口腔微生物學(xué)研究主要方法

口腔微生物學(xué)研究的主要方法標(biāo)本

和處理細(xì)菌的培養(yǎng)和分離細(xì)菌的鑒定細(xì)菌毒力的檢測(cè)口腔微生物學(xué)研究的主要方法一、標(biāo)本（一）唾液標(biāo)本（二）牙菌斑標(biāo)本（三）齦溝液標(biāo)本（四） 根管標(biāo)本一、標(biāo)本（一）唾液標(biāo)本全唾液刺激唾液非刺激唾液前讓受檢者漱口用無(wú)菌容器取自然排出的唾液0.5~1.0ml細(xì)菌培養(yǎng)送檢用于微生物檢測(cè)采用的標(biāo)本一、標(biāo)本(二)牙菌斑標(biāo)本1

齦上菌斑清潔口腔牙上涂布菌斑染色劑漱口棉卷隔濕用無(wú)菌的挖匙或探針采集窩溝或唇頰面菌斑轉(zhuǎn)送培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)2

齦下菌斑刮出齦上菌斑和漱口

棉卷隔濕帶有充氣導(dǎo)管

器可卸式取菌器法滅菌紙尖厭氧培養(yǎng)(二)牙菌斑標(biāo)本轉(zhuǎn)送培養(yǎng)基(三)齦溝液標(biāo)本溝內(nèi)法夠外法前讓受檢者漱口去除取樣部位的齦上菌斑和牙石細(xì)菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)送培養(yǎng)基送檢(四)根管標(biāo)本牙髓病根管標(biāo)本多使用無(wú)菌紙尖采樣法待檢牙采樣前處理

、隔濕、等，未開(kāi)放的牙需開(kāi)髓處理紙尖放入根管內(nèi)取樣細(xì)菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)送培養(yǎng)基送檢二、細(xì)菌的分離和培養(yǎng)（一）菌斑標(biāo)本的分離和稀釋1

分離超聲振蕩10秒

漩渦振蕩器上1-2分鐘分散菌斑團(tuán)塊因數(shù)量多種類(lèi)繁多稀釋2

稀釋?zhuān)?）稀釋液轉(zhuǎn)送培養(yǎng)基：巰基乙醇酸鈉培養(yǎng)基乳酪消化的大豆肉湯培養(yǎng)基：TSB

(trypticase

soy

broth)磷酸鹽緩沖液：PBS（Phosphate

buffer

saline

）2

稀釋?zhuān)?）方法：10倍系列稀釋法不同樣本的稀釋程度不同10-1

10-2

10-3樣本的稀釋10-n唾液：10-4~10-6齦溝菌斑：10-1~10-2集合菌斑：10-3

~10-5(二)標(biāo)本的接種和培養(yǎng)1

培養(yǎng)基非選擇性培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基(二)標(biāo)本的接種和培養(yǎng)2

方法（1）表面劃線（2）玻棒接種適用于菌落形成單位（colony

forming

unit，CFU）計(jì)算使細(xì)菌分散，便于觀察單個(gè)菌落的形態(tài)（3）斜面接種適用于收集較多的細(xì)菌純培養(yǎng)物穿刺接種保存菌種、觀察細(xì)菌動(dòng)力及糖分解實(shí)驗(yàn)液體培養(yǎng)基接種生化鑒定及觀察細(xì)菌在體液環(huán)境中生長(zhǎng)特性2

方法3

標(biāo)本的孵育溫度：36~37℃時(shí)間：需氧菌、微需氧菌、兼性厭氧菌需1~2天，厭氧菌需2~3天或1周左右孵育條件：微需氧菌：90%N2、5%CO2厭氧菌：厭氧條件為80%N2、10%CO2、10%H2厭氧罐三、鑒定細(xì)菌的常規(guī)程序菌落形態(tài)和菌體形態(tài)生化特性檢驗(yàn)代謝產(chǎn)物分析(一)菌落形態(tài)和菌體形態(tài)1

菌落形態(tài)：扁平狀、平臺(tái)狀，突起及半圓形等。三、鑒定細(xì)菌的常規(guī)程序具核梭桿菌“面包屑樣菌落”體視顯微鏡菌落邊緣的形狀：圓形、波紋狀、分葉及鋸齒狀等。菌落的表面：光滑、粗糙或粘液狀，透明、半透明或混濁。(一)菌落形態(tài)和菌體形態(tài)SM光滑型和粗糙型菌落體視顯微鏡細(xì)菌染色性：常規(guī)染色:革蘭氏染色，G+，G-芽胞：苯酚復(fù)紅染色4

菌體的形態(tài)鞭毛：鞣酸、明礬、苯酚及甲紫混合液真菌：革蘭氏染色和乳酸酚棉染色變形桿菌的鞭毛染色菌細(xì)胞呈紅色，淡紅色的鞭毛位于菌體的四周菌體形態(tài)觀察：球菌桿菌（二）生化特性檢驗(yàn)糖發(fā)酵能力過(guò)氧化氫酶反應(yīng)氨基酸代謝七葉苷水解硫化氫試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn)學(xué)分型變異鏈球菌根據(jù)表面抗原分a~h八個(gè)型Aa分為a-e五個(gè)型（三）代謝產(chǎn)物分析1.氣相色譜分析法為采用氣體作為流動(dòng)相的一種色譜分析技術(shù)。所用的載氣必須是不與被檢測(cè)物起作用只為載送試樣服務(wù)的氣體，一般為惰性氣體如氫、氮等。（1）氣相色譜分析結(jié)構(gòu)載氣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)色譜柱和柱箱檢測(cè)系統(tǒng)記錄系統(tǒng)（2）常用的術(shù)語(yǔ)：基線：當(dāng)色譜柱未接受任何組分進(jìn)入檢測(cè)器時(shí)系統(tǒng)噪音隨時(shí)間變化的曲線。正常情況下應(yīng)是一條直線；保留值：為試樣中各組分在色譜柱中滯留時(shí)間的數(shù)字，以時(shí)間或以組分帶出色譜柱所需載氣的體積表示；區(qū)域?qū)挾龋菏巧V峰區(qū)域的寬度，是一個(gè)重要的參數(shù)，區(qū)域?qū)挾仍秸V分析的精度越細(xì)。（3）氣相色譜的用途根據(jù)色譜峰的位置進(jìn)行定性分析根據(jù)色譜峰的位置及其寬度進(jìn)行定量測(cè)定高效能、選擇性好、靈敏度高（可以檢測(cè)10-11~10-13g）并且操作簡(jiǎn)便；可分析易揮發(fā)或可轉(zhuǎn)換成易揮發(fā)的液體和氣體；可分析有機(jī)物和部分無(wú)機(jī)物；沸點(diǎn)在500℃以下，熱穩(wěn)定性好，分子量在400

以下的物質(zhì)原則上可用。（4）氣相色譜分析特點(diǎn)：圖1乳桿菌非揮發(fā)性代謝有機(jī)酸圖2韋榮菌揮發(fā)性代謝有機(jī)酸色譜流出曲線色譜流出曲線圖4

產(chǎn)黑色素類(lèi)桿菌揮發(fā)性代謝有機(jī)酸圖3

粘放菌非揮發(fā)性代謝有機(jī)酸色譜流出曲線色譜流出曲線圖5

消化鏈球菌揮發(fā)性代謝有機(jī)酸圖6

核梭桿菌揮發(fā)性代謝有機(jī)酸色譜流出曲線色譜流出曲線2.裂解氣相色譜分析法原理是將分子量較大的物質(zhì)，在高溫下裂解，然后進(jìn)行分離。彌補(bǔ)氣相色譜分析技術(shù)的不足，適用于難揮發(fā)和熱不穩(wěn)定性物質(zhì)的分析。四、分子生物學(xué)鑒定傳統(tǒng)分類(lèi)和鑒定方法，在很大程度上依賴于對(duì)

病原菌的成功分離和培養(yǎng)，一般認(rèn)為能用現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)的微生物僅占總數(shù)的1%左右，而不能培養(yǎng)的微生物才是微生物群落多樣性的主體。對(duì)口腔微生物，40%~50%的細(xì)菌用現(xiàn)有技術(shù)仍不能培養(yǎng)。PCR技術(shù)的發(fā)展開(kāi)辟了細(xì)