流式結(jié)果分析JSS

流式結(jié)果分析流式原理流式細(xì)胞儀通常以激光作為發(fā)光源。經(jīng)過(guò)聚焦整形后的光束，垂直照射在樣品流上，被熒光染色的細(xì)胞在激光束的照射下，產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。這兩種信號(hào)同時(shí)被前向光電二極管和90°方向的光電倍增管接收。光散射信號(hào)在前向小角度進(jìn)行檢測(cè)，這種信號(hào)基本上反映了細(xì)胞體積的大??；熒光信號(hào)的接受方向與激光束垂直，經(jīng)過(guò)一系列雙色性反射鏡和帶通濾光片的分離，形成多個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。流式原理流式常用細(xì)胞特征細(xì)胞組成細(xì)胞功能大小細(xì)胞表面/胞漿/核--特異性抗原粒度細(xì)胞活性DNA,RNA含量胞內(nèi)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)含量激素結(jié)合位點(diǎn)鈣離子,PH值,膜電位酶活性流式常用實(shí)驗(yàn)1、細(xì)胞凋亡2、細(xì)胞周期測(cè)定3、膜電位檢測(cè)4、表面分子測(cè)定流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡常用檢測(cè)試劑盒：FITC-PI(常見(jiàn)細(xì)胞)PE-ADD（綠色熒光的細(xì)胞）流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)細(xì)胞周期

PI為非膜通透性染料，不能染活細(xì)胞。在流式染色時(shí)通過(guò)Triton等的作用，進(jìn)入細(xì)胞與DNA結(jié)合而發(fā)出熒光，通過(guò)檢測(cè)顆粒中熒光強(qiáng)度測(cè)得相對(duì)DNA含量，根據(jù)細(xì)胞在不同周期中DNA含量的不同，將細(xì)胞分為不同的周期。破膜的方法：1、triton打孔2、70%乙醇固定3、低滲法（比較簡(jiǎn)單）流式檢測(cè)細(xì)胞周期表面標(biāo)志物、蛋白等

將所要檢測(cè)的蛋白用帶有熒光標(biāo)記的一抗孵育后，蛋白就會(huì)帶上相應(yīng)的熒光，之后用流式檢測(cè)熒光值，便可得到表達(dá)情況表面標(biāo)志物——以CD44為例線粒體膜電位的檢測(cè)

線粒體在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著樞紐作用，線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽(yáng)離子熒光染料如DiOC6、JC-1、TMRM等可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。JC-1檢測(cè)原理

JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，低濃度時(shí)，以單體存在，可檢測(cè)到綠色熒光，用流式檢測(cè)時(shí)，通常為FL-1通道(和FITC同通道）高濃度時(shí)，以多聚體存在，可檢測(cè)到紅光，流式檢測(cè)通常為FL-2通道（和PE同通道)。因JC-1濃度的變化,在單體和多聚體之間形成一個(gè)可逆的轉(zhuǎn)變過(guò)程。

正常細(xì)胞，膜電位正常時(shí)，JC-1通過(guò)線粒體膜極性進(jìn)入線粒體內(nèi)，并因濃度升高而形成發(fā)射紅色熒光的多聚體，而凋亡細(xì)胞，線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，濃度降低，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的