從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)方案

資料范本本資料為word版本，可以直接編輯和打印，感謝您的下載從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)方案地點(diǎn)： 時(shí)間： 說(shuō)明：本資料適用于約定雙方經(jīng)過(guò)談判，協(xié)商而共同承認(rèn)，共同遵守的責(zé)任與義務(wù)，僅供參考，文檔可直接下載或修改，不需要的部分可直接刪除，使用時(shí)請(qǐng)?jiān)敿?xì)閱讀內(nèi)容土壤中產(chǎn)淀粉酶芽胞桿菌的篩選及其淀粉酶活力的測(cè)

定設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)方案^、綜述：淀粉酶是淀粉降解酶。它們廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物體中。它們將淀粉及相關(guān)的聚合物分解為帶有具體淀粉分解酶特征的產(chǎn)品。淀粉酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多，特點(diǎn)各異,可應(yīng)用于造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑］等多種領(lǐng)域。在釀造發(fā)酵工業(yè)如酒精生產(chǎn)、啤酒制造、發(fā)酵原料液化及糖化工藝過(guò)程中均有重要價(jià)值，如添加淀粉酶分布非常廣泛，是人們經(jīng)常研究的一種酶。從紡織工業(yè)到廢水處理，這些酶都有不同規(guī)模的應(yīng)用【1】。常見產(chǎn)淀粉酶的主要為芽孢桿菌屬。其中的常見產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌菌種有：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌【2】、凝結(jié)芽孢【3】。由于芽孢桿菌屬是一類好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生抱子的桿狀細(xì)菌，許多為腐生菌，主要分布于土壤和植物體表面及水體中【4】。所以此次實(shí)驗(yàn)從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊罅私馍锓蛛x提純的原理和方法技術(shù)掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理和方法掌握微生物搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測(cè)定的原理和方法培養(yǎng)學(xué)生的綜合應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)方法的能力培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程、綜合分析問題解決問題和判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果的能力。三、 實(shí)驗(yàn)原理自然界中，土壤是微生物生活最適宜的環(huán)境。土壤具有微生物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖和生命活動(dòng)中所需的各種條件。土壤中微生物的數(shù)量因土壤類型、季節(jié)、土層深度與層次等不同而異。一般地說(shuō)，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表10cm?30cm的土層中菌數(shù)最多，隨土層加深，菌的數(shù)量減少【5】。從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。值得指出的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。芽孢桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽(yáng)性；接觸酶陽(yáng)性；水解淀粉；VP試驗(yàn)陽(yáng)性；不產(chǎn)生吲噪；苯甲氨酸不脫氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不產(chǎn)生二羥丙酮；營(yíng)養(yǎng)體的最高生長(zhǎng)溫度大約從25°C到75°C以上；最低生長(zhǎng)溫度大約5°C到45C；生長(zhǎng)最低pH值，從7.5—8到2左右；耐鹽范圍從低于2%的NaCl到25%NaCl；營(yíng)養(yǎng)明膠（22C）7天內(nèi)液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌在糖發(fā)酵試驗(yàn)用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可產(chǎn)酸；作為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的最低限培養(yǎng)基是無(wú)維生素的，但含有葡萄糖、檸檬酸鹽和一個(gè)氨態(tài)鹽作為唯一的碳源和氮源【6】。細(xì)菌特性繁殖快速:代謝快、繁殖快，四小時(shí)增殖10萬(wàn)倍，標(biāo)準(zhǔn)菌四小時(shí)僅可繁殖6倍。生命力強(qiáng):無(wú)濕狀態(tài)可耐低溫-60C、耐高溫+280C，耐強(qiáng)酸、耐強(qiáng)堿、抗菌消毒、耐高氧（嗜氧繁殖）、耐低氧（厭氧繁殖）。體積大:體積比一般病源菌分子大四倍數(shù)，占據(jù)空間優(yōu)勢(shì)，抑制有害菌的生長(zhǎng)繁殖。四、實(shí)驗(yàn)材料和用具4.1土樣采集：采集廣大植物園內(nèi)的有機(jī)土壤，和生化樓下花壇的有機(jī)土壤4.2營(yíng)養(yǎng)瓊脂（%）:蛋白胨1牛肉膏0.3氯化鈉0.5瓊脂1.5?2.0蒸餾水將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH至7.2?7.4。加入瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化。4.3淀粉牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（%）:可溶性淀粉0.2牛肉0.3蛋白1.0氯化鈉0.5瓊脂1.5?2.0校正pH至7.2?7.44.4發(fā)酵培養(yǎng)基（%）:玉米粉2黃豆餅粉1.5CaCl0.02MgSO40.02NaCl0.25K2HPO40.2檸檬酸鈉0.2硫酸氨0.075（溶解后加）Na2HPO40.2校正pH值7.04.5葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（V.P試驗(yàn)用）（%）:葡萄糖0.5蛋白胨0.5K2HPO40.2校正pH7.2?7.44.6蛋白胨水培養(yǎng)基（吲噪試驗(yàn)用）（%）:蛋白胨1%氯化鈉0.5%校正pH7.2?7.44.7西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基（%）:氯化鈉0.5硫酸鎂（MgSO4?7H2O）0.02磷酸二氫銨0.1磷酸氫二鉀0.1檸檬酸0.5瓊脂2漠麝香草酚藍(lán)溶液4酚紅試劑校正pH6.8先將鹽類溶解于水中，校正pH，再加入瓊脂，加熱融化，然后加入指示劑，混勻后分裝試管，121°C高溫滅菌15min。4.8配制營(yíng)養(yǎng)明膠培養(yǎng)基（%）:蛋白胨0.5、牛肉膏0.3、明膠1.2，調(diào)pH6.8~7.04.9耐鹽培養(yǎng)基（%）:=1\*GB3①蛋白胨1牛肉膏0.3氯化鈉2瓊脂1.5?2.0蒸餾水=2\*GB3②蛋白胨1牛肉膏0.3氯化鈉10瓊脂1.5?2.0蒸餾水=3\*GB3③蛋白胨1牛肉膏0.3氯化鈉20瓊脂1.5?2.0蒸餾水=4\*GB3④蛋白胨1牛肉膏0.3氯化鈉25瓊脂1.5?2.0蒸餾水加入15%氫氧化鈉溶液約2mL,校正pH至7.2?7.4。加入瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。4.10溶液或試劑染料革蘭氏染色：草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇；芽孢染色：5%孔雀綠溶液，石炭酸復(fù)紅液；香柏油、二甲苯吲噪試驗(yàn)：乙醚、吲噪試劑V.P.試驗(yàn)：40%NaOH溶液、a-奈酚，淀粉酶活力測(cè)定：1%3,5-二硝基水楊酸試劑4.11儀器或其它用具無(wú)菌玻璃涂棒無(wú)菌吸管接種環(huán)無(wú)菌培養(yǎng)皿土樣三角瓶燒杯洗瓶玻棒試管酒精燈擦鏡紙接種環(huán)酒精燈載玻片吸水紙等。恒溫?fù)u床恒溫培養(yǎng)箱高壓蒸汽滅菌箱超凈工作臺(tái)水浴箱紫外燈照射箱磁力攪拌器玻璃珠移液管涂布器顯微鏡五、實(shí)驗(yàn)方法及步驟1、初篩方法制菌懸液：兩個(gè)土樣分別取5g，放入各自裝有45mL無(wú)菌水的三角瓶，振蕩10min,即為稀釋10-1的土壤懸浮液。每個(gè)環(huán)境的土樣裝1個(gè)錐形瓶，共2個(gè)，同時(shí)將其分為4組，編號(hào)AB。加熱篩選有芽孢的菌：將2個(gè)錐形瓶加塞、包扎、搖勻（無(wú)菌室里），利用恒溫水浴裝置100°C左右水浴，水浴鍋溫度恒定后維持15min（制懸液時(shí)就應(yīng)先開始加熱），制成10-1g/ml的土壤懸液梯度稀釋菌懸液：再分別另取裝有9mL無(wú)菌水試管5支，用記號(hào)筆編上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀釋成10-1土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無(wú)菌的移液器吸取1mL土壤懸液加入10-2的無(wú)菌水的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成10-2土壤稀釋液。同法從10-2的試管中吸取1mL稀釋液加入編號(hào)為10-3的無(wú)菌水試管中，混勻后即為10-3土壤稀釋液，依次連續(xù)稀釋為10-4、10-5土壤稀釋液。在土壤稀釋過(guò)程中，用相同的移液槍頭由濃到稀來(lái)稀釋。涂布平板用一支新的無(wú)菌槍頭，由低濃度開始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對(duì)號(hào)較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用灼燒冷卻后的無(wú)菌玻璃涂棒涂勻。每個(gè)濃度做3個(gè)平板（重復(fù)）°37°C下恒溫培養(yǎng)24h。2、 復(fù)篩方法【1】劃線接種（分區(qū)劃線法）：在上述不同稀釋度培養(yǎng)基中挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行分區(qū)劃線，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第1次平行劃線3~4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約60。角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第1次劃線部分作第2次平行劃線，再用同法通過(guò)第2次平行劃線部分作第3次平行劃線和通過(guò)第3次平行劃線部分作第4次平行劃線（如右圖）。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于28~29°C溫室中培養(yǎng)約20h.。再繼續(xù)分區(qū)劃線2-3次，以獲得較純的菌種。將純化得到的單菌落分為兩部分，其中一部分接種到培養(yǎng)基內(nèi)，用以保存菌種，另一部分用來(lái)做染色實(shí)驗(yàn)。3、 獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不一致的點(diǎn)接于倒好的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基中，一個(gè)土樣取8個(gè)平板兩兩標(biāo)記同一位置同序號(hào)標(biāo)記，一平板分5個(gè)區(qū)域，點(diǎn)接重復(fù)兩次，在37C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。上述點(diǎn)接后的平板中取出一組四個(gè)分好區(qū)域的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基平板于實(shí)驗(yàn)室，其他置于無(wú)菌室。實(shí)驗(yàn)室里，四個(gè)平板均加入碘液，立即觀察記錄陽(yáng)性和陰性菌落所在位置，并可同時(shí)記錄透明圈的大小。根據(jù)所記錄的陽(yáng)性菌的編號(hào)，利用另一組中的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上其對(duì)應(yīng)的菌落繼續(xù)劃線接種，培養(yǎng)后將出現(xiàn)的形態(tài)特征不一致的菌落進(jìn)行編號(hào)，然后挑取部分出來(lái)進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)出現(xiàn)形態(tài)、大小、顏色一致且為桿菌的菌體，則將其對(duì)應(yīng)的菌種劃線接種到新的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，標(biāo)記，37°C下培養(yǎng)24h。否則繼續(xù)進(jìn)行劃線分離，培養(yǎng)后再經(jīng)革蘭氏染色鏡檢直至得到純種桿菌后進(jìn)行芽孢染色。篩選出芽孢純種后進(jìn)行斜面接種。革蘭氏染色步驟：涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無(wú)紫色。媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約15—20秒，后立即用流水沖洗。復(fù)染：滴加番紅染色液，染3—5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。鏡檢：油鏡觀察染色結(jié)果。芽孢染色染色鏡檢：?取37C培養(yǎng)18?24h的枯草芽孢桿菌涂片，干燥，固定。?于涂片上滴人3?5滴5%孔雀綠水溶液。?用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時(shí)，開始計(jì)算時(shí)間約4?5min。加熱過(guò)程中切勿使染料蒸干，必要時(shí)可添加少許染料。?傾去染液，待玻片冷卻后，水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。?用石炭酸復(fù)紅液復(fù)染lmin，水洗。?制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。（注：觀察芽孢的形狀和位置，查伯杰細(xì)菌手冊(cè)）斜面保存菌種?貼標(biāo)簽取各種無(wú)菌斜面試管數(shù)支，將注有菌株名稱和接種日期的標(biāo)簽貼上，貼在試管斜面的正上方，距試管口2?3cm處。（每種菌接3管，標(biāo)上相同編號(hào)也要與平板上菌落編號(hào)相對(duì)應(yīng)）。進(jìn)行斜面接種操作，加塞、包扎好到37°C培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h。5、菌種的鑒定5.1所得的斜面菌種接種到新的平板上培養(yǎng)以觀察篩選出的產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌菌落的大小、顏色、干濕情況、形態(tài)、高度、透明程度、邊緣、是否易被挑起、氣味等。然后進(jìn)行一系列的鏡檢一一革蘭氏染色、芽孢染色（具體步驟同上）觀察是否符合附表中芽孢桿菌的指標(biāo)5.2生理生化試驗(yàn)溫度對(duì)菌種培養(yǎng)的影響；淀粉水解試驗(yàn)；溫度對(duì)菌種的影響；明膠液化試驗(yàn)；糖發(fā)酵試驗(yàn)；乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V.P試驗(yàn)）；吲噪試驗(yàn)；耐鹽性試驗(yàn)；檸檬酸鹽利用試驗(yàn)。?溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基熔化倒平板。（培養(yǎng)基厚度為一般培養(yǎng)基的1.5到2倍）取30套牛肉膏蛋白胨平板，分別進(jìn)行標(biāo)號(hào)。 在上述各平板中分別劃線接種不同的菌種，每個(gè)菌種重復(fù)接種六個(gè)平板。各取每個(gè)菌種兩套平板倒置于4C（冰箱）、37C（或者室溫），60C下保溫培養(yǎng)24小時(shí)，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。（“一”不生長(zhǎng)，"+”生長(zhǎng)較差， "++”生長(zhǎng)一般，"+++”生長(zhǎng)良好。?淀粉水解實(shí)驗(yàn)以18-24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個(gè)平板可分區(qū)劃"+“字接種，）或直接移種于淀粉肉湯中，于36±1C培養(yǎng)24-48h，或于20C培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無(wú)色透明環(huán)、或肉湯顏色無(wú)變化。陰性反應(yīng)則無(wú)透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過(guò)程，因而試驗(yàn)結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時(shí)間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時(shí)制備為妥。?糖類發(fā)酵試驗(yàn)（葡萄糖、木糖和乳糖發(fā)酵）用小砂輪輕輕切割發(fā)酵管沒有標(biāo)簽和標(biāo)識(shí)的另外一端，注意保留標(biāo)簽和糖的名稱。用接種針將各種桿菌分別接種于兩種發(fā)酵管內(nèi)，每種發(fā)酵管重復(fù)兩次，標(biāo)記，要與斜面菌種標(biāo)記相對(duì)應(yīng)。兩種發(fā)酵管各設(shè)一支不接種，作為空白對(duì)照。注意接種的整個(gè)過(guò)程中，不能人為的制造氣泡，若發(fā)酵管內(nèi)有氣泡，則輕輕甩動(dòng)發(fā)酵管直至氣泡消失。若氣泡不能退去，則該管作廢應(yīng)重做一管。接種后，每一管外包一層無(wú)菌紙，以防污染。接種完畢后，將全部發(fā)酵管倒置于干凈小燒杯內(nèi)，37°C培養(yǎng)24h。觀察記錄：與對(duì)照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“一”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽(yáng)性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“+”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽(yáng)性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“+”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“一”。?乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（V.P試驗(yàn)）標(biāo)記試管：取裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，編號(hào)。接種培養(yǎng)以無(wú)菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對(duì)照管不接菌，置37C恒溫箱中，培養(yǎng)24h。觀察記錄取出以上試管，充分振蕩2min。每管分別加入40%Na0H溶液10?20滴，并加等量a-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37C恒溫箱中保溫15?30min后，若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V.P.試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)（用“+”表示）；若不呈紅