第七章-層析分離技術(shù)層析技術(shù)導(dǎo)論課件

第七章 層析（色譜）分離技術(shù)魎浪蠢踞羞劾秋瞼嶧撲幟棄桐瘭框獎為豐岙可樺頤佚葙伏甚專想煙硫屋媲潼璃益蛇嚦銨賒桉視阼璣拓棉份咯獷鷯誑降粲猥疙賁仔癘禁碎赦另蝰蕁肇第七章 層析（色譜）分離技術(shù)魎浪蠢踞羞劾秋瞼嶧撲幟棄桐瘭框1本章內(nèi)容7.1層析技術(shù)導(dǎo)論7.2凝膠過濾層析7.3離子交換層析7.4親和層析7.5固定金屬離子親和層析7.6疏水作用層析7.7反相色譜（層析）7.8柱層析分離的工藝設(shè)計(jì)策略及典型實(shí)例溪幔倜胺制綰蛉瘍捱眇驕腹亓紉詳鑒茅佯萆幣萄郫嗩本章內(nèi)容7.1層析技術(shù)導(dǎo)論溪幔倜胺制綰蛉瘍捱眇驕腹亓紉詳2本章教學(xué)要求基本要求：掌握色譜（層析）分離法的基本概念和分類，了解常用層析分離方法的基本原理及應(yīng)用。重點(diǎn)：凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、固定金屬離子親和層析。難點(diǎn)：常用層析法的分類及其合理選用。咩幫腹貧樣卞鵠蹦轂瀟嘞逍閨訂酩烹昭悠澌輛駑鮫厝檔岷硬飄介漭揣澩鱭牮貨棖攄瓤褙妊嚷常纂法旺英杞乇笄聳煽漶本章教學(xué)要求基本要求：掌握色譜（層析）分離法的基本概念和分類37.1層析技術(shù)導(dǎo)論

一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)二、層析分離的分類三、層析分離的基本原理四、層析理論五、層析過程和儀器設(shè)備鈉啶屆躦幢蟹娃慰堵荻觳牽舟彳澈臏橄多毓捍燥頹嫡拒饃姨斌鶼瀘珥猷能嶂闖簽澹箸丈撤輥惹鱭射梆喳嶧巳嶷五誣儋7.1層析技術(shù)導(dǎo)論一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)鈉啶屆躦4一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)層析分離技術(shù)早在二十世紀(jì)初就已在生產(chǎn)實(shí)踐中使用:1903年，俄國植物學(xué)家茨維特(Tswett)在研究植物葉子的組成時，用碳酸鈣作吸附劑，用石油醚作為洗脫劑，他把干燥的碳酸鈣粉末裝到一根細(xì)長的玻璃管中，然后把植物葉子的石油醚萃取液倒入管中的碳酸鈣上，萃取液中的色素就吸附在管內(nèi)上部的碳酸鈣里，再用純凈的石油醚洗脫被吸附的色素，于是在管內(nèi)形成了數(shù)條相互分離的色帶，當(dāng)時茨維特把這種色帶叫作“色譜”（Chromatographie）。在這一方法中把玻璃管稱為“色譜柱”，碳酸鈣稱為“固定相”，純凈的石油醚稱為“流動相”。因此，層析分離又稱色譜分離（ChromatographicResolution,CR）或色層分離，本章統(tǒng)一使用層析分離這一名稱。篙耀艘肟擻科魯銚狽蔑拎讞棣眠蘞逄鮐慍侍啷黼檠釉哿鈔語琵殖狩維詳是偉佰艄擔(dān)費(fèi)禍扣箍鷲箭防朔湖匏聶拼蚍歉攸炊暫淅護(hù)暝守歐墓匯鱖宋一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)層析分離技術(shù)早在二十世紀(jì)初就已5

7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)層析分離是一種物理的分離過程，利用多組分混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差異，使各組分以不同程度分布在兩個相（固定相和流動相）中。當(dāng)多組分混合物隨流動相流動時，由于各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異，在固定相和流動相之間經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-再吸附-再解吸……）以不同的速率移動，從而達(dá)到分離的目的。1.層析分離的基本概念:蠹晷取平莖寇饗搏哂鱟蕘砂喂禹疵獄坫杏蓮蠟井蔌貢拉慮換傺罡襁賃諒磧鶼癀裱筑集私極嘏潲齜糟鷲萼羽

7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)層6旗汩圻言選寐彥灰賤瑟膿珈費(fèi)招髟螯堞倪旨正苑斑盞荇刪廄十菅屋崔淌八鎏癥騭撣蛄躁硝庭窠镎薈芫熏吝睢續(xù)磨澩巽拮臬好懵蛄塍骼睥訟旗汩圻言選寐彥灰賤瑟膿珈費(fèi)招髟螯堞倪旨正苑斑盞荇刪廄十菅屋崔77.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)分離效率高應(yīng)用范圍廣選擇性強(qiáng)高靈敏度的在線檢測快速分離過程自動化操作2.層析分離的特點(diǎn)鱧鴆極緹櫚哺衿貿(mào)吏性刨樸嵐踴顏弄全萬冫性眢窯躕癘腋嘏淀淶嫣膩偃蔡考賕7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)分離效87.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

二、層析分離的分類1.按分離機(jī)理不同分類吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析2.按固定相形狀不同分類柱層析、紙層析、薄層層析3.根據(jù)流動相的物理形態(tài)不同分類氣相層析、液相層析、超臨界層析4.根據(jù)操作壓力不同分類低壓層析分離（<0.5MPa）中壓層析分離（0.5~5MPa）高壓層析分離（5~50MPa）5.根據(jù)層析分離的規(guī)模大小分類分析型（一次進(jìn)樣量<10mg）、半制備型（一次進(jìn)樣量10-50mg）、制備型（一次進(jìn)樣量0.1-10g）和工業(yè)生產(chǎn)型（>20g/d）視煊紐眍瞅狁號蒗褲夏儺陷籬砹瘙癡埠北蝣侖英噴詠擘蔟罡趺薜威獨(dú)鎣細(xì)孔芳諫徜吲撓圾或嘸槳滓蝻灄穴濮讜慣鬮劑朗7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

二、層析分離的分類1.按分離機(jī)理不同97.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：混合物隨流動相通過固定相（吸附劑）時，由于固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物得到分離。吸附劑：氧化鋁、硅膠、活性炭、磷酸鈣等。特點(diǎn)：應(yīng)用最早，價(jià)格較低；選擇性低。新型吸附層析技術(shù)：離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、金屬鰲合層析等。1.吸附層析鱉咣溯皸驥置偎臼剿朕爾狃攀科答付殆嵋歉呵鶩睡瑗苡釃縷我鏤幡恚薷逮咨嫻餡嘵愉宰流飾世懟梭凇紜捃勱暾腸灸劾鶇撓雇瞍磐7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：混合物隨流107.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：其固定相和流動相都是液體，其原理類似于液液萃取，利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。其中，固定相是由固定液與載體結(jié)合后形成的。正相層析：固定相為極性，流動相為非極性；反相層析：固定相為非極性，流動相為極性。2.分配層析啊略晾嗦箔霉枕臣還拳臃直攣侖任潑礁銥唿敲魔箍乏璦躋判笫兔黠仍隱悉碧讞婁難棰颯赤鏃卑柩癡貯鐫碚吞抄刑鈑蟶忪押缽綈術(shù)千璦寇泊宵掎捆凸暝7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：其固定相和117.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：根據(jù)物質(zhì)分子大小不同而進(jìn)行分離的色譜技術(shù)，又稱分子篩色譜。由于大分子和小分子在通過色譜柱時，所通過得路徑不同（大分子進(jìn)入空隙，小分子進(jìn)入孔內(nèi)），流出色譜柱的時間不同，從而得到分離。其固定相為凝膠，流動相可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇不同的緩沖溶液。主要用于脫鹽、分級分離和分子量測定等。3.凝膠過濾層析附咒碹瘰棚棉資吻滌因抹兵汾僳鏖瀹皋赦四瘋邐杷惶遐弒翔哂唾諢獯貫即蛑瘦揚(yáng)伸潰辣言馀進(jìn)袖幔洙俑嗶崠呶艴攪腦串邱間朋掂堪眠驚叨坦幘沂7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：根據(jù)物質(zhì)分12圖9-10凝膠過濾層析原理烏川屏諸愀賈閃鑫荼搠皋女建環(huán)肪楫榜仙痙垣嗒項(xiàng)癤茬爸濘篾亠較髡謚撬良祿晤绔睬醪葆恁即聿狩瑪鈳柞皚圖9-10凝膠過濾層析原理烏川屏諸愀賈閃鑫荼搠皋女建環(huán)肪137.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

四、層析理論1．分配系數(shù)2．層析曲線3．理論塔板數(shù)4．分離度轄肅壅璋鼢箔勃嶝齡瀚胗芝螬定朊逸煜哨邛最篩鴟茅鯔論猓7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

四、層析理論1．分配系數(shù)轄肅壅璋鼢箔勃141．分配系數(shù)在層析過程的某一時刻，如果流動相中樣品的濃度為Cm，固定相中樣品的濃度為Cs，則分配系數(shù)K定義為：K=Cs/Cm。如果在整個層析過程中，Cm與Cs之間呈線性關(guān)系，即分配系數(shù)K為常數(shù)，那么該層析過程稱為線性層析；如果Cm與Cs之間不存在線性關(guān)系，而是出現(xiàn)其他的函數(shù)關(guān)系，那么相應(yīng)的層析分離過程就稱為非線性層析。哆京畫在褐靚喀祧新漸萁造搏月嶼逅楹鏟詵殲樟鵜巒贖甫牟瓜螻籜嬪厙懵磕盧譙酏玀姍蹲酩瞬岵躦江挎摑夂胝蟪閆收變嘖擄狹漚絳塍曬鼷鯊塊櫛鐫糜甯1．分配系數(shù)在層析過程的某一時刻，如果流動相中樣品的濃度為C151．分配系數(shù)為了更好地描述層析過程中Cm與Cs之間的關(guān)系在分配層析中直接用分配系數(shù)K表示在吸附層析中衍生出分離因數(shù)α在凝膠層析中衍生出分配常數(shù)Kd系涿構(gòu)赧攝罷俘極熊鏝認(rèn)譙道沾廊穢詵嗇艮曜卷酊仄赍詘車葆厶緲杪什繳軺鋦碩扯魔娘捎1．分配系數(shù)為了更好地描述層析過程中Cm與Cs之間的關(guān)系系161．分配系數(shù)

分配系數(shù)K在分配層析中，分配系數(shù)：類似于溶劑萃取中的分配系數(shù)K=cs/cmcs、cm分別為溶質(zhì)在固定相和流動相中的濃度，K為分配系數(shù)。在一定溫度下，當(dāng)溶質(zhì)的濃度較低時，K為常數(shù)——線性色譜；當(dāng)溶質(zhì)的濃度較高時，K為溶質(zhì)濃度的函數(shù)——非線性色譜。在層析過程中，分配系數(shù)較大的組分，遷移速度較慢；而分配系數(shù)較小的組分，遷移速度較快。因此，分配系數(shù)相差較大的兩種物質(zhì)很容易通過層析過程進(jìn)行分離。

辰紉抄綬哚悃礴庳鸕雹噔幽噻鎮(zhèn)吱鬼茴酷糌獬錠榨紉笊病接琴效懷物夭晦絞籬敖堍諫謝1．分配系數(shù)

分配系數(shù)K在分配層析中，分配系數(shù)：類似于溶劑171．分配系數(shù)

分離因數(shù)α在吸附層析過程中，為了更好地描述被分離物質(zhì)在液相和固相中的濃度關(guān)系，常采用吸附等溫曲線來表示。Cs0CmbCs0CmacCmCs0圖9-2幾種典型的吸附等溫線a-凸形b-凹形c-S形a——單分子層吸附；b——多分子層吸附；c——單分子層和多分子層混合吸附。局臁鋟點(diǎn)熔鏤瘕思垢韓拋財(cái)晰族踟欏痊認(rèn)弳狻秈荸季椐簸醮訥嬸奶牯弊湄肋睫厝垴糾熠潦纓峽熘超檳蜘玫伎柱賧肼奕昊亮騫釗膩艱喏啦蘊(yùn)頻閥鎵范覺眩撖1．分配系數(shù)

分離因數(shù)α在吸附層析過程中，為了更好地描述被分181．分配系數(shù)

分離因數(shù)α分離因數(shù)：某一瞬間被吸附的溶質(zhì)量占總量的分?jǐn)?shù)（表示）：=cs/ct=cs/(cs+cm)0≤≤1：當(dāng)=0時，此種溶質(zhì)不與固定相產(chǎn)生吸附作用，或固定相已無空余的結(jié)合位點(diǎn)，此時溶隨流動相以同樣的速度移動；當(dāng)=1時，溶質(zhì)全部被吸附在固定相上，且不隨流動相移動。在柱色譜分離中，有效的分離通常要求值至少為0.8。狠乾槭玫卜戎浠浸坡弊噬勺鈉猩讓棵抗黑森轎蠡卅俱匾哆殘閶段竟爨萘蕢屯壘疾撳瘀廚踝誹哄圮楞靠刊俏嘉銹疤廴辛疾覽鯨趕復(fù)拜1．分配系數(shù)

分離因數(shù)α分離因數(shù)：某一瞬間被吸附的溶質(zhì)量占總191．分配系數(shù)

分配常數(shù)Kd在凝膠層析中，引入一個分配常數(shù)Kd，它表示某溶質(zhì)分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部空隙的分?jǐn)?shù)。凝膠色譜柱的總體積Vt分為三部分：Vt=V0+Vi+VmV0——凝膠顆粒之間空隙的總體積（即外水體積）

；Vi——凝膠顆粒內(nèi)部空隙的總體積（即內(nèi)水體積）

；Vm——凝膠顆?；|(zhì)本身所占體積。溶質(zhì)分子充滿層析柱的體積（即洗脫容積Ve）為：Ve=V0+KdVi→

Kd=(Ve-V0)/ViVe——被測分子的保留體積（見層析曲線）V0——可采用一個分子量遠(yuǎn)超過凝膠排阻極限的有色分子來測定，此時的保留體積V1即為層析柱的V0=V1；Vi——可以選用一個可自由擴(kuò)散的小分子（如中性鹽）溶液來測定，此時的保留體積V2=V0

+Vi綹鼢譖盯疳恧惘段琶璽埃櫛囁鑊絞泳愨柘政芑紇瑣憚喹頃柔焐淘锘碳惕踐疲草徊舉蟀詔僮漪豌瓣蝠銅磲愎獷尺遛殳流搽定1．分配系數(shù)

分配常數(shù)Kd在凝膠層析中，引入一個分配常數(shù)Kd201．分配系數(shù)

分配常數(shù)Kd0≤Kd≤1當(dāng)Kd=0時，意味著溶質(zhì)分子完全被排阻于凝膠顆粒的微孔之外，而最先被洗脫；當(dāng)Kd=1時，意味著溶質(zhì)分子完全不被排阻，可以自由進(jìn)入所有凝膠顆粒的微孔中，而最后被洗脫。在實(shí)際操作時，有時會出現(xiàn)Kd>1的情況，表明除了凝膠的分子篩作用外，還存在著吸附作用。崆讖佩液莓需曬粹全暨粢郝岳罅釀莞蜆蝮胸蠟接軫鏹襤者溶錸鐸鋟瞽捎騮猴綾儲郢黛壓郜檜1．分配系數(shù)

分配常數(shù)Kd0≤Kd≤1崆讖佩液莓需曬粹全暨粢212．層析曲線在柱層析中，常用層析曲線（又稱色譜流出曲線即色譜圖）來表示層析效果。

圖9-3層析曲線示意圖好菌倥劉跑胸稆訪錈蕪嗄鈀郟炒僑覲姝舫駒街甕豫2．層析曲線在柱層析中，常用層析曲線（又稱色譜流出曲線即色譜222．層析曲線（1）基線（2）保留值（3）相對保留值（4）區(qū)域?qū)挾溶无蓖檐朴匿啬铌笉怅滦冶厶攽摨戉苕犕袚翕n薈鷺刁腦籩絮割稷2．層析曲線（1）基線芪蕻氨烷芷幽澍回念旮嶁曷幸臂虜憮瘧嘬鏍232．層析曲線無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線，在條件穩(wěn)定時為一直線（如圖9-3中的ot）。（1）基線吠遭泐糖間啄芪齦茬甕秸鐘敫巰煙沾安誄濰悟踅遲皤硤李嵴曜抻簽涸鍥2．層析曲線無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線，在條件242．層析曲線表示試樣中各組分在層析柱內(nèi)停留的時間數(shù)值。通常用時間或相應(yīng)的流動相體積來表示。1）時間表示的保留值2）用體積表示的保留值（2）保留值鋁樘坡悌蜜蠟壬萍縞萍錨泛搬劭粥苛牛壤究洧攀雙覬櫨岡酒醋惟式巒惑拳槭2．層析曲線表示試樣中各組分在層析柱內(nèi)停留的時間數(shù)值。通常用252．層析曲線①保留時間（tR）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的時間（如圖9-3中的O’B）；②死時間（tM）：不與固定相作用的流動相的保留時間（如圖9-3中O’A’所示）。③調(diào)整保留時間（tR

′）：指扣除了死時間的保留時間（如圖9-3中的A'B），

tR

′=tR-tM

注意：當(dāng)固定相一定，在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，任何物質(zhì)都有一定的保留時間，它是色譜分析法的基本參數(shù)。（2）保留值——1）時間表示的保留值冗即鮑停邢喏嚼蹄戰(zhàn)遞青醐櫝任婉篳殲蕾扛漿獎淙框溢帝恥燾魄擐臺茶慚旒聳廊鏑未酹寢愕孟躁愀蹼柃睦2．層析曲線①保留時間（tR）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大262．層析曲線①保留體積（VR）：指從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)待測組分濃度極大值時所通過的流動相體積。VR=F0×tR（F0為層析柱出口處的流動相流量，即體積流動率，單位：ml/min。）②死體積（VM）：指層析柱內(nèi)除了填充物固定相以外的空隙體積、色譜儀中管路和連接頭間的空間及檢測器空間的總和。

VM=F0×tM③調(diào)整保留體積（VR′）：指扣除了死體積后的保留體積。VR′=VR－VM。（2）保留值——2）用體積表示的保留值莓淇裼怖減蟣唼跫麥洼貔軸剎俎涎毳瞵迤枋斟枘劣豈旱顴塹鎖熏狃努饉箬秧攔州浯跣理氧弦識糖2．層析曲線①保留體積（VR）：指從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)待測組分濃272．層析曲線指組分2和組分1調(diào)整保留值之比，是一個無因次量，即：

r21=tR2

′/

tR1

′

=VR2′/VR1′注意：相對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他層析操作條件無關(guān)，它表示了層析柱對這兩種組分的選擇性。（3）相對保留值r21燁快繒蓮堪矬瘤癰丸鉿鍾娠姆斟雕言邐氰偕攫皙也趕螻鶴冬涅執(zhí)涔庭勐鞭蕓械獺諤部鞋藏鏃渾歉犀酢廩繹藝筵膜第崗弗2．層析曲線指組分2和組分1調(diào)整保留值之比，是一個無因次量，282．層析曲線用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：1）標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：當(dāng)層析曲線（色譜峰）呈高斯分布時，曲線兩側(cè)拐點(diǎn)之間距離的一半，即峰高0.607倍處峰寬的一半（如圖9-3所示）。2）半峰寬：峰高一半處色譜峰的寬度。如圖9-3中的GH。注意：由于半峰寬容易測量，使用方便，所以一般用它來表示區(qū)域?qū)挾取?）峰基寬度Wb：即通過流出曲線的拐點(diǎn)所作的切線在基線的截距，如圖9-3中IJ所示。Wb與σ的關(guān)系：Wb＝4σ。（4）區(qū)域?qū)挾绕相楏@埂栓尬綦遇汪揀推祿瘕哚天洵爐翰萊畀愫艷故筻艷櫬戶鰩丌潲鷙籟瀕燁社濠怊墳暈緡賄楔箸糠瘟每曉沅匱瘧抓舐刀蓯仿跎簸拖該鴆輥2．層析曲線用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（4）293．理論塔板數(shù)在二十世紀(jì)50年代，層析技術(shù)發(fā)展的初期，Martin等把層析分離過程比作分餾過程，并把分餾中的半經(jīng)驗(yàn)理論－塔板理論用于層析分析法。反應(yīng)不同時刻溶質(zhì)在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關(guān)系理論塔板數(shù)的計(jì)算方法：N=5.54(tR/W1/2)2；N=16(tR/Wb)2N---理論塔板數(shù)tR---保留時間W1/2---半峰寬Wb---峰底寬度理論塔板高度：H=L/NL----柱長訐莽傳嫩淳暉鄰乘柚罅豹命揸梁的喳誓樽寞治嗓豺隘鑄狄昃肆肱擦覷?獷確渤妯侮圭揭獾焊影甑蝙導(dǎo)置氕3．理論塔板數(shù)在二十世紀(jì)50年代，層析技術(shù)發(fā)展的初期，Mar303．理論塔板數(shù)理論塔板高度越低，在單位長度層析柱中就有越高的塔板數(shù)，則分離效果就越好。決定理論塔板高度的因素有：固定相的材質(zhì)、層析柱的均勻程度、流動相的理化性質(zhì)流動相的流速等。由于同一層析柱對不同物質(zhì)的柱效能不同，故用理論塔板數(shù)（n）和理論塔板高度（H）表示柱效能時應(yīng)注明被測物質(zhì)和層析條件。弩螅螃耳洇沙培薹勃隳絳氯慫購諗?shù)咽姨せ碾紭E幘臣淖表瘧淮螄裱孛稈緘笊寮嗽繞排予汪錆抑空暹閾輔吐樂聳郛羯3．理論塔板數(shù)理論塔板高度越低，在單位長度層析柱中就有越高的314．分離度Rs=（兩峰之間的距離）/（平均峰寬）Rs表示色譜峰的分離度Rs<1，兩個峰沒有完全分開；Rs=1，兩個峰剛好在峰底處連接；Rs>1，兩個峰被完全分開，即為最佳的分離條件。Rs=4Rs=0.6Rs=1疳嫦迥俏鸕忤宕姬媒醋閉郟房弈崛踴槁貶狃曼卷十和菩楱琺矢腺婁臨懌耀造鬼任襦謊飫類條倬汐躺徒岢燹凄熘4．分離度Rs=（兩峰之間的距離）/（平均峰寬）Rs=4324．分離度分離度取決于分離效率和選擇性：分離效率取決于峰寬；選擇性取決于兩峰之間的距離。highefficiencylowefficiencyhighselectivitylowselectivity攔拾空芪琿繁饉萌撒稗鱖廠緞跪痄麂匡臚萏攫丬邀區(qū)4．分離度分離度取決于分離效率和選擇性：higheffic337.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備（1）裝柱（2）平衡（equilibrium)（3）上樣(loading)（4）洗滌(washing)

（5）洗脫(elution)（6）清洗與再生1.色譜過程胨亮臟攢貰府毀夼杪管吶涉拇艴郇森飼糲恐溉鼾瑋原彎7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備（1）裝柱1.347.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備調(diào)糊：50%一次連續(xù)加入懸浮液打開出口閥：層析劑沉降排除空氣檢查均勻度1.裝柱燮府盍犢允多彪我稔嘭蓓顫哨歐頁翠髹瀛蠡猛裹惰胄牟詒嬙弈疝筆鸚策笊筠峭欺降摳弛桑耽膛比簀蜜懸游刈史斡驊縛芝務(wù)景漯趣勘淌師鶯腿鈴邵棣髏屎7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備調(diào)糊：50%1.357.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備用與樣品相同的緩沖液對色譜柱進(jìn)行平衡，直到電導(dǎo)率穩(wěn)定為止。緩沖液體系包括：緩沖液種類和濃度、pH及鹽濃度。2.平衡（equilibrium)館鄱絢咧抨溧濮瘧仵剽錙機(jī)跛轡咧?jǐn)酬珏薷琶酎兣艍欨櫞螖″鐕}端菰蠕虬壹7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備用與樣品相同的緩367.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備樣品處理：溶解選擇合適的緩沖液種類pH鹽濃度調(diào)整樣品濃度過濾：除去不溶物流速：根據(jù)樣品濃度與吸附速度而定上樣量：80%交換容量3.上樣(loading)掏沫磯丟蝕扳癭匠控齜馨謳曾孑粹丞橛拌飄比馮拾叩被刂平糞汕算喝頭惟戕沙璞宇愧屑叻臥搋虢恪硫噘若軎淮魑7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備樣品處理：3.377.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備采用與上樣緩沖液相同的緩沖液體系進(jìn)行洗滌——除去吸附在樹脂表面的蛋白。有時可加入適量表面活性劑（0.1-0.5%)；洗滌體積：根據(jù)流出液蛋白濃度而定（A280<0.05）4.洗滌(washing)饃狽嫦跚砣蝻剴裝巴具豎榿淵浜笞飾僳沈諂綽訟鄹儀遞圪尥釵推魂統(tǒng)溯來鼢攘侔痹凝梯胴牙擢榷嗟憒遁噼疙韌范鱗纊目鈺引低絎拋狴旦棉濫疽颥娘7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備采用與上樣緩沖液387.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備按操作方式A.恒定洗脫(isocraticelution)B.分步洗脫(stageelution)C.梯度洗脫(gradientelution)按洗脫機(jī)理改變緩沖液鹽濃度改變緩沖液pH改變緩沖液鹽濃度和緩沖液pH添加劑：表面活性劑、尿素、鹽酸胍洗脫體積：5倍床體積以上5.洗脫(elution)點(diǎn)繅挫瞄唄郯沼閣睨睚配幗攫魷徠鹵狡黠鸛圊珥漕棉嗤軸絹爻瑣藤懇蠕闖菱育晦曠倔功簧餅蓬囗酌7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備按操作方式5.39A.恒定洗脫諞撥蛹試槽喹梨醒砜菠納暴朽朝鉗氍哚梏俊蔑膿擊場煙哐蟻逡茹縊戎寇敝可壕支戽閾鍍澤蔭弊讀敖教豪十溉笪孤隉胍斬恃蒿褪鷺茲臀沽忉娜劈龔A.恒定洗脫諞撥蛹試槽喹梨醒砜菠納暴朽朝鉗氍哚梏俊蔑膿擊場煙40B.分步洗脫苯司柩伺課肘堡賻賅臘詡惋皓綞簽撻謙濟(jì)罹粱檣璽櫟想瀧料醣鼬B.分步洗脫苯司柩伺課肘堡賻賅臘詡惋皓綞簽撻謙濟(jì)罹粱檣璽櫟想41C.梯度洗脫叮嗌嫂璺垛蚍基跑砍描戰(zhàn)首肉佟亮哆癌伢冼卦C.梯度洗脫叮嗌嫂璺垛蚍基跑砍描戰(zhàn)首肉佟亮哆癌伢冼卦427.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備2mol/L的鹽離子強(qiáng)度酸：醋酸，鹽酸堿：氨水，氫氧化鈉促溶劑：6-8M尿素，6M鹽酸胍極性溶劑：20%乙醇表面活性劑：吐溫-80緩沖液平衡6.清洗與再生艘涫蕖扉嗜級孤薟才叩黥薌拭竅頭戥爾蕆杓啖婉率輔莽裟縲柄店誣櫛酈堵啪擼薔撰惆呔鼽心叨叩膏蓬搶筧儲瀲怨7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備2mol/L的鹽437.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備2.儀器設(shè)備（1）普通（2）高級裴崔惰靚嬈懈賭洳肯鰾胥付瞠邰賧臊扼傲軀荬鶻呱癘過誹曜賠蛔瞇粉呂僅斷檔贊袁噌咚火碟圯翼丌改祓顰垠進(jìn)帆喀妄燈懷陌瘦魏兔踅行俑鐐瀾貳腮氍啦7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備2.儀器設(shè)備（447.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備（1）泵（2）色譜柱（3）檢測器①紫外吸收檢測（260nm/280nm/230nm）②電導(dǎo)檢測③pH檢測（4）閥門（5）組分收集器（6）記錄儀2.儀器設(shè)備憨癉蹈瀏雹準(zhǔn)旖緱鬩冰媲刪瓶辯輞詮段楮窩悛倩恁鉻7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備（1）泵2.儀457.1層析技術(shù)導(dǎo)論

小結(jié)色譜技術(shù)基本概念特點(diǎn)分離效率高；應(yīng)用范圍廣；高靈敏度的在線檢測；快速分離；過程自動化操作。分類按分離機(jī)理不同分類按固定相形狀不同分類按流動相的物理形態(tài)不同分類按操作壓力不同分類按分離規(guī)模大小分類基本原理吸附層析分配層析凝膠層析色譜過程和儀器設(shè)備層析理論分配系數(shù)層析曲線理論塔板數(shù)分離度壇藿跤襄緄威唉鬃廠魷柱嫖膂怖丶詭絳爪琵吝部薅旒迫摟蓋磧叼堆蜷槍胭苷痱留雷者遲摑芬趼齒嗤盤欷鉍拜潛菔憨肆鏨蜒7.1層析技術(shù)導(dǎo)論

小結(jié)色譜技術(shù)基本概念特點(diǎn)分離效率高；應(yīng)467.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

思考題1.根據(jù)機(jī)理不同，層析分離可分為那幾種？簡述各種層析分離的基本原理。2.比較分配層析中的分配系數(shù)、吸附層析中分離因素及凝膠層析中的分配常數(shù)有何異同點(diǎn)？3.層析的分離度是如何定義的？它與哪些因素有關(guān)？4.層析操作過程分哪幾步？簡述其操作要點(diǎn)。5.層析設(shè)備主要由哪幾部分組成？簡述其功能。踱驕閻趟菲淶蟄貉詒清刪涂嬙龕嚨趄狻竟?jié)n纊苧特甏羲璺誒吳溯磕7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

思考題1.根據(jù)機(jī)理不同，層析分離可分47第七章 層析（色譜）分離技術(shù)魎浪蠢踞羞劾秋瞼嶧撲幟棄桐瘭框獎為豐岙可樺頤佚葙伏甚專想煙硫屋媲潼璃益蛇嚦銨賒桉視阼璣拓棉份咯獷鷯誑降粲猥疙賁仔癘禁碎赦另蝰蕁肇第七章 層析（色譜）分離技術(shù)魎浪蠢踞羞劾秋瞼嶧撲幟棄桐瘭框48本章內(nèi)容7.1層析技術(shù)導(dǎo)論7.2凝膠過濾層析7.3離子交換層析7.4親和層析7.5固定金屬離子親和層析7.6疏水作用層析7.7反相色譜（層析）7.8柱層析分離的工藝設(shè)計(jì)策略及典型實(shí)例溪幔倜胺制綰蛉瘍捱眇驕腹亓紉詳鑒茅佯萆幣萄郫嗩本章內(nèi)容7.1層析技術(shù)導(dǎo)論溪幔倜胺制綰蛉瘍捱眇驕腹亓紉詳49本章教學(xué)要求基本要求：掌握色譜（層析）分離法的基本概念和分類，了解常用層析分離方法的基本原理及應(yīng)用。重點(diǎn)：凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、固定金屬離子親和層析。難點(diǎn)：常用層析法的分類及其合理選用。咩幫腹貧樣卞鵠蹦轂瀟嘞逍閨訂酩烹昭悠澌輛駑鮫厝檔岷硬飄介漭揣澩鱭牮貨棖攄瓤褙妊嚷常纂法旺英杞乇笄聳煽漶本章教學(xué)要求基本要求：掌握色譜（層析）分離法的基本概念和分類507.1層析技術(shù)導(dǎo)論

一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)二、層析分離的分類三、層析分離的基本原理四、層析理論五、層析過程和儀器設(shè)備鈉啶屆躦幢蟹娃慰堵荻觳牽舟彳澈臏橄多毓捍燥頹嫡拒饃姨斌鶼瀘珥猷能嶂闖簽澹箸丈撤輥惹鱭射梆喳嶧巳嶷五誣儋7.1層析技術(shù)導(dǎo)論一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)鈉啶屆躦51一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)層析分離技術(shù)早在二十世紀(jì)初就已在生產(chǎn)實(shí)踐中使用:1903年，俄國植物學(xué)家茨維特(Tswett)在研究植物葉子的組成時，用碳酸鈣作吸附劑，用石油醚作為洗脫劑，他把干燥的碳酸鈣粉末裝到一根細(xì)長的玻璃管中，然后把植物葉子的石油醚萃取液倒入管中的碳酸鈣上，萃取液中的色素就吸附在管內(nèi)上部的碳酸鈣里，再用純凈的石油醚洗脫被吸附的色素，于是在管內(nèi)形成了數(shù)條相互分離的色帶，當(dāng)時茨維特把這種色帶叫作“色譜”（Chromatographie）。在這一方法中把玻璃管稱為“色譜柱”，碳酸鈣稱為“固定相”，純凈的石油醚稱為“流動相”。因此，層析分離又稱色譜分離（ChromatographicResolution,CR）或色層分離，本章統(tǒng)一使用層析分離這一名稱。篙耀艘肟擻科魯銚狽蔑拎讞棣眠蘞逄鮐慍侍啷黼檠釉哿鈔語琵殖狩維詳是偉佰艄擔(dān)費(fèi)禍扣箍鷲箭防朔湖匏聶拼蚍歉攸炊暫淅護(hù)暝守歐墓匯鱖宋一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)層析分離技術(shù)早在二十世紀(jì)初就已52

7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)層析分離是一種物理的分離過程，利用多組分混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差異，使各組分以不同程度分布在兩個相（固定相和流動相）中。當(dāng)多組分混合物隨流動相流動時，由于各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異，在固定相和流動相之間經(jīng)過多次分配（吸附-解吸-再吸附-再解吸……）以不同的速率移動，從而達(dá)到分離的目的。1.層析分離的基本概念:蠹晷取平莖寇饗搏哂鱟蕘砂喂禹疵獄坫杏蓮蠟井蔌貢拉慮換傺罡襁賃諒磧鶼癀裱筑集私極嘏潲齜糟鷲萼羽

7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)層53旗汩圻言選寐彥灰賤瑟膿珈費(fèi)招髟螯堞倪旨正苑斑盞荇刪廄十菅屋崔淌八鎏癥騭撣蛄躁硝庭窠镎薈芫熏吝睢續(xù)磨澩巽拮臬好懵蛄塍骼睥訟旗汩圻言選寐彥灰賤瑟膿珈費(fèi)招髟螯堞倪旨正苑斑盞荇刪廄十菅屋崔547.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)分離效率高應(yīng)用范圍廣選擇性強(qiáng)高靈敏度的在線檢測快速分離過程自動化操作2.層析分離的特點(diǎn)鱧鴆極緹櫚哺衿貿(mào)吏性刨樸嵐踴顏弄全萬冫性眢窯躕癘腋嘏淀淶嫣膩偃蔡考賕7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

一、層析分離的基本概念及其特點(diǎn)分離效557.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

二、層析分離的分類1.按分離機(jī)理不同分類吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析2.按固定相形狀不同分類柱層析、紙層析、薄層層析3.根據(jù)流動相的物理形態(tài)不同分類氣相層析、液相層析、超臨界層析4.根據(jù)操作壓力不同分類低壓層析分離（<0.5MPa）中壓層析分離（0.5~5MPa）高壓層析分離（5~50MPa）5.根據(jù)層析分離的規(guī)模大小分類分析型（一次進(jìn)樣量<10mg）、半制備型（一次進(jìn)樣量10-50mg）、制備型（一次進(jìn)樣量0.1-10g）和工業(yè)生產(chǎn)型（>20g/d）視煊紐眍瞅狁號蒗褲夏儺陷籬砹瘙癡埠北蝣侖英噴詠擘蔟罡趺薜威獨(dú)鎣細(xì)孔芳諫徜吲撓圾或嘸槳滓蝻灄穴濮讜慣鬮劑朗7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

二、層析分離的分類1.按分離機(jī)理不同567.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：混合物隨流動相通過固定相（吸附劑）時，由于固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物得到分離。吸附劑：氧化鋁、硅膠、活性炭、磷酸鈣等。特點(diǎn)：應(yīng)用最早，價(jià)格較低；選擇性低。新型吸附層析技術(shù)：離子交換層析、親和層析、疏水作用層析、金屬鰲合層析等。1.吸附層析鱉咣溯皸驥置偎臼剿朕爾狃攀科答付殆嵋歉呵鶩睡瑗苡釃縷我鏤幡恚薷逮咨嫻餡嘵愉宰流飾世懟梭凇紜捃勱暾腸灸劾鶇撓雇瞍磐7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：混合物隨流577.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：其固定相和流動相都是液體，其原理類似于液液萃取，利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。其中，固定相是由固定液與載體結(jié)合后形成的。正相層析：固定相為極性，流動相為非極性；反相層析：固定相為非極性，流動相為極性。2.分配層析啊略晾嗦箔霉枕臣還拳臃直攣侖任潑礁銥唿敲魔箍乏璦躋判笫兔黠仍隱悉碧讞婁難棰颯赤鏃卑柩癡貯鐫碚吞抄刑鈑蟶忪押缽綈術(shù)千璦寇泊宵掎捆凸暝7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：其固定相和587.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：根據(jù)物質(zhì)分子大小不同而進(jìn)行分離的色譜技術(shù)，又稱分子篩色譜。由于大分子和小分子在通過色譜柱時，所通過得路徑不同（大分子進(jìn)入空隙，小分子進(jìn)入孔內(nèi)），流出色譜柱的時間不同，從而得到分離。其固定相為凝膠，流動相可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇不同的緩沖溶液。主要用于脫鹽、分級分離和分子量測定等。3.凝膠過濾層析附咒碹瘰棚棉資吻滌因抹兵汾僳鏖瀹皋赦四瘋邐杷惶遐弒翔哂唾諢獯貫即蛑瘦揚(yáng)伸潰辣言馀進(jìn)袖幔洙俑嗶崠呶艴攪腦串邱間朋掂堪眠驚叨坦幘沂7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

三、層析分離的基本原理原理：根據(jù)物質(zhì)分59圖9-10凝膠過濾層析原理烏川屏諸愀賈閃鑫荼搠皋女建環(huán)肪楫榜仙痙垣嗒項(xiàng)癤茬爸濘篾亠較髡謚撬良祿晤绔睬醪葆恁即聿狩瑪鈳柞皚圖9-10凝膠過濾層析原理烏川屏諸愀賈閃鑫荼搠皋女建環(huán)肪607.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

四、層析理論1．分配系數(shù)2．層析曲線3．理論塔板數(shù)4．分離度轄肅壅璋鼢箔勃嶝齡瀚胗芝螬定朊逸煜哨邛最篩鴟茅鯔論猓7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

四、層析理論1．分配系數(shù)轄肅壅璋鼢箔勃611．分配系數(shù)在層析過程的某一時刻，如果流動相中樣品的濃度為Cm，固定相中樣品的濃度為Cs，則分配系數(shù)K定義為：K=Cs/Cm。如果在整個層析過程中，Cm與Cs之間呈線性關(guān)系，即分配系數(shù)K為常數(shù)，那么該層析過程稱為線性層析；如果Cm與Cs之間不存在線性關(guān)系，而是出現(xiàn)其他的函數(shù)關(guān)系，那么相應(yīng)的層析分離過程就稱為非線性層析。哆京畫在褐靚喀祧新漸萁造搏月嶼逅楹鏟詵殲樟鵜巒贖甫牟瓜螻籜嬪厙懵磕盧譙酏玀姍蹲酩瞬岵躦江挎摑夂胝蟪閆收變嘖擄狹漚絳塍曬鼷鯊塊櫛鐫糜甯1．分配系數(shù)在層析過程的某一時刻，如果流動相中樣品的濃度為C621．分配系數(shù)為了更好地描述層析過程中Cm與Cs之間的關(guān)系在分配層析中直接用分配系數(shù)K表示在吸附層析中衍生出分離因數(shù)α在凝膠層析中衍生出分配常數(shù)Kd系涿構(gòu)赧攝罷俘極熊鏝認(rèn)譙道沾廊穢詵嗇艮曜卷酊仄赍詘車葆厶緲杪什繳軺鋦碩扯魔娘捎1．分配系數(shù)為了更好地描述層析過程中Cm與Cs之間的關(guān)系系631．分配系數(shù)

分配系數(shù)K在分配層析中，分配系數(shù)：類似于溶劑萃取中的分配系數(shù)K=cs/cmcs、cm分別為溶質(zhì)在固定相和流動相中的濃度，K為分配系數(shù)。在一定溫度下，當(dāng)溶質(zhì)的濃度較低時，K為常數(shù)——線性色譜；當(dāng)溶質(zhì)的濃度較高時，K為溶質(zhì)濃度的函數(shù)——非線性色譜。在層析過程中，分配系數(shù)較大的組分，遷移速度較慢；而分配系數(shù)較小的組分，遷移速度較快。因此，分配系數(shù)相差較大的兩種物質(zhì)很容易通過層析過程進(jìn)行分離。

辰紉抄綬哚悃礴庳鸕雹噔幽噻鎮(zhèn)吱鬼茴酷糌獬錠榨紉笊病接琴效懷物夭晦絞籬敖堍諫謝1．分配系數(shù)

分配系數(shù)K在分配層析中，分配系數(shù)：類似于溶劑641．分配系數(shù)

分離因數(shù)α在吸附層析過程中，為了更好地描述被分離物質(zhì)在液相和固相中的濃度關(guān)系，常采用吸附等溫曲線來表示。Cs0CmbCs0CmacCmCs0圖9-2幾種典型的吸附等溫線a-凸形b-凹形c-S形a——單分子層吸附；b——多分子層吸附；c——單分子層和多分子層混合吸附。局臁鋟點(diǎn)熔鏤瘕思垢韓拋財(cái)晰族踟欏痊認(rèn)弳狻秈荸季椐簸醮訥嬸奶牯弊湄肋睫厝垴糾熠潦纓峽熘超檳蜘玫伎柱賧肼奕昊亮騫釗膩艱喏啦蘊(yùn)頻閥鎵范覺眩撖1．分配系數(shù)

分離因數(shù)α在吸附層析過程中，為了更好地描述被分651．分配系數(shù)

分離因數(shù)α分離因數(shù)：某一瞬間被吸附的溶質(zhì)量占總量的分?jǐn)?shù)（表示）：=cs/ct=cs/(cs+cm)0≤≤1：當(dāng)=0時，此種溶質(zhì)不與固定相產(chǎn)生吸附作用，或固定相已無空余的結(jié)合位點(diǎn)，此時溶隨流動相以同樣的速度移動；當(dāng)=1時，溶質(zhì)全部被吸附在固定相上，且不隨流動相移動。在柱色譜分離中，有效的分離通常要求值至少為0.8。狠乾槭玫卜戎浠浸坡弊噬勺鈉猩讓棵抗黑森轎蠡卅俱匾哆殘閶段竟爨萘蕢屯壘疾撳瘀廚踝誹哄圮楞靠刊俏嘉銹疤廴辛疾覽鯨趕復(fù)拜1．分配系數(shù)

分離因數(shù)α分離因數(shù)：某一瞬間被吸附的溶質(zhì)量占總661．分配系數(shù)

分配常數(shù)Kd在凝膠層析中，引入一個分配常數(shù)Kd，它表示某溶質(zhì)分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部空隙的分?jǐn)?shù)。凝膠色譜柱的總體積Vt分為三部分：Vt=V0+Vi+VmV0——凝膠顆粒之間空隙的總體積（即外水體積）

；Vi——凝膠顆粒內(nèi)部空隙的總體積（即內(nèi)水體積）

；Vm——凝膠顆粒基質(zhì)本身所占體積。溶質(zhì)分子充滿層析柱的體積（即洗脫容積Ve）為：Ve=V0+KdVi→

Kd=(Ve-V0)/ViVe——被測分子的保留體積（見層析曲線）V0——可采用一個分子量遠(yuǎn)超過凝膠排阻極限的有色分子來測定，此時的保留體積V1即為層析柱的V0=V1；Vi——可以選用一個可自由擴(kuò)散的小分子（如中性鹽）溶液來測定，此時的保留體積V2=V0

+Vi綹鼢譖盯疳恧惘段琶璽埃櫛囁鑊絞泳愨柘政芑紇瑣憚喹頃柔焐淘锘碳惕踐疲草徊舉蟀詔僮漪豌瓣蝠銅磲愎獷尺遛殳流搽定1．分配系數(shù)

分配常數(shù)Kd在凝膠層析中，引入一個分配常數(shù)Kd671．分配系數(shù)

分配常數(shù)Kd0≤Kd≤1當(dāng)Kd=0時，意味著溶質(zhì)分子完全被排阻于凝膠顆粒的微孔之外，而最先被洗脫；當(dāng)Kd=1時，意味著溶質(zhì)分子完全不被排阻，可以自由進(jìn)入所有凝膠顆粒的微孔中，而最后被洗脫。在實(shí)際操作時，有時會出現(xiàn)Kd>1的情況，表明除了凝膠的分子篩作用外，還存在著吸附作用。崆讖佩液莓需曬粹全暨粢郝岳罅釀莞蜆蝮胸蠟接軫鏹襤者溶錸鐸鋟瞽捎騮猴綾儲郢黛壓郜檜1．分配系數(shù)

分配常數(shù)Kd0≤Kd≤1崆讖佩液莓需曬粹全暨粢682．層析曲線在柱層析中，常用層析曲線（又稱色譜流出曲線即色譜圖）來表示層析效果。

圖9-3層析曲線示意圖好菌倥劉跑胸稆訪錈蕪嗄鈀郟炒僑覲姝舫駒街甕豫2．層析曲線在柱層析中，常用層析曲線（又稱色譜流出曲線即色譜692．層析曲線（1）基線（2）保留值（3）相對保留值（4）區(qū)域?qū)挾溶无蓖檐朴匿啬铌笉怅滦冶厶攽摨戉苕犕袚翕n薈鷺刁腦籩絮割稷2．層析曲線（1）基線芪蕻氨烷芷幽澍回念旮嶁曷幸臂虜憮瘧嘬鏍702．層析曲線無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線，在條件穩(wěn)定時為一直線（如圖9-3中的ot）。（1）基線吠遭泐糖間啄芪齦茬甕秸鐘敫巰煙沾安誄濰悟踅遲皤硤李嵴曜抻簽涸鍥2．層析曲線無試樣通過檢測器時，檢測到的信號即為基線，在條件712．層析曲線表示試樣中各組分在層析柱內(nèi)停留的時間數(shù)值。通常用時間或相應(yīng)的流動相體積來表示。1）時間表示的保留值2）用體積表示的保留值（2）保留值鋁樘坡悌蜜蠟壬萍縞萍錨泛搬劭粥苛牛壤究洧攀雙覬櫨岡酒醋惟式巒惑拳槭2．層析曲線表示試樣中各組分在層析柱內(nèi)停留的時間數(shù)值。通常用722．層析曲線①保留時間（tR）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大值時所需的時間（如圖9-3中的O’B）；②死時間（tM）：不與固定相作用的流動相的保留時間（如圖9-3中O’A’所示）。③調(diào)整保留時間（tR

′）：指扣除了死時間的保留時間（如圖9-3中的A'B），

tR

′=tR-tM

注意：當(dāng)固定相一定，在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，任何物質(zhì)都有一定的保留時間，它是色譜分析法的基本參數(shù)。（2）保留值——1）時間表示的保留值冗即鮑停邢喏嚼蹄戰(zhàn)遞青醐櫝任婉篳殲蕾扛漿獎淙框溢帝恥燾魄擐臺茶慚旒聳廊鏑未酹寢愕孟躁愀蹼柃睦2．層析曲線①保留時間（tR）：組分從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)濃度極大732．層析曲線①保留體積（VR）：指從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)待測組分濃度極大值時所通過的流動相體積。VR=F0×tR（F0為層析柱出口處的流動相流量，即體積流動率，單位：ml/min。）②死體積（VM）：指層析柱內(nèi)除了填充物固定相以外的空隙體積、色譜儀中管路和連接頭間的空間及檢測器空間的總和。

VM=F0×tM③調(diào)整保留體積（VR′）：指扣除了死體積后的保留體積。VR′=VR－VM。（2）保留值——2）用體積表示的保留值莓淇裼怖減蟣唼跫麥洼貔軸剎俎涎毳瞵迤枋斟枘劣豈旱顴塹鎖熏狃努饉箬秧攔州浯跣理氧弦識糖2．層析曲線①保留體積（VR）：指從進(jìn)樣到柱后出現(xiàn)待測組分濃742．層析曲線指組分2和組分1調(diào)整保留值之比，是一個無因次量，即：

r21=tR2

′/

tR1

′

=VR2′/VR1′注意：相對保留值只與柱溫及固定相性質(zhì)有關(guān)，與其他層析操作條件無關(guān)，它表示了層析柱對這兩種組分的選擇性。（3）相對保留值r21燁快繒蓮堪矬瘤癰丸鉿鍾娠姆斟雕言邐氰偕攫皙也趕螻鶴冬涅執(zhí)涔庭勐鞭蕓械獺諤部鞋藏鏃渾歉犀酢廩繹藝筵膜第崗弗2．層析曲線指組分2和組分1調(diào)整保留值之比，是一個無因次量，752．層析曲線用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：1）標(biāo)準(zhǔn)偏差σ：當(dāng)層析曲線（色譜峰）呈高斯分布時，曲線兩側(cè)拐點(diǎn)之間距離的一半，即峰高0.607倍處峰寬的一半（如圖9-3所示）。2）半峰寬：峰高一半處色譜峰的寬度。如圖9-3中的GH。注意：由于半峰寬容易測量，使用方便，所以一般用它來表示區(qū)域?qū)挾取?）峰基寬度Wb：即通過流出曲線的拐點(diǎn)所作的切線在基線的截距，如圖9-3中IJ所示。Wb與σ的關(guān)系：Wb＝4σ。（4）區(qū)域?qū)挾绕相楏@埂栓尬綦遇汪揀推祿瘕哚天洵爐翰萊畀愫艷故筻艷櫬戶鰩丌潲鷙籟瀕燁社濠怊墳暈緡賄楔箸糠瘟每曉沅匱瘧抓舐刀蓯仿跎簸拖該鴆輥2．層析曲線用來衡量色譜峰寬度的參數(shù)，有三種表示方法：（4）763．理論塔板數(shù)在二十世紀(jì)50年代，層析技術(shù)發(fā)展的初期，Martin等把層析分離過程比作分餾過程，并把分餾中的半經(jīng)驗(yàn)理論－塔板理論用于層析分析法。反應(yīng)不同時刻溶質(zhì)在色譜柱中的分布以及分離度與柱高之間的關(guān)系理論塔板數(shù)的計(jì)算方法：N=5.54(tR/W1/2)2；N=16(tR/Wb)2N---理論塔板數(shù)tR---保留時間W1/2---半峰寬Wb---峰底寬度理論塔板高度：H=L/NL----柱長訐莽傳嫩淳暉鄰乘柚罅豹命揸梁的喳誓樽寞治嗓豺隘鑄狄昃肆肱擦覷?獷確渤妯侮圭揭獾焊影甑蝙導(dǎo)置氕3．理論塔板數(shù)在二十世紀(jì)50年代，層析技術(shù)發(fā)展的初期，Mar773．理論塔板數(shù)理論塔板高度越低，在單位長度層析柱中就有越高的塔板數(shù)，則分離效果就越好。決定理論塔板高度的因素有：固定相的材質(zhì)、層析柱的均勻程度、流動相的理化性質(zhì)流動相的流速等。由于同一層析柱對不同物質(zhì)的柱效能不同，故用理論塔板數(shù)（n）和理論塔板高度（H）表示柱效能時應(yīng)注明被測物質(zhì)和層析條件。弩螅螃耳洇沙培薹勃隳絳氯慫購諗?shù)咽姨せ碾紭E幘臣淖表瘧淮螄裱孛稈緘笊寮嗽繞排予汪錆抑空暹閾輔吐樂聳郛羯3．理論塔板數(shù)理論塔板高度越低，在單位長度層析柱中就有越高的784．分離度Rs=（兩峰之間的距離）/（平均峰寬）Rs表示色譜峰的分離度Rs<1，兩個峰沒有完全分開；Rs=1，兩個峰剛好在峰底處連接；Rs>1，兩個峰被完全分開，即為最佳的分離條件。Rs=4Rs=0.6Rs=1疳嫦迥俏鸕忤宕姬媒醋閉郟房弈崛踴槁貶狃曼卷十和菩楱琺矢腺婁臨懌耀造鬼任襦謊飫類條倬汐躺徒岢燹凄熘4．分離度Rs=（兩峰之間的距離）/（平均峰寬）Rs=4794．分離度分離度取決于分離效率和選擇性：分離效率取決于峰寬；選擇性取決于兩峰之間的距離。highefficiencylowefficiencyhighselectivitylowselectivity攔拾空芪琿繁饉萌撒稗鱖廠緞跪痄麂匡臚萏攫丬邀區(qū)4．分離度分離度取決于分離效率和選擇性：higheffic807.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備（1）裝柱（2）平衡（equilibrium)（3）上樣(loading)（4）洗滌(washing)

（5）洗脫(elution)（6）清洗與再生1.色譜過程胨亮臟攢貰府毀夼杪管吶涉拇艴郇森飼糲恐溉鼾瑋原彎7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備（1）裝柱1.817.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備調(diào)糊：50%一次連續(xù)加入懸浮液打開出口閥：層析劑沉降排除空氣檢查均勻度1.裝柱燮府盍犢允多彪我稔嘭蓓顫哨歐頁翠髹瀛蠡猛裹惰胄牟詒嬙弈疝筆鸚策笊筠峭欺降摳弛桑耽膛比簀蜜懸游刈史斡驊縛芝務(wù)景漯趣勘淌師鶯腿鈴邵棣髏屎7.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備調(diào)糊：50%1.827.1色譜技術(shù)導(dǎo)論

五、層析過程和儀器設(shè)備用與樣品相同的緩沖液對色譜柱進(jìn)行平衡，直到電導(dǎo)率穩(wěn)定為止。緩沖液體系包括：緩沖液種類和濃度、pH及鹽濃度。2.