菌種科學(xué)保藏常用方法課件

菌種保藏技術(shù)主講:傅文紅主要內(nèi)容:一、菌種保藏的目的二、菌種保藏的原理（掌握）三、菌種保藏的方法（重點(diǎn)）什么是菌種衰退？生產(chǎn)菌株性狀的劣化或遺傳標(biāo)記的丟失：1、菌落形態(tài)的改變2、生長速度緩慢3、生產(chǎn)能力下降4、抗不良環(huán)境能力減弱（抗噬菌體、低溫等）菌種退化的防止1、減少傳代次數(shù)2、用單核細(xì)胞和單菌落移種傳代3、菌種純化4、采用良好培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件5、科學(xué)的保藏一、菌種保藏的目的

菌種保藏的目的是：使菌種長期保藏之后，仍然保持著原有的生命力、優(yōu)良生產(chǎn)性能、形態(tài)特征，以及不污染雜菌和不發(fā)生蟲害。二、菌種保藏的原理菌種保藏的原理是通過低溫、干燥、隔絕空氣（真空）和斷絕營養(yǎng)、加保護(hù)劑等手段，以達(dá)到最大限度地降低菌種的代謝強(qiáng)度，抑制微生物的生長與繁殖。由于菌種的代謝相對(duì)靜止，生命活動(dòng)將處休眠狀態(tài)，所以能夠保藏較長時(shí)間。三、菌種保藏的方法1、斜面低溫保藏

（定期移植法）2、液體石蠟保藏3、砂土管貯藏4、

麩皮保藏法5、懸液保藏

：

1）生理鹽水保藏法；2）蒸餾水保藏法：

6、冷凍真空干燥保藏法7、液氮超低溫保藏法8、甘油保藏法斜面低溫保藏(定期移植法)這是一種常用最簡便的保藏方法。為了減少培養(yǎng)基水分散發(fā)，延長保藏時(shí)間，在配制時(shí)瓊脂用量加到2.5％，再加入0.2％磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀及碳酸鈣等緩沖劑，以中和保藏過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸。可以用無菌膠塞代替棉塞，既能防止污染，又可隔絕氧氣，避免斜面干燥細(xì)菌：1個(gè)月，酵母菌3個(gè)月，放線菌、霉菌半年。二）、液體石蠟法

操作簡便，只要在菌苔上灌注一層無菌的液體石蠟，即可使菌種與外界空氣隔絕，達(dá)到防止培養(yǎng)基水分散失，抑制菌絲新陳代謝，推遲菌種老化，延長菌種生命和保存時(shí)間的目的。此種方法也稱為隔絕空氣保藏法。

三）、砂土管貯藏：此法應(yīng)用廣泛，適于貯藏孢子和酵母狀分生孢子，而對(duì)菌絲體不適用。此法保藏孢子，壽命可達(dá)2～10年，使用時(shí)在無菌條件下，挑取少許砂土孢子，抖撒在PDA斜面上，適溫培養(yǎng)，菌絲生長后，再轉(zhuǎn)管培養(yǎng)1次。

1.準(zhǔn)備砂土:

細(xì)河砂，用內(nèi)徑0.250～0.177毫米篩孔過篩,除去粗粒和砂未；

紅黃壤土，內(nèi)徑0.149毫米過篩，用磁鐵襯紙吸除砂土中鐵屑，用0.05～0.1N鹽酸浸泡半天，除去有機(jī)質(zhì)。然后用清水反復(fù)沖洗至酸堿度近中性后，置于60～80℃烘箱中烘干。砂土比例2:1或4:1混合，分裝入10毫米×100毫米試管或安瓿瓶內(nèi)，每管裝量0.5克，經(jīng)0.11兆帕121℃高壓滅菌30分鐘，每天1次，共3次，或160℃干熱滅菌1次，保持2～3小時(shí)。滅菌后挑取少許砂土移至PDA斜面上培養(yǎng)，證實(shí)無雜菌即可。2、接種:

干接：用接種環(huán)直接挑取孢子2～3環(huán)，拌入砂土管中濕接：將孢子刮入5毫升無菌水的試管內(nèi)，充分搖勻，制在孢子懸液，然后用1毫升吸管吸取懸液，每管中加入0.2毫升。3、貯藏：干接法制成的砂土管，直接放在盛有無水氯化鈣、變色硅膠或生石灰的廣口瓶內(nèi)保存：濕接法制成的砂土管，用真空泵抽氣8～10小時(shí)，使之干燥。放在盛有無水氯化鈣或變色硅膠的大試管內(nèi)，加橡皮塞，放置4～6℃冰箱中貯藏。四）麩皮保藏法亦稱曲法保藏。即以麩皮作載體，吸附接入孢子，然后在低溫干燥條件下保存。其制作方法將麩皮與水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。此法適用于產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。因操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，工廠較多采用。中國科學(xué)院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可達(dá)數(shù)年至數(shù)十年。五）、蒸餾水保藏法：這是保存斜面菌種和孢子最簡單的方法，有效期可達(dá)1年以上。1、斜面蒸餾水貯藏：在無菌條件下，將無菌蒸餾水傾注入需保藏的斜面菌種內(nèi)。加水量需高出斜面頂端1～2厘米，更換無菌橡皮塞，直立置于4～6℃冰箱內(nèi)貯藏。2、孢子蒸餾水貯藏：無菌條件下提取少許孢子，移入試管無菌蒸餾水內(nèi)，換上橡皮塞，直立置于4～6℃冰箱內(nèi)貯藏。若保存時(shí)間較長，中途需補(bǔ)充無菌蒸餾水。使用時(shí)從管內(nèi)挑取菌種塊或蘸取孢子懸液，移接至新的斜面培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)。原試管加塞后仍可繼續(xù)貯藏。六）、冷凍真空干燥保藏法1、安瓿瓶的準(zhǔn)備：

2、保護(hù)劑的選擇：3、冷凍干燥裝置：4、制備孢子液5、預(yù)凍孢子液：6、減壓干燥7、真空熔封：

六）、冷凍真空干燥保藏法

1、安瓿瓶的準(zhǔn)備：安瓿瓶的玻璃應(yīng)能經(jīng)受溫度的突變而不破裂，先用2％鹽酸浸泡12小時(shí)，再用清水洗滌3次，然后用蒸餾水洗凈、烤干；瓶口加棉塞，滅菌后備用。

2、保護(hù)劑的選擇：保護(hù)劑的作用是使細(xì)胞在凍干過程中免受損傷及減少在保藏過程中的死亡。保護(hù)劑種類很多，如牛馬血清、無菌牛奶等，多數(shù)菌種保藏是脫脂牛奶。

3、冷凍干燥裝置：這個(gè)裝置包括1臺(tái)真空泵、1付麥?zhǔn)险婵沼?jì)、1個(gè)緩沖瓶、1個(gè)真空干燥器（內(nèi)裝五氧化二磷或無水氯化鈣等干燥劑）和1個(gè)冷凍槽（內(nèi)盛有1:3的食鹽和碎冰塊）。六）、冷凍真空干燥保藏法7、真空熔封：菌種安瓿瓶經(jīng)減壓干燥后，應(yīng)立即取出安裝在封口用的玻璃抽氣管上，進(jìn)行抽氣熔封管口。邊抽氣，邊用煤氣或酒精燈的細(xì)火焰，對(duì)準(zhǔn)安瓿瓶中央，即可熔斷封口。熔封時(shí)應(yīng)注意火焰，不宜過大。

安瓿瓶菌種啟用時(shí)，在無菌操作下打開這瓿瓶，加入0.3～0.5毫升的無菌生理鹽水或1％麥芽汁即可使用。

由于真空干燥保藏的菌種是密封在安瓿瓶里的，因此不僅郵寄運(yùn)輸方便，并且不會(huì)污染雜菌。此法適于能形成孢子的菇類長期保藏，其設(shè)備和操作均較復(fù)雜。

七）、液態(tài)氮超低溫保藏

將要保藏菌種的懸浮液或菌塊，密封于盛有保護(hù)劑的安瓿瓶里，先在控制的條件下致冷，使之緩速預(yù)凍，再置于-150至-196℃液態(tài)氮超低溫冰箱中保藏。優(yōu)點(diǎn)：保存時(shí)間可長達(dá)數(shù)年至數(shù)十年；適用范圍廣，對(duì)一些即使不耐低溫菌種，如草菇等，也可在保護(hù)劑的保護(hù)下進(jìn)行超低溫保存；此外，經(jīng)保藏的菌種基本上不發(fā)生變異。國內(nèi)主要的菌種保藏機(jī)構(gòu)1、CCTCC中國典型培養(yǎng)物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，簡稱CCTCC):CCTCC保藏的微生物包括細(xì)菌、放線菌、酵母菌、真菌、單細(xì)胞藻類、人和動(dòng)物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、雜交瘤、原生動(dòng)物，地衣，植物組織培養(yǎng)、植物種子、動(dòng)植物病毒、噬菌體、質(zhì)粒和基因文庫等各類微生物（生物材料/菌種）。/

國內(nèi)主要的菌種保藏機(jī)構(gòu)2、CGMCC普通微生物菌種保藏管理中心:CGMCC的宗旨是廣泛收集國內(nèi)外的微生物資源，妥善保存，以公開的保藏機(jī)構(gòu)的名義為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護(hù)、科研教育提供標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)材料,在保證生物安全和保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的前提下，為第三者能夠自由地利用各種微生物材料提供服務(wù)，最大限度的實(shí)現(xiàn)微生物資源的保護(hù)、共享和持續(xù)利用。

國內(nèi)主要的菌種保藏機(jī)構(gòu)3、CICC中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心:我國唯一的國家級(jí)工業(yè)微生物菌種資源保藏管理中心，保藏各種工業(yè)微生物菌種資源包括：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌和大型真菌，共67個(gè)屬251種，近3000株，庫藏備份80000余支。/

國外主要菌種保藏機(jī)構(gòu)1、ATCC(AmericanTypeCultureCollection）美國典型菌種保藏中心:主要從事農(nóng)業(yè)、遺傳學(xué)、應(yīng)用微生物、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、工業(yè)微生物學(xué)、菌種保藏方法、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)、分子生物學(xué)、植物病理學(xué)、普通微生物學(xué)、分類學(xué)、食品科學(xué)等的研究。該中心保藏有藻類111株，細(xì)菌和抗生素16865株，細(xì)胞和雜合細(xì)胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動(dòng)物1800株，動(dòng)物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。另外，該中心還提供菌種的分離、鑒定及保藏服務(wù)。該中心保藏的菌種可出售。

國外主要菌種保藏機(jī)構(gòu)2、NBRC(NITEBiologicalResourceCenter)：日本技術(shù)評(píng)價(jià)研究所生物資源中心

3、NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)：美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心

4、CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures)荷蘭微生物菌種保藏中心

5、KCTC(KoreanCollectionforTypeCultures)韓國典型菌種保藏中心

6、DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroor