藥品質(zhì)量控制中的生物檢定課件

藥品質(zhì)量控制中的生物檢定上海市食品藥品檢驗(yàn)所藥理毒理室/藥物安全評(píng)價(jià)中心主任唐黎明藥品質(zhì)量控制中的生物檢定藥品質(zhì)量控制中的生物檢定一、藥品質(zhì)量控制中的生物檢定概述二、效價(jià)測(cè)定的基本原理和技術(shù)要求三、生物檢定中安全性檢查制定原則四、安全性檢查的基本原理和技術(shù)要求五、生物檢定的發(fā)展藥品質(zhì)量控制中的生物檢定一、藥品質(zhì)量控制中的生物檢定概述

一、藥品質(zhì)量控制中的生物檢定概述

生物檢定（bioassay）的定義

生物檢定法是利用生物體包括整體、離體組織、器官、細(xì)胞和微生物等評(píng)估藥物生物活性的一種方法。它以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在一定條件下比較供試品和相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌匪a(chǎn)生的特定反應(yīng)，通過(guò)等反應(yīng)劑量間比例的運(yùn)算或限值劑量引起的生物反應(yīng)程度，從而測(cè)定供試品的效價(jià)、生物活性或雜質(zhì)引起的毒性。

一、藥品質(zhì)量控制中的生物檢定概述

生物檢定（bioass產(chǎn)品生物活性的信息（

與臨床療效一致）評(píng)價(jià)批與批之間穩(wěn)定性和一致性監(jiān)測(cè)不曾預(yù)料、不易發(fā)現(xiàn)的構(gòu)象變化所有變化的綜合效應(yīng)工藝與方法驗(yàn)證一、概述：作用

產(chǎn)品生物活性的信息（與臨床療效一致）一、概述：作用

藥品質(zhì)量控制項(xiàng)目性狀、鑒別、檢查和含量生物檢定------檢查類(lèi)和含量類(lèi)。藥品（生化藥品、中藥）生物制品（疫苗、血液制品）

一、概述：應(yīng)用范圍

藥品質(zhì)量控制項(xiàng)目

一、概述：應(yīng)用范圍

體內(nèi)檢測(cè)：以整體動(dòng)物為生物體，能反映藥物對(duì)人體的作用方式，是最經(jīng)典的生物效價(jià)檢測(cè)方法體內(nèi)測(cè)定法的有蛋白質(zhì)、肽類(lèi)激素等

一、概述：生物檢定的方法體內(nèi)檢測(cè)：

一、概

體外檢測(cè)離體動(dòng)物器官測(cè)定法細(xì)胞培養(yǎng)（促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、間接保護(hù)細(xì)胞）測(cè)定法生化酶促反應(yīng)測(cè)定法免疫學(xué)活性測(cè)定法

一、概述：生物檢定的方法

體外檢測(cè)

一、概述：定性（鑒別）

對(duì)能用理化方法測(cè)定的藥品，生物效價(jià)檢測(cè)可降為鑒別項(xiàng)的定性測(cè)定

一、概述：生物檢定的方法定性（鑒別）

一、概述：生半定量法（活性檢查）理化測(cè)定占主導(dǎo)地位效價(jià)測(cè)定可歸于活性檢查項(xiàng)采用半定量方法設(shè)定限值，不需精密生物統(tǒng)計(jì)盡可能減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或其他生物體用量

一、概述：生物檢定的方法

半定量法（活性檢查）

一、概述：生物定量法效價(jià)（potency）測(cè)定是生物檢定的主要內(nèi)容

一、概述：生物檢定的方法定量法

一二、效價(jià)測(cè)定的基本要求和基本方法二、效價(jià)測(cè)定的基本要求和基本方法二、效價(jià)測(cè)定的基本要求原則：相關(guān)性重復(fù)性靈敏性適用性定性定量二、效價(jià)測(cè)定的基本要求原則：二、效價(jià)測(cè)定的基本要求

生物檢定標(biāo)準(zhǔn)品(Ｓ)標(biāo)準(zhǔn)品都有標(biāo)示效價(jià)，以效價(jià)單位（u）表示，其含義和相應(yīng)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)單位一致二、效價(jià)測(cè)定的基本要求生物檢定標(biāo)準(zhǔn)品(Ｓ)二、效價(jià)測(cè)定的基本要求實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與生物統(tǒng)計(jì)：

等反應(yīng)劑量對(duì)比可靠性測(cè)驗(yàn)

可信限和可信限率二、效價(jià)測(cè)定的基本要求實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與生物統(tǒng)計(jì)：二、效價(jià)測(cè)定的基本方法直接測(cè)定法：直接測(cè)得藥物對(duì)各個(gè)動(dòng)物最小有效量或最小致死量的檢定方法洋地黃及其制劑的效價(jià)測(cè)定------鴿最小致死量法二、效價(jià)測(cè)定的基本方法二、效價(jià)測(cè)定的基本方法量反應(yīng)平行線測(cè)定法：要求在一定劑量范圍內(nèi)，S和T的對(duì)數(shù)劑量x和反應(yīng)或反應(yīng)的特定函數(shù)y呈直線關(guān)系當(dāng)S和T的活性組分基本相同時(shí)，兩直線平行二、效價(jià)測(cè)定的基本方法量反應(yīng)平三、生物檢定中安全性檢查制定原則

三、生物檢定中安全性檢查制定原則

三、安全性檢查制定原則1.靜脈注射細(xì)菌內(nèi)毒素（或熱原）三、安全性檢查制定原則1三、安全性檢查制定原則1.靜脈注射異常毒性檢查所用原料系動(dòng)物來(lái)源或微生物發(fā)酵液提取物，組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染毒性雜質(zhì)，且又缺乏有效的理化分析方法的靜脈用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)立異常毒性檢查三、安全性檢查制定原則三、安全性檢查制定原則1.靜脈注射過(guò)敏反應(yīng)檢查所用原料系動(dòng)物來(lái)源或微生物發(fā)酵提取物時(shí)，組分結(jié)構(gòu)不清晰，且有可能污染異源蛋白或未知過(guò)敏反應(yīng)物質(zhì)的靜脈用注射劑，如缺乏相關(guān)的理化分析方法且臨床發(fā)現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，應(yīng)考慮設(shè)立過(guò)敏反應(yīng)檢查項(xiàng)三、安全性檢查制定原則三、安全性檢查制定原則1.靜脈注射降壓物質(zhì)或組胺類(lèi)物質(zhì)所用原料系動(dòng)物來(lái)源或微生物發(fā)酵提取物時(shí),組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染組胺、類(lèi)組胺樣降血壓物質(zhì)的靜脈用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)立降壓物質(zhì)或組胺類(lèi)物質(zhì)檢查項(xiàng)三、安全性檢查制定原則三、安全性檢查制定原則2.肌內(nèi)注射異常毒性檢查過(guò)敏反應(yīng)檢查細(xì)菌內(nèi)毒素檢查臨床用藥劑量較大，生產(chǎn)工藝易污染細(xì)菌內(nèi)毒素的肌內(nèi)注射用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)三、安全性檢查制定原則2三、安全性檢查制定原則3.特殊途徑的注射劑椎管內(nèi)、腹腔、眼內(nèi)等特殊途徑的注射劑，其安全性檢查項(xiàng)目一般應(yīng)符合靜脈用注射劑的要求必要時(shí)增加其它安全性檢查項(xiàng)目，如刺激性檢查、細(xì)胞毒性檢查三、安全性檢查制定原則3.特殊三、安全性檢查制定原則4.注射劑輔料注射劑輔料使用面廣，用量大，來(lái)源復(fù)雜，與藥品的安全性直接相關(guān)應(yīng)根據(jù)輔料來(lái)源、性質(zhì)、用途、用法用量，配合理化分析方法，設(shè)立必要的安全性檢查項(xiàng)目三、安全性檢查制定原則三、安全性檢查制定原則5.其它原料和生產(chǎn)工藝特殊的注射劑必要時(shí)應(yīng)增加特殊的安全性檢查項(xiàng)目，如病毒檢查、細(xì)胞毒性檢查等三、安全性檢查制定原則三、安全性檢查制定原則

中藥注射劑安全性檢查項(xiàng)目熱原（或細(xì)菌內(nèi)毒素）異常毒性過(guò)敏反應(yīng)溶血與凝聚降壓物質(zhì)檢查（功能主治中具有與升壓相關(guān)內(nèi)容的注射劑除外）三、安全性檢查制定原則

中藥注射劑安全性檢查項(xiàng)目熱原（或細(xì)菌三、安全性檢查制定原則方法適用性（設(shè)定限值前研究）確定限值應(yīng)進(jìn)行三批以上供試品的檢查驗(yàn)證三、安全性檢查制定原則方法適用性（設(shè)定限值前研究）四、安全性檢查的基本原理和技術(shù)要求四、安全性檢查的基本原理和技術(shù)要求（一）熱原檢查法本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定（一）熱原檢查法本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，（一）熱原檢查法動(dòng)物：家兔，健康合格，體重1.7kg以上體溫：38.0~39.6℃的范圍內(nèi)，且最高與最低體溫相差不超過(guò)0.4℃的家兔結(jié)果判斷：＜0.6℃總和＜1.3℃（一）熱原檢查法動(dòng)物：家兔，健康合格，體重1.7kg以上（一）熱原檢查法熱原檢查限值的確定一般為人用每公斤體重每小時(shí)最大供試品劑量的3～5倍供試品注射體積每公斤體重一般不少于0.5mL，不超過(guò)10mL限值劑量應(yīng)不影響正常體溫（一）熱原檢查法熱原檢查限值的確定（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的分類(lèi)①定性法：凝膠法②半定量法：凝膠半定量試驗(yàn)③定量法：光度測(cè)定法濁度法（終點(diǎn)濁度法、動(dòng)態(tài)濁度法）顯色基質(zhì)法（終點(diǎn)顯色法、動(dòng)態(tài)顯色法）（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的分類(lèi)（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法確定內(nèi)毒素限值L=K/ML為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值M為人用每公斤體重或每平方米每小時(shí)的臨床最大用藥劑量注射劑K=5EU/（kg·h）放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kg·h）鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/（kg·h）K=194EU/（m2·h）（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法確定內(nèi)毒素限值（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法干擾試驗(yàn)新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法干擾試驗(yàn)（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法凝膠法凝膠法系通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來(lái)檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素的方法（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法凝膠法（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法光度測(cè)定法濁度法利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法終點(diǎn)濁度法動(dòng)態(tài)濁度法（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法光度測(cè)定法

（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法光度測(cè)定法顯色基質(zhì)法利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法終點(diǎn)顯色法動(dòng)態(tài)顯色法（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法光度測(cè)定法（三）異常毒性檢查法本法系給予小鼠一定劑量的供試品溶液，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)觀察小鼠出現(xiàn)的死亡情況，以判定供試品是否符合規(guī)定的一種方法（三）異常毒性檢查法本法系給予小鼠一定劑量的供試品溶液，在規(guī)（三）異常毒性檢查法小鼠，體重17～20g，5只

分別給予供試品溶液0.5ml結(jié)果判斷全部小鼠在給藥后48小時(shí)內(nèi)不得有死亡（三）異常毒性檢查法小鼠，體重17～20g，5只

分別給予供（三）異常毒性檢查法限值確定急性毒性數(shù)據(jù)（LD50或LD1）限值至少應(yīng)小于LD1可信限下限的1/3（建議采用1/3～1/6）靜脈注射最大劑量0.8ml/20g仍未見(jiàn)毒性反應(yīng)或死亡，可以此作為檢查限值（三）異常毒性檢查法限值確定

（四）溶血與凝聚檢查法本法系將一定量供試品與2%的家兔紅細(xì)胞混懸液混合，溫育一定時(shí)間后，觀察其對(duì)紅細(xì)胞狀態(tài)是否產(chǎn)生影響的一種方法（四）溶血與凝聚檢查法本法系將一定量供試品與2%的家兔紅細(xì)

（四）溶血與凝聚檢查法結(jié)果判斷當(dāng)陰性對(duì)照管無(wú)溶血和凝聚發(fā)生，陽(yáng)性對(duì)照管有溶血發(fā)生，若供試品管中的溶液在3小時(shí)內(nèi)不發(fā)生溶血和凝聚，判定供試品符合規(guī)定；若供試品管的溶液在3小時(shí)內(nèi)發(fā)生溶血和（或）凝聚，判供試品不符合規(guī)定（四）溶血與凝聚檢查法

（四）溶血與凝聚檢查法限值一般對(duì)注射劑原液和稀釋液進(jìn)行溶血與凝聚實(shí)驗(yàn)研究一般應(yīng)高于臨床最大使用濃度（四）溶血與凝聚檢查法限值

（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法

本法系將一定量的供試品溶液注入豚鼠體內(nèi)，間隔一定時(shí)間后靜脈注射供試品溶液進(jìn)行激發(fā)，觀察動(dòng)物出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)的情況，以判定供試品是否引起動(dòng)物全身過(guò)敏反應(yīng)（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法

本法系將一定量的供試品溶液注入豚鼠體

（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法檢查法

豚鼠6只，隔日每只每次腹腔注射供試品溶液0.5ml，共3次，進(jìn)行致敏均分為2組，每組3只，分別在首次注射后第14日和第21日，由靜脈注射供試品溶液1ml進(jìn)行攻擊（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法

（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法結(jié)果判斷

靜脈注射供試品溶液30分鐘內(nèi)，不得出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。如有豎毛、發(fā)抖、干嘔、連續(xù)噴嚏3聲、連續(xù)咳嗽3聲、紫疳和呼吸困難等現(xiàn)象中的2種或2種以上，或出現(xiàn)二便失禁、步態(tài)不穩(wěn)或倒地、抽搐、休克、死亡現(xiàn)象之一者，判供試品不符合規(guī)定（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法結(jié)果判斷

（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法限值確定測(cè)定供試品對(duì)豚鼠腹腔（或皮下）和靜脈給藥的無(wú)毒性反應(yīng)劑量在首次給藥后14、21、28天中選擇最佳激發(fā)時(shí)間致敏和激發(fā)劑量應(yīng)小于該途徑的急性毒性反應(yīng)劑量,適當(dāng)參考臨床劑量一般激發(fā)劑量大于致敏劑量（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法限值確定

（六）降壓物質(zhì)檢查法

本法系比較組胺對(duì)照品（S）與供試品（T）引起麻醉貓血壓下降的程度，以判定供試品中所含降壓物質(zhì)的限度是否符合規(guī)定

（六）降壓物質(zhì)檢查法

本法系比較組胺對(duì)照品（S）與供試品

（六）降壓物質(zhì)檢查法方法：體重2kg以上的貓供試品按一定注射速度靜脈注射不同劑量，觀察供試品對(duì)貓血壓反應(yīng)的劑量反應(yīng)關(guān)系（六）降壓物質(zhì)檢查法方法：

（六）降壓物質(zhì)檢查法結(jié)果判斷

dT反應(yīng)平均值不大于ds反應(yīng)平均值，并且dT反應(yīng)平均值任何一次反應(yīng)值不大于組胺高劑量反應(yīng)值，即判定供試品降壓物質(zhì)檢查符合規(guī)定（六）降壓物質(zhì)檢查法結(jié)果判斷

（六）降壓物質(zhì)檢查法限值和要求供試品與對(duì)照品注射體積應(yīng)相同，通常為0.1～1ml/kg臨床單次用藥劑量的1/5～5倍作為降壓反應(yīng)物質(zhì)檢查劑量限值如供試品有一定降壓作用，則可按最大無(wú)降壓反應(yīng)劑量的1/2-1/4作為限值劑量供試品原液靜脈注射1ml/kg劑量未見(jiàn)降壓反應(yīng)，該劑量可作為給藥限值（六）降壓物質(zhì)檢查法限值和要求

（七）組胺檢查法本法系將一定濃度的供試品和組胺對(duì)照品分別觀察豚鼠離體回腸出現(xiàn)的收縮反應(yīng)幅度并加以比較，以判定供試品是否符合規(guī)定的一種方法（七）組胺檢查法本法系將一定濃度的供試品和組胺對(duì)照品分別觀五、生物檢定的發(fā)展五、生物檢定的發(fā)展

（一）現(xiàn)狀

生物檢定的優(yōu)缺點(diǎn)生測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)：

生測(cè)法的缺點(diǎn)：

（一）現(xiàn)狀

生物檢（二）效價(jià)測(cè)定品種和范圍的變化

1．儀器的改進(jìn)2．抗生素的含量測(cè)定3．刪除生物檢定品種4．取消的生物效價(jià)測(cè)定5．簡(jiǎn)化與減少6．需要改進(jìn)提高的生化藥品種（二）效價(jià)測(cè)定品種和范圍的變化1．儀器的改進(jìn)（三）安全性檢查的變化細(xì)菌內(nèi)毒素替代家兔熱原檢查增訂異常毒性增訂過(guò)敏反應(yīng)增訂無(wú)菌/微生物限度增訂降壓物質(zhì)檢查增訂制法要求和特殊的安全性檢查（三）安全性檢查的變化細(xì)菌內(nèi)毒素替代家兔熱原檢查

（四）中藥質(zhì)量控制體系中生物檢定的應(yīng)用不應(yīng)苛求中藥生物檢定指標(biāo)的代表性不要以理化檢定的方法學(xué)質(zhì)量苛求中藥生物檢定方法中藥質(zhì)量生物檢定不等于中藥藥理實(shí)驗(yàn)須具備定量藥理學(xué)與藥檢分析的雙重屬性和要求（四）中藥質(zhì)量控制體系中生物檢定的應(yīng)用不應(yīng)苛求中藥生物檢定

（四）中藥質(zhì)量控制體系中生物檢定的應(yīng)用存在的問(wèn)題應(yīng)用的局限性造模型的選擇：功能主治多成本高，時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)生物誤差較大對(duì)照品的選擇難度（四）中藥質(zhì)量控制體系中生物檢定的應(yīng)用存在的問(wèn)題藥品質(zhì)量控制中的生物檢定上海市食品藥品檢驗(yàn)所藥理毒理室/藥物安全評(píng)價(jià)中心主任唐黎明藥品質(zhì)量控制中的生物檢定藥品質(zhì)量控制中的生物檢定一、藥品質(zhì)量控制中的生物檢定概述二、效價(jià)測(cè)定的基本原理和技術(shù)要求三、生物檢定中安全性檢查制定原則四、安全性檢查的基本原理和技術(shù)要求五、生物檢定的發(fā)展藥品質(zhì)量控制中的生物檢定一、藥品質(zhì)量控制中的生物檢定概述

一、藥品質(zhì)量控制中的生物檢定概述

生物檢定（bioassay）的定義

生物檢定法是利用生物體包括整體、離體組織、器官、細(xì)胞和微生物等評(píng)估藥物生物活性的一種方法。它以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在一定條件下比較供試品和相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌匪a(chǎn)生的特定反應(yīng)，通過(guò)等反應(yīng)劑量間比例的運(yùn)算或限值劑量引起的生物反應(yīng)程度，從而測(cè)定供試品的效價(jià)、生物活性或雜質(zhì)引起的毒性。

一、藥品質(zhì)量控制中的生物檢定概述

生物檢定（bioass產(chǎn)品生物活性的信息（

與臨床療效一致）評(píng)價(jià)批與批之間穩(wěn)定性和一致性監(jiān)測(cè)不曾預(yù)料、不易發(fā)現(xiàn)的構(gòu)象變化所有變化的綜合效應(yīng)工藝與方法驗(yàn)證一、概述：作用

產(chǎn)品生物活性的信息（與臨床療效一致）一、概述：作用

藥品質(zhì)量控制項(xiàng)目性狀、鑒別、檢查和含量生物檢定------檢查類(lèi)和含量類(lèi)。藥品（生化藥品、中藥）生物制品（疫苗、血液制品）

一、概述：應(yīng)用范圍

藥品質(zhì)量控制項(xiàng)目

一、概述：應(yīng)用范圍

體內(nèi)檢測(cè)：以整體動(dòng)物為生物體，能反映藥物對(duì)人體的作用方式，是最經(jīng)典的生物效價(jià)檢測(cè)方法體內(nèi)測(cè)定法的有蛋白質(zhì)、肽類(lèi)激素等

一、概述：生物檢定的方法體內(nèi)檢測(cè)：

一、概

體外檢測(cè)離體動(dòng)物器官測(cè)定法細(xì)胞培養(yǎng)（促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、間接保護(hù)細(xì)胞）測(cè)定法生化酶促反應(yīng)測(cè)定法免疫學(xué)活性測(cè)定法

一、概述：生物檢定的方法

體外檢測(cè)

一、概述：定性（鑒別）

對(duì)能用理化方法測(cè)定的藥品，生物效價(jià)檢測(cè)可降為鑒別項(xiàng)的定性測(cè)定

一、概述：生物檢定的方法定性（鑒別）

一、概述：生半定量法（活性檢查）理化測(cè)定占主導(dǎo)地位效價(jià)測(cè)定可歸于活性檢查項(xiàng)采用半定量方法設(shè)定限值，不需精密生物統(tǒng)計(jì)盡可能減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或其他生物體用量

一、概述：生物檢定的方法

半定量法（活性檢查）

一、概述：生物定量法效價(jià)（potency）測(cè)定是生物檢定的主要內(nèi)容

一、概述：生物檢定的方法定量法

一二、效價(jià)測(cè)定的基本要求和基本方法二、效價(jià)測(cè)定的基本要求和基本方法二、效價(jià)測(cè)定的基本要求原則：相關(guān)性重復(fù)性靈敏性適用性定性定量二、效價(jià)測(cè)定的基本要求原則：二、效價(jià)測(cè)定的基本要求

生物檢定標(biāo)準(zhǔn)品(Ｓ)標(biāo)準(zhǔn)品都有標(biāo)示效價(jià)，以效價(jià)單位（u）表示，其含義和相應(yīng)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)單位一致二、效價(jià)測(cè)定的基本要求生物檢定標(biāo)準(zhǔn)品(Ｓ)二、效價(jià)測(cè)定的基本要求實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與生物統(tǒng)計(jì)：

等反應(yīng)劑量對(duì)比可靠性測(cè)驗(yàn)

可信限和可信限率二、效價(jià)測(cè)定的基本要求實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與生物統(tǒng)計(jì)：二、效價(jià)測(cè)定的基本方法直接測(cè)定法：直接測(cè)得藥物對(duì)各個(gè)動(dòng)物最小有效量或最小致死量的檢定方法洋地黃及其制劑的效價(jià)測(cè)定------鴿最小致死量法二、效價(jià)測(cè)定的基本方法二、效價(jià)測(cè)定的基本方法量反應(yīng)平行線測(cè)定法：要求在一定劑量范圍內(nèi)，S和T的對(duì)數(shù)劑量x和反應(yīng)或反應(yīng)的特定函數(shù)y呈直線關(guān)系當(dāng)S和T的活性組分基本相同時(shí)，兩直線平行二、效價(jià)測(cè)定的基本方法量反應(yīng)平三、生物檢定中安全性檢查制定原則

三、生物檢定中安全性檢查制定原則

三、安全性檢查制定原則1.靜脈注射細(xì)菌內(nèi)毒素（或熱原）三、安全性檢查制定原則1三、安全性檢查制定原則1.靜脈注射異常毒性檢查所用原料系動(dòng)物來(lái)源或微生物發(fā)酵液提取物，組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染毒性雜質(zhì)，且又缺乏有效的理化分析方法的靜脈用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)立異常毒性檢查三、安全性檢查制定原則三、安全性檢查制定原則1.靜脈注射過(guò)敏反應(yīng)檢查所用原料系動(dòng)物來(lái)源或微生物發(fā)酵提取物時(shí)，組分結(jié)構(gòu)不清晰，且有可能污染異源蛋白或未知過(guò)敏反應(yīng)物質(zhì)的靜脈用注射劑，如缺乏相關(guān)的理化分析方法且臨床發(fā)現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，應(yīng)考慮設(shè)立過(guò)敏反應(yīng)檢查項(xiàng)三、安全性檢查制定原則三、安全性檢查制定原則1.靜脈注射降壓物質(zhì)或組胺類(lèi)物質(zhì)所用原料系動(dòng)物來(lái)源或微生物發(fā)酵提取物時(shí),組分結(jié)構(gòu)不清晰或有可能污染組胺、類(lèi)組胺樣降血壓物質(zhì)的靜脈用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)立降壓物質(zhì)或組胺類(lèi)物質(zhì)檢查項(xiàng)三、安全性檢查制定原則三、安全性檢查制定原則2.肌內(nèi)注射異常毒性檢查過(guò)敏反應(yīng)檢查細(xì)菌內(nèi)毒素檢查臨床用藥劑量較大，生產(chǎn)工藝易污染細(xì)菌內(nèi)毒素的肌內(nèi)注射用注射劑，應(yīng)考慮設(shè)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)三、安全性檢查制定原則2三、安全性檢查制定原則3.特殊途徑的注射劑椎管內(nèi)、腹腔、眼內(nèi)等特殊途徑的注射劑，其安全性檢查項(xiàng)目一般應(yīng)符合靜脈用注射劑的要求必要時(shí)增加其它安全性檢查項(xiàng)目，如刺激性檢查、細(xì)胞毒性檢查三、安全性檢查制定原則3.特殊三、安全性檢查制定原則4.注射劑輔料注射劑輔料使用面廣，用量大，來(lái)源復(fù)雜，與藥品的安全性直接相關(guān)應(yīng)根據(jù)輔料來(lái)源、性質(zhì)、用途、用法用量，配合理化分析方法，設(shè)立必要的安全性檢查項(xiàng)目三、安全性檢查制定原則三、安全性檢查制定原則5.其它原料和生產(chǎn)工藝特殊的注射劑必要時(shí)應(yīng)增加特殊的安全性檢查項(xiàng)目，如病毒檢查、細(xì)胞毒性檢查等三、安全性檢查制定原則三、安全性檢查制定原則

中藥注射劑安全性檢查項(xiàng)目熱原（或細(xì)菌內(nèi)毒素）異常毒性過(guò)敏反應(yīng)溶血與凝聚降壓物質(zhì)檢查（功能主治中具有與升壓相關(guān)內(nèi)容的注射劑除外）三、安全性檢查制定原則

中藥注射劑安全性檢查項(xiàng)目熱原（或細(xì)菌三、安全性檢查制定原則方法適用性（設(shè)定限值前研究）確定限值應(yīng)進(jìn)行三批以上供試品的檢查驗(yàn)證三、安全性檢查制定原則方法適用性（設(shè)定限值前研究）四、安全性檢查的基本原理和技術(shù)要求四、安全性檢查的基本原理和技術(shù)要求（一）熱原檢查法本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱原的限度是否符合規(guī)定（一）熱原檢查法本法系將一定劑量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，（一）熱原檢查法動(dòng)物：家兔，健康合格，體重1.7kg以上體溫：38.0~39.6℃的范圍內(nèi)，且最高與最低體溫相差不超過(guò)0.4℃的家兔結(jié)果判斷：＜0.6℃總和＜1.3℃（一）熱原檢查法動(dòng)物：家兔，健康合格，體重1.7kg以上（一）熱原檢查法熱原檢查限值的確定一般為人用每公斤體重每小時(shí)最大供試品劑量的3～5倍供試品注射體積每公斤體重一般不少于0.5mL，不超過(guò)10mL限值劑量應(yīng)不影響正常體溫（一）熱原檢查法熱原檢查限值的確定（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的分類(lèi)①定性法：凝膠法②半定量法：凝膠半定量試驗(yàn)③定量法：光度測(cè)定法濁度法（終點(diǎn)濁度法、動(dòng)態(tài)濁度法）顯色基質(zhì)法（終點(diǎn)顯色法、動(dòng)態(tài)顯色法）（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的分類(lèi)（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法確定內(nèi)毒素限值L=K/ML為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值M為人用每公斤體重或每平方米每小時(shí)的臨床最大用藥劑量注射劑K=5EU/（kg·h）放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kg·h）鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/（kg·h）K=194EU/（m2·h）（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法確定內(nèi)毒素限值（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法干擾試驗(yàn)新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前建立內(nèi)毒素檢查法時(shí)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法干擾試驗(yàn)（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法凝膠法凝膠法系通過(guò)鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來(lái)檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素的方法（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法凝膠法（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法光度測(cè)定法濁度法利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法終點(diǎn)濁度法動(dòng)態(tài)濁度法（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法光度測(cè)定法

（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法光度測(cè)定法顯色基質(zhì)法利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法終點(diǎn)顯色法動(dòng)態(tài)顯色法（二）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法光度測(cè)定法（三）異常毒性檢查法本法系給予小鼠一定劑量的供試品溶液，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)觀察小鼠出現(xiàn)的死亡情況，以判定供試品是否符合規(guī)定的一種方法（三）異常毒性檢查法本法系給予小鼠一定劑量的供試品溶液，在規(guī)（三）異常毒性檢查法小鼠，體重17～20g，5只

分別給予供試品溶液0.5ml結(jié)果判斷全部小鼠在給藥后48小時(shí)內(nèi)不得有死亡（三）異常毒性檢查法小鼠，體重17～20g，5只

分別給予供（三）異常毒性檢查法限值確定急性毒性數(shù)據(jù)（LD50或LD1）限值至少應(yīng)小于LD1可信限下限的1/3（建議采用1/3～1/6）靜脈注射最大劑量0.8ml/20g仍未見(jiàn)毒性反應(yīng)或死亡，可以此作為檢查限值（三）異常毒性檢查法限值確定

（四）溶血與凝聚檢查法本法系將一定量供試品與2%的家兔紅細(xì)胞混懸液混合，溫育一定時(shí)間后，觀察其對(duì)紅細(xì)胞狀態(tài)是否產(chǎn)生影響的一種方法（四）溶血與凝聚檢查法本法系將一定量供試品與2%的家兔紅細(xì)

（四）溶血與凝聚檢查法結(jié)果判斷當(dāng)陰性對(duì)照管無(wú)溶血和凝聚發(fā)生，陽(yáng)性對(duì)照管有溶血發(fā)生，若供試品管中的溶液在3小時(shí)內(nèi)不發(fā)生溶血和凝聚，判定供試品符合規(guī)定；若供試品管的溶液在3小時(shí)內(nèi)發(fā)生溶血和（或）凝聚，判供試品不符合規(guī)定（四）溶血與凝聚檢查法

（四）溶血與凝聚檢查法限值一般對(duì)注射劑原液和稀釋液進(jìn)行溶血與凝聚實(shí)驗(yàn)研究一般應(yīng)高于臨床最大使用濃度（四）溶血與凝聚檢查法限值

（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法

本法系將一定量的供試品溶液注入豚鼠體內(nèi)，間隔一定時(shí)間后靜脈注射供試品溶液進(jìn)行激發(fā)，觀察動(dòng)物出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)的情況，以判定供試品是否引起動(dòng)物全身過(guò)敏反應(yīng)（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法

本法系將一定量的供試品溶液注入豚鼠體

（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法檢查法

豚鼠6只，隔日每只每次腹腔注射供試品溶液0.5ml，共3次，進(jìn)行致敏均分為2組，每組3只，分別在首次注射后第14日和第21日，由靜脈注射供試品溶液1ml進(jìn)行攻擊（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法

（五）過(guò)敏反應(yīng)檢查法結(jié)果判斷

靜脈注射供試品溶液30分鐘內(nèi)，不得出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)。如有豎毛、發(fā)抖、干嘔、連續(xù)噴嚏3聲、連續(xù)咳嗽3聲、紫疳和呼吸困難等現(xiàn)象中的2種或2種以上，或出現(xiàn)二便失禁、步態(tài)不穩(wěn)或倒地、抽搐、休克、死亡現(xiàn)象之一者，判供試品不符合