iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學課件

iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學主要內(nèi)容iTRAQ技術(shù)簡介iTRAQ試劑標記原理iTRAQ技術(shù)優(yōu)勢iTRAQ實驗流程iTRAQ實驗結(jié)果示例iTRAQ實驗詳細步驟iTRAQ技術(shù)簡介iTRAQ技術(shù)是由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(AppliedBiosystemsIncorporation，ABI)2004年開發(fā)的同重標簽標記的相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，iTRAQ)技術(shù)。iTRAQ試劑是可與氨基（包括氨基酸N端及賴氨酸側(cè)鏈氨基）連接的胺標記同重元素。在一級質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。在一級質(zhì)譜中，不同來源的相同肽段表現(xiàn)為一個峰；在二級質(zhì)譜中，iTRAQ試劑中的平衡基團發(fā)生中性丟失，信號離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(114～121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以得到同一蛋白在不同樣本中的表達差異；同時，肽段的MS/MS結(jié)果結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索可以鑒定出相應(yīng)的蛋白種類。5相關(guān)雜志對重復性要求※首選2-3次生物重復，最好3次或以上組內(nèi)樣品個體差異大的材料需要更多的生物重復生物學重復樣品較多時，可以適當混合以減少樣品數(shù)目無任何重復，可以結(jié)合其他技術(shù)進行驗證6建議iTRAQ試劑標記原理報告部分共有8種：質(zhì)量數(shù)分別為114~121Da，因此iTRAQ最多可同時標記8組樣品（客戶可按需選擇標記個數(shù)）。肽反應(yīng)部分：能與肽鏈N端及賴氨酸側(cè)鏈發(fā)生共價連接，從而將報告部分和平衡部位標記到肽段上，幾乎可以標記所有蛋白質(zhì)。平衡部分：質(zhì)量數(shù)分別為31~24Da，與報告部分相互配合，保證iTRAQ試劑標記的不同樣本的同一肽段具有相同的質(zhì)荷比。圖1iTRAQ技術(shù)原理圖iTRAQ實驗流程iTRAQ實驗流程。

1：收集不同組別的樣本并分別提取蛋白質(zhì)；

2：蛋白質(zhì)經(jīng)過還原，封閉后用胰蛋白酶酶切；

3：各組樣本的肽段混合物分別用不同的iTRAQ試劑標記；

4：等量混合各樣本中的標記肽段；

5：MS/MS質(zhì)譜檢測及分析。案例1：人腦脊液（客戶文章未發(fā)表，資料僅供內(nèi)部參考）實驗設(shè)計：1.客戶用ELISA方法檢測正常人與病患腦脊液中幾個細胞因子存在穩(wěn)定差異2.客戶提供4種不同患者腦脊液樣本進行iTRAQ檢測分析。3.首先對其中一例樣本進行SDS分析，可見腦脊液中存在高峰度蛋白。4.除去高峰度部分蛋白，其他條帶切膠合并酶切提取。（也可以使用商品化去除高峰度試劑盒，成本較高，效果也因人而異。）4組結(jié)果兩兩比較，篩選1.2倍以上差異，數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)交蓋圖數(shù)據(jù)分析GO富集分析通過生物信息學分析工具DAVID對鑒定蛋白進行GO（GeneOntology，詳細信息見網(wǎng)站：）功能注釋、功能富集分析及定位分析。（可按照客戶要求繪制餅圖等）數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析Pathway通路富集分析在生物體內(nèi)，存在著大量的代謝、調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導過程，這些過程往往形成一條條不同的通路（pathway），基于Pathway的分析有助于了解發(fā)生差異變化蛋白質(zhì)所的生物學進程位置。KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫（Kanehisa，2008），通過Pathway分析能確定蛋白質(zhì)參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導途徑。通路富集結(jié)果：數(shù)據(jù)分析采用DAVID在線工具對顯著差異表達蛋白進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。（PAHTWAY無顯著富集）客戶關(guān)注的信號通路（pathway）總結(jié)總結(jié)：iTRAQ技術(shù)及后期分析可以幫助客戶很好地驗證試驗猜想，以及為揭示蛋白表達變化原因提供可靠的方向指引。高階（客制化）信息分析詳見信息分析PDFiTRAQ詳細實驗步驟—ABI試劑盒iTRAQ詳細實驗步驟1：蛋白質(zhì)提取

可以選擇提取蛋白質(zhì)常用的各種溶液，裂解液里最好不要包括下面試劑，因為這些試劑會干擾iTRAQ試劑的標記反應(yīng)。iTRAQ詳細實驗步驟2：蛋白質(zhì)定量

(1)可以采用Bradford方法及其他方法定量初步

(2)定量取各組樣本的蛋白質(zhì)進行SDS-APGE電泳，銀染定量，根據(jù)每個涌道染色情況微調(diào)蛋白濃度，保證后續(xù)實驗中每組樣本的蛋白量相同。iTRAQ詳細實驗步驟3：酶切，標記每組樣本（各100μg）分別加入-20℃預冷的丙酮（丙酮：樣品體積比=6：1），顛倒混勻，-20℃沉淀30min~4h（根據(jù)樣品所需沉淀量選擇時間，一般開始時可選1小時）；12000rpm離心15分鐘，棄上清，用試劑盒中自帶的溶解液dissolutionbuffer（20μL）和1%SDS(1μL)充分混懸溶解樣品；加入還原試劑2μL，混勻，60℃反應(yīng)1h；加入半胱氨酸封閉試劑（cystineblockingregent）1μL,室溫處理10分鐘；按照酶：蛋白質(zhì)=1：20的比例加入trypsin酶,37℃酶解過夜（16h）；113,114,115,116,117,118,119,121各管標記試劑中加入50μL異丙醇(試劑盒中自帶），混勻，分別加入各管樣品中，室溫反應(yīng)1h，之后各加入3倍體積的水，使標記試劑分解。標記和樣品對應(yīng)關(guān)系如下:4R—117,未知—118，BOO6—119,11R—121；合并各管標記好的樣品，真空冷凍干燥。iTRAQ詳細實驗步驟4：除鹽，此步操作是將標記過程中的標記試劑和相關(guān)buffer的鹽除去，以便于后續(xù)分析。（1）100%乙腈沖洗柱子3次（2）0.1%TFA(水溶),沖洗柱子三次（3）用400uL0.1%TFA溶解樣品，加載到柱子上（4）0.1%TFA沖洗柱子3~5次（5）用50%乙腈0.1%TFA400μL洗脫下樣品（6）將樣品冷凍干燥后進行后續(xù)分析。iTRAQ詳細實驗步驟5:

第一維強陽離子柱(SCX)分離（1）儀器及試劑：<1>色譜儀20AD(島津)<2>真空離心濃縮機(ChristRVC2-25，Christ，Germany)

<3>磷酸二氫鉀(國藥集團)

<4>氯化鉀(國藥集團)

<5>乙腈ACN(Fisher)（2）具體操作參數(shù)柱子信息：Polysulfoethylcolumn,2.1mm*100mm,5u,200A,TheNestGroup,Inc.MAA相：10mMKH2PO4，25%CAN，PH2.6B相：10mMKH2PO4，350mMKCl，25%ACN，PH2.6

紫外檢測波長：214nm/280nm

流速：200μL/min

梯度：60minB%從5分鐘5%到40分鐘上升至25%Time(min)B%0 05 540254580508051060stop根據(jù)峰型和時間共收取20個梯度,真空離心濃縮后，用50μLRPLCA相[5%ACN,0.1%甲酸(TEDIA,Fairfield,USA)]溶解，進行第二維分析。iTRAQ詳細實驗步驟6:

第二維反相液質(zhì)聯(lián)用RPLC-MS（1）儀器及試劑<1>色譜儀20AD(島津)<2>質(zhì)譜儀QSTARXL（AppliedBiosystem,USA）<3>乙腈ACN(Fisher)<4>甲酸（TEDIA）（2）具體操作參數(shù)反相柱信息：ZORBAX300SB-C18column(5μm,300A,0.1x150mm，microm,USA)

色譜分離90min，梯度B%從5分鐘5%到70分鐘上升至35%。A相：5%ACN,0.1%甲酸

B相：95%ACN,0.1%甲酸流速：300nL/min

Time(min)B%55%9035%9580%10080%1055%120stop