DNA體外酶切連接課件

DNA體外重組技術(shù)概述一、DNA重組技術(shù)相關(guān)概念

克隆(clone)來(lái)自于同一始祖的一群相同分子、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物（常被成為副本或拷貝）?？寺』?cloning)獲取大量單一拷貝的過(guò)程，也稱無(wú)性繁殖。DNA克隆(DNAcloning)應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來(lái)源的遺傳物質(zhì)（DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子（復(fù)制子)-重組DNA

。繼而通過(guò)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞。再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子的過(guò)程稱為DNA克隆，又稱為基因克隆(genecloning)或分子克隆(molecularcloning)。

二、DNA重組技術(shù)基本程序1.外源DNA（目的DNA）的獲取4.連接物（重組DNA)導(dǎo)入合適受體細(xì)胞3.目的DNA與載體的連接2.克隆載體的選擇與構(gòu)建5.重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

分、切、接、轉(zhuǎn)、篩供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。基因克隆簡(jiǎn)介

目的基因

載體

酶切，連接

重組基因

轉(zhuǎn)入

受體細(xì)胞篩選陽(yáng)性克隆

分切、接轉(zhuǎn)篩常用工具酶限制性內(nèi)切核酸酶：能夠識(shí)別和切割雙鏈DNA內(nèi)部特定核苷酸序列的一類核酸酶，簡(jiǎn)稱內(nèi)切酶。DNA連接酶：能夠在DNA雙鏈5’-磷酸基和3’-羥基之間形成3’,5’磷酸二酯鍵。封閉DNA的缺口或鏈接兩個(gè)DNA片段T4DNA連接酶來(lái)源于噬菌體

限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的命名屬名種名株名HindIII

HindIIIHaemophilusinfluenzae

d嗜血流感桿菌d株同一菌株中所含的多個(gè)不同的限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI等產(chǎn)生的5‘粘性末端’5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHPPvuII等產(chǎn)生的平頭末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作大部分II型核酸內(nèi)切酶需要相似的反應(yīng)條件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr酶切效率1U

核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量限制性核酸內(nèi)切酶II型限制性核酸內(nèi)切酶酶解反應(yīng)的操作II型核酸內(nèi)切酶的多酶聯(lián)合酶解：對(duì)鹽濃度要求相同的酶，原則上可以同時(shí)酶切，但應(yīng)注意：5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’BamHISmaI5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’5‘…GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT…3’3‘…CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA…5’DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵DNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknickDNA連接酶的基本性質(zhì)修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵T4-DNA連接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA連接酶DNA連接酶的反應(yīng)條件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA連接酶的酶活性：在最佳反應(yīng)條件下15℃反應(yīng)1小時(shí)，完全連接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量DNA連接酶平頭雙鏈DNA片段的連接操作從分子動(dòng)力學(xué)的角度講，由限制性核酸內(nèi)切酶創(chuàng)造的粘性末端的連接屬于分子內(nèi)部的連接，而平頭末端的連接則屬于分子間的連接，因此后者反應(yīng)速度要慢得多提高平頭末端連接效率的方法包括：加大連接酶用量（10倍大于粘性末端的連接）

加大平頭末端底物的濃度，增加分子間碰撞機(jī)會(huì)加入10%PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用加入單價(jià)陽(yáng)離子（NaCl），最終濃度150-200mMDNA連接酶

作為基因工程載體所需具備的基本條件：1.

帶有復(fù)制子，能在宿主細(xì)胞內(nèi)攜帶外源基因一同進(jìn)行復(fù)制。3.

具有多個(gè)篩選標(biāo)志：如抗藥基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷型、噬菌斑形成及顯色反應(yīng)等。2.

有單酶切位點(diǎn)、多克隆酶切位點(diǎn)(多種酶單一位點(diǎn))，供外源基因的插入。4.

表達(dá)型載體還應(yīng)有使外源基因表達(dá)的完整的轉(zhuǎn)錄單位：如強(qiáng)啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。質(zhì)粒載體：存在于細(xì)菌外且能獨(dú)立復(fù)制的雙鏈閉合環(huán)狀DNA分子克隆用質(zhì)粒載體表達(dá)用質(zhì)粒載體病毒載體：通過(guò)改造病毒基因組DNA，使其具有攜帶目的基因并且能夠在宿主細(xì)胞中包裝成病毒顆粒的DNA分子腺病毒載體、慢病毒載體、原核病毒載體（噬菌體）載體的功能及特征載體的功能運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細(xì)菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即cccDNA質(zhì)粒DNA的分子量范圍：1-300kb質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復(fù)制性質(zhì)粒能利用寄主細(xì)胞的DNA復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行自主復(fù)制質(zhì)粒DNA上的復(fù)制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對(duì)應(yīng)關(guān)系根據(jù)在每個(gè)細(xì)胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為兩大復(fù)制類型：嚴(yán)緊型復(fù)制控制的質(zhì)粒1-3拷貝stringentplasmid松弛型復(fù)制控制的質(zhì)粒10-60拷貝stringentplasmid質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性：分子機(jī)制兩種含有相似復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復(fù)制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復(fù)制時(shí)各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過(guò)若干復(fù)制周期和細(xì)胞分裂周期后仍能共處于同一細(xì)胞內(nèi)其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細(xì)胞分裂周期中更具優(yōu)勢(shì)質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒能在天然條件下自發(fā)地從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等如Col、R的其它成員非接合型質(zhì)粒不能在天然條件下獨(dú)立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個(gè)過(guò)程由bom和mob基因決定質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征攜帶特殊的遺傳標(biāo)記野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個(gè)或多個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長(zhǎng)非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機(jī)物物質(zhì)合成抗生素、細(xì)菌毒素、有機(jī)堿這些標(biāo)記基因?qū)NA重組分子的篩選具有重要意義質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標(biāo)記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎(chǔ)進(jìn)行人工構(gòu)建。目前實(shí)驗(yàn)室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個(gè)野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：pSC101

8.8kb拷貝數(shù)5四環(huán)素抗性標(biāo)記基因TcrColE16.5kb拷貝數(shù)20-30大腸桿菌內(nèi)毒素標(biāo)記基因E1RSF2124ColE1衍生質(zhì)粒氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因Apr質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復(fù)制pBR322：氯霉素可擴(kuò)增拷貝數(shù)50-100/cell用于基因克隆質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：拷貝數(shù)2000-3000/cell用于基因克隆和測(cè)序裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18/19：正選擇標(biāo)記lacZ’的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝裝有兩個(gè)噬菌體的強(qiáng)啟動(dòng)子裝有多克隆位點(diǎn)（MCS）正選擇顏色標(biāo)記lacZ’用于外源基因的高效表達(dá)注意：T7和SP6啟動(dòng)子特異性地由噬菌體DNA編碼的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識(shí)別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開(kāi)發(fā)成為基因工程的有用載體，因?yàn)椋焊咝实母腥拘阅苁雇庠椿蚋咝?dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增噬菌體或病毒DNA與動(dòng)植物受體細(xì)胞相適應(yīng)的載體一般選擇相應(yīng)動(dòng)植物的病

毒基因組DNA。動(dòng)植物病毒種類繁多，每一種動(dòng)植物都有多種特異性的病毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動(dòng)植物病毒分成四大類：?jiǎn)捂淒NA病毒雙鏈DNA病毒單鏈RNA病毒雙鏈RNA病毒RNA病毒在自我復(fù)制時(shí)大多存在相應(yīng)的DNA中間反應(yīng)物，這些中間體可作為載體進(jìn)行常規(guī)的DNA重組。

用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞各種基因工程受體的特性實(shí)驗(yàn)室常用的基因工程受體受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件限制性缺陷型外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）重組整合缺陷型用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞（recA-）具有較高的轉(zhuǎn)化效率具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型感染寄生缺陷型防止重組細(xì)菌擴(kuò)散污染，生物武器除外

各種基因工程受體的特性大腸桿菌遺傳背景清楚，載體受體系統(tǒng)完備，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，重組子穩(wěn)定適用于外源DNA的擴(kuò)增和克隆、原核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫(kù)的構(gòu)建，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要受體菌產(chǎn)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多的內(nèi)毒素各種基因工程受體的特性酵母菌具有真核生物的特征，遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，外源基因表達(dá)系統(tǒng)完善，遺傳穩(wěn)定適用于外源DNA的擴(kuò)增、克隆以及真核生物基因的高效表達(dá)、基因文庫(kù)的構(gòu)建、真核生物基因表達(dá)調(diào)控的研究，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程重要的真核性受體菌內(nèi)源性蛋白產(chǎn)物種類繁多且含量高各種基因工程受體的特性哺乳動(dòng)物細(xì)胞（中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞CHO）

與人的親緣關(guān)系近，分子重組表達(dá)系統(tǒng)健全，具有合適的糖基化修飾系統(tǒng)適用于哺乳類動(dòng)物和人的基因表達(dá)調(diào)控研究、基因藥物的生產(chǎn)，是DNA重組實(shí)驗(yàn)和基因工程的主要哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞培養(yǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)緩慢DNA重組前的準(zhǔn)備工作選擇載體的基本原則目的DNA片段大?。嘿|(zhì)粒容量小、病毒容量大明確重組目的：克隆載體、表達(dá)載體合適的克隆位點(diǎn)：酶切，先分析DNA片段酶切位點(diǎn)，再選擇合適載體載體的穩(wěn)定性：有的載體在37℃時(shí)會(huì)被宿主菌細(xì)胞中的酶降解磷酸二酯鍵的形成DNA連接酶DNA連接酶DNA連接酶DNA片段與載體的重組連接方式：

黏性末端的連接平頭末端的連接修飾黏性末端的連接

PCR產(chǎn)物的連接

Gateway載體構(gòu)建體系一、黏性末端的連接

黏性末端連接(Cohesiveendligation)：具有黏性末端的兩個(gè)雙鏈DNA分子在DNA連接酶的作用下,連接成為一個(gè)雜合雙鏈DNA。

1.同種酶產(chǎn)生的黏末端的連接優(yōu)點(diǎn)經(jīng)濟(jì)省時(shí)，操作方便；外源片段容易回收；問(wèn)題載體自身環(huán)化插入片段可雙向插入2.不同限制酶酶切產(chǎn)生黏末端的連接載體和目的基因分子上有兩個(gè)相同的酶切位點(diǎn)載體和目的基因只有一個(gè)相同的限制酶識(shí)別位點(diǎn)無(wú)相同的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，有同尾酶

SalⅠ片段（CAGCTG）XhoⅠ片段(GAGCTC)G3’CAGCT5’C3’GAGCT5’DNA連接酶討論：

連接后的重組分子還能被這兩種限制酶切割么？？二、平末端的連接

平末端連接(bluntendligation)：在T4DNA連接酶的作用下，將兩個(gè)具有平末端的雙鏈DNA分子連接成雜種DNA分子。平端連接