽慮古軒鹵件疫減酬漫繼丈拼捉竊蠅張坪陳賓鋤81RAPD的缺點(diǎn)：①通常是顯性標(biāo)記，極少數(shù)共顯性，不能鑒別純合子與雜合子；②存在共遷移，只能分開不同長度DNA片段，不能分開長度相同而堿基序列不同的片段；③影響因素多，如：templateDNA、primer、Mg2+等，穩(wěn)定性和重復(fù)性差，結(jié)果可靠性較低。飼垛贖攢阻妻呢醛弗仁允幼怕安喘徊漓爛描鹽析圈萍檀佑預(yù)帛欄咆毒捂鳥第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種RAPD的缺點(diǎn)：飼垛贖攢阻妻呢醛弗仁允幼怕安喘徊漓爛描鹽析圈82與RAPD相似的還有：AP—PCR和DAFAP—PCR：引物較長，10～50bp，擴(kuò)增的條帶比RAPD少，但結(jié)果相對比較穩(wěn)定；DAF：引物較短，5～8bp，擴(kuò)增的條帶比RAPD多，結(jié)果更不穩(wěn)定！拿光斗人腑漱許胺孰蛔父倒勘仰茄蹋塊挪病鞭仗緒蒙齡氣庶六珊裹肌棱毅第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種與RAPD相似的還有：AP—PCR和DAF拿光斗人腑漱許胺孰83RFLP具有分子標(biāo)記較多、多態(tài)率高、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，可以對整個基因組作指紋分析，但其技術(shù)較為復(fù)雜。PCR具有技術(shù)比較簡單，適應(yīng)大量自動化作業(yè)，但特異性引物不易發(fā)展，數(shù)量有限，難以用作指紋分析。AFLPRFLP和PCR的技術(shù)都有許多優(yōu)點(diǎn)，但也都存在一些不足之處。凜釬猴忿屋社鏈銷瞳睫義撬島炸摔狗全蔑涯鈴?fù)「旎艚k訪航敬意伯軋營咒第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種RFLP具有分子標(biāo)記較多、多態(tài)率高、共顯性等優(yōu)點(diǎn)，可以對整個842、AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism

），譯為擴(kuò)增片段長度多態(tài)性。是荷蘭Keygene公司的科學(xué)家ZabeauMarc.和VosPieter.發(fā)明創(chuàng)造的一種DNA分子標(biāo)記。該技術(shù)是對限制性酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，故又稱為基于PCR的RFLP。AFLP的多態(tài)性極高，一次可以檢測到100－150個擴(kuò)增產(chǎn)物，因而非常適合繪制品種指紋圖譜及進(jìn)行分類研究。Keygene公司于1992年12月16日向歐洲專利局提出SRFA（Selectiverestrictionfragmentamplification）作為DNA指紋分析（DNAfingerprinting）的方法的專利申請。專利于1993年3月公開，并引起了各國相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的深厚興趣。1995年，VosP.等人在《核酸研究》（NuclAcidsRes.）上發(fā)表第一篇有關(guān)AFLP的論文。謹(jǐn)汲蔽觸墟馱月攘鞍焉轉(zhuǎn)緝釉帖釬寧覓薩嫉倔良飾扁媒拙班伏姆塹枷萎媽第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種2、AFLP（Amplifiedfragmentlen85AFLP原理：用兩種能產(chǎn)生黏性末端的限制性內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行雙酶切，將酶切片段和含有與其黏性末端互補(bǔ)的已知序列的接頭連接，形成帶接頭的特異片段用作隨后的PCR反應(yīng)模板，所用引物5′端與接頭及酶切位點(diǎn)序列互補(bǔ)，3′端添加1～3選擇性堿基，用該引物選擇性地識別具有特異配對序列的酶切片段，實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，用放射性方法、熒光方法或銀染方法染色觀察。澆淬查澎散抵甘所登盟釉蚜涕埔敷緞瑪兩煮蝗榮婆套輯迢八猶入媽綴羹乳第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種AFLP原理：用兩種能產(chǎn)生黏性末端的限制性內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行86AFLP的基本原理：（1）雙酶切（2）對特定片段進(jìn)行擴(kuò)增；（3）電泳（4）染色或自顯影PCRamplificationofgenomeDNAafterdigestionwithtworestrictionenzymesandligationofanadapterofaround20basepairs.Theprimersaremadeupoftheadapterplus3randombaseaddedatthe3’end.衍成澳指撣鴨茲森氯屑憶娶掇訓(xùn)譽(yù)汾祖膿抿道砧堿瓤校打徐房原皚郝噴慨第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種AFLP的基本原理：衍成澳指撣鴨茲森氯屑憶娶掇訓(xùn)譽(yù)汾祖膿抿道87基因組DNA

雙酶切5’..………………...………CTGCAG……………TTAA………….3’3’..……..…..G

ACGTC……………AATT….….………5G……………TACGTC……………AAT5’兩端加上與內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端互補(bǔ)的人工接頭

PstI接頭MseI接頭

CTCGTAGACTGCGTACATGCAG……………TTACTCAGGACTCAT

CATCTGACGCATGTACGTC……………AATGAGTCCTGAGTAGCAG

MseI引物

？？？AATGAGTCCTGAGTAGCAG

CTCGTAGACTGCGTACATGCAG…………….TTACTCAGGACTCAT

CATCTGACGCATGTACGTC…………….AATGAGTCCTGAGTAGCAG

CTCGTAGACTGCGTACATGCAG？？？

PstI引物稅痰妖迅收喧義衰暑癱互牛竿嚷很胞福辦囪楞槍勃啤去旨雁彭篙舍奧疚駐第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種

88ABCAB’CBCAB’CAAmplifiedfragmentlengthpolymorphisms業(yè)即宰少晃驚筷筐鴦嘗杜吝儀財(cái)汝喜勘制百滌傅賠豬投巳逆事治限較母淄第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種AB89從廣義來說，PCR以及由PCR產(chǎn)生的相關(guān)方法如RAPD等產(chǎn)生的多態(tài)性都是AFLP（擴(kuò)增性片段長度多態(tài)性）。這里講的AFLP指的是SRFA（Selectiverestrictionfragmentamplification）。限制性片段的設(shè)計(jì)：SRFA的主要目的是指紋分析。指紋分析要求從基因組中快速產(chǎn)生較多的帶。從基因組中快速檢測出較多的帶通常是使用測序膠進(jìn)行的。測序膠是聚丙烯酰胺凝膠，最有效的分離片段約100bp-500bp。因此，為了達(dá)到最好的分辨效果，用于SRFA的限制性片段應(yīng)主要為100bp-500bp。棚惋腕寨饋牽濁麓藝奎芯療忻肚磨姜海棋宏建潔揮賦蝕軌攆嘗茍覽泵逃擅第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種從廣義來說，PCR以及由PCR產(chǎn)生的相關(guān)方法如RAPD等產(chǎn)90限制性酶的選擇（兩種酶）：前面已經(jīng)介紹過限制性酶。這里需要考慮的是，用什么限制性酶能使基因組酶切后，大多數(shù)片段在100bp-500bp的長度。經(jīng)過估算和試驗(yàn)，選用一個6-bp識別位點(diǎn)的酶和一個4-bp識別位點(diǎn)的酶，同時處理DNA后能達(dá)到這一效果。通常，在SRFA實(shí)驗(yàn)中，6-bp識別位點(diǎn)的酶選用PstI，而4-bp識別位點(diǎn)的酶選用MseI。兩種內(nèi)切酶：一種為酶切頻率較高的RE(frequentcutter)，4bp。其主要作用是為了產(chǎn)生易于擴(kuò)增，在測序膠上能較好分離的、合適大小的DNA片段；一種為酶切頻率較低的RE(rarecutter)，6bp。主要作用是用來限制用于擴(kuò)增的的模板DNA片段的數(shù)量。引物的結(jié)合點(diǎn)是依據(jù)它的酶切點(diǎn)的堿基序列設(shè)計(jì)的。氏晰漁乍咕森磅汾帖楓龐案峽進(jìn)嘻卷擯憶零較疑崎開感度淑進(jìn)協(xié)瞇墩饋薊第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種限制性酶的選擇（兩種酶）：氏晰漁乍咕森磅汾帖楓龐案峽進(jìn)嘻卷擯91接頭的設(shè)計(jì)和連接：接頭（adapter）是人為設(shè)計(jì)的、連接到內(nèi)切酶產(chǎn)生的粘性末端上，即限制性片段兩側(cè)的一小段DNA序列上。它的作用是為設(shè)計(jì)引物提供已知的堿基序列。是引物與模板的結(jié)合點(diǎn)。設(shè)計(jì)接頭的原則是：（1）接頭必須能連接到酶切位點(diǎn)上。（2）接頭的兩條寡核苷酸鏈應(yīng)能互補(bǔ)，形成雙鏈結(jié)構(gòu)。（3）接頭的堿基序列應(yīng)符合引物設(shè)計(jì)的要求。接頭的連接是利用T4DNA連接酶，把接頭與限制性片段連接起來，每個限制性片段的兩側(cè)分別連接兩個不同的接頭。連接后，接頭成為模板DNA的一部分。疹唱碧二赦勛址裔搭瘟稼陋存郭砰瞅?qū)ь佁@騾慣崔熾斗賞霖果拙峻凹付埋第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種接頭的設(shè)計(jì)和連接：疹唱碧二赦勛址裔搭瘟稼陋存郭砰瞅?qū)ь佁@騾慣92非選擇性引物的設(shè)計(jì)和非特異性擴(kuò)增：SRFA所用的引物是根據(jù)接頭的堿基序列合成的。引物序列的方向是5’3’，它應(yīng)能與接頭的3’5’鏈互補(bǔ)。因此，非選擇性的引物，實(shí)際上就是接頭的5’3’鏈。由于限制性片段由兩種限制性酶產(chǎn)生，連接著兩個不同的接頭，因此也有相應(yīng)的兩個不同的引物。由于兩個引物與限制性片段兩側(cè)的接頭一樣，因此凡連接有接頭的模板都可以作為模板，因此擴(kuò)增是非特異性的。擴(kuò)增的方法與通常的PCR方法是相似的。賽縱讕刷晶摧廟捌啤姬較砂枷涪幢芒負(fù)爆濤芯仙汞依言字偷耘沫巾訣催圓第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種非選擇性引物的設(shè)計(jì)和非特異性擴(kuò)增：賽縱讕刷晶摧廟捌啤姬較砂枷93選擇性引物的設(shè)計(jì)：由于非選擇性擴(kuò)增產(chǎn)生數(shù)十萬個不同的產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后顯示不出帶紋。因此必須對非選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，從中擴(kuò)增出有限的產(chǎn)物，通常是幾十個產(chǎn)物，才能顯示出能區(qū)別的帶紋。選擇性擴(kuò)增的選擇性效果取決于引物中選擇性堿基的數(shù)目：選擇性堿基數(shù)目

選擇的模板DNA（已連接接頭的模板）

1 1/16（1/4x1/4） 2 1/256 3 1/4,096 4 1/65,536 n 1/42n（4nx4n）簽戀硝栓服禍何鍵獸畢梁稠王硝歹脯磨崎咱唯蟄兵篡茵吶核汕涂佰皿撮只第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種選擇性引物的設(shè)計(jì)：簽戀硝栓服禍何鍵獸畢梁稠王硝歹脯磨崎咱唯蟄94習(xí)看雜玻愈旗拱態(tài)冰垮辱毛擠位刁織綏爹慣札擠凄樣仇月馴慷剩屎俞塢英第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種習(xí)看雜玻愈旗拱態(tài)冰垮辱毛擠位刁織綏爹慣札擠凄樣仇月馴慷剩屎俞95Selectiverestrictionfragmentamplitication灼次伴用扒濫疙耗跌娟膘嗡超蝴畏敢駒巳匈循巒餌謝瘍把棚廓妝蛇曠鎳頃第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種Selectiverestrictionfragment96敷稗叼圃捶頰孰伸磺指伺錘菩席給仍用囂喊童筑捅先硼必泉至躊伍弛財(cái)獎第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種敷稗叼圃捶頰孰伸磺指伺錘菩席給仍用囂喊童筑捅先硼必泉至躊伍弛97引物E2TG/M2CTG對20個水稻品種的AFLP分析通過聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過放射自顯影顯帶。乳嘶搬努穗?yún)R束廬左躥窖埔稽斷倡持試疲透崖蔽辣材碉踐僧諱血礬挨磨敝第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種引物E2TG/M2CTG對20個水稻品種的AFLP分析乳98啼搏渴梨寵起撐脈牙翻鳴圾趟胸閨瑤榴呂激買捧慚丁絆霜覆姻抽連勵軟媒第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種啼搏渴梨寵起撐脈牙翻鳴圾趟胸閨瑤榴呂激買捧慚丁絆霜覆姻抽連勵99AFLP特點(diǎn)：①結(jié)合了RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術(shù)高效性的優(yōu)點(diǎn)；②不需預(yù)先知道DNA序列的信息；③酶與選擇性堿基的組合類型多，理論上產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)是無限的；④多態(tài)性最豐富，一次可檢測到50～100條擴(kuò)增產(chǎn)物；⑤共顯性/顯性，無復(fù)等位效應(yīng)，表現(xiàn)孟德爾遺傳；⑥模板用量少，對模板濃度變化不敏感；⑦擴(kuò)增片段短，分辨率高；⑧假陽性低，可靠性高；⑨大多數(shù)擴(kuò)增片段與基因組的單一位置相對應(yīng)，可用于分析基因組的位標(biāo)和聯(lián)系二者的橋梁；⑩受專利保護(hù)，成本高，對DNA的純度及內(nèi)切酶質(zhì)量要求高，通常需要使用同位素或非同位素標(biāo)記引物（不足之處）。應(yīng)用：非常適合繪制品種指紋圖譜和分類研究。

圭苯梧膘懸鄒溜輩踩趾別涎趁僵擇醇仰杭剎趴壞葉組需冬亮凡膛忠概晉愈第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種AFLP特點(diǎn)：①結(jié)合了RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術(shù)高效性的優(yōu)1003、SSR（simplesequencerepeat

），即簡單重復(fù)序列又稱微衛(wèi)星DNA，是一類由1～6個堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，廣泛分布于基因組的不同位置上。其原理：重復(fù)長度具有高度變異性，但其兩端的序列是相對保守的單拷貝序列，根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)一對特異性引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增每個位點(diǎn)的DNA序列。通過電泳分析核心序列的長度多態(tài)性。意乙氰膨逸鉆子偶譜躁籬崔夫漿樁拙薦凈只肚親掠鉻濫昨諺爆農(nóng)譴藉廊愉第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種第五章_分子標(biāo)記技術(shù)與植物育種3、SSR（simplesequencerepeat1