氨基酸總量測定作業(yè)指導(dǎo)書

氨基酸總量測定作業(yè)指導(dǎo)書蛋白質(zhì)經(jīng)水解或酶解可由大分子變成小的蛋白質(zhì)成分，如水解后的產(chǎn)物經(jīng)月示、胨、肽等最后變成為氨基酸，氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)最基本的物質(zhì)。水解后的蛋白質(zhì)和水解前的蛋白質(zhì)在物理特性、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及被吸收消化的程度上是很不相同的，其差別與水解的程度有密切關(guān)系，分析氨基酸的含量就可以知道水解的程度，也就可以評價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值。氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測定17種氨基酸(儀器價(jià)格昂貴，不能普便使用)，很多氨基酸可以同時(shí)存在于一種食品中，所以需要測定總的氨基酸量。它們不能以氨基酸的百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氨(氨基酸態(tài)氮)的百分率來表示。當(dāng)然，如果食品中只含有一種氨基酸，如味精中的谷氨酸，就可以從氮量計(jì)算出氨基酸的含量。在評價(jià)蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值時(shí)，除了測定蛋白質(zhì)的含量，氨基酸氮量，還需要對各種氨基酸進(jìn)行分離、鑒定，尤其對8種人體必需氨基酸進(jìn)行定性定量分析。1.1 單指示劑甲醛滴定法原理氨基酸具有酸、堿兩重性質(zhì)，因?yàn)榘被岷小狢OOH基顯示酸性，又含有—NH2基顯示堿性。由于這兩個(gè)基的相互作用，使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，—NH2與甲醛結(jié)合，其堿性消失，破壞內(nèi)鹽的存在，就用堿來滴定—COOH基，以間接方法測定氨基酸的量。反應(yīng)式以下面三種形式存在：試劑40%中性甲醛溶液，以麝香草酚酞為指示劑，以mol/LNaOH溶液中和0.1%麝香草酚酞乙醇溶液；0.100mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。操作步驟稱取一定量樣品(約含20毫克左右的氨基酸)于燒杯中(如為固體加水50毫升)，加2～3滴指示劑，用0.100mol/LNaOH液滴定至淡藍(lán)色。加入中性甲醛20毫升，搖勻，靜置1分鐘，此時(shí)藍(lán)色應(yīng)消失。再用0.100mol/LNaOH溶液滴定至淡藍(lán)色，記錄兩次滴定所消耗的堿液毫升數(shù)，用下述公式計(jì)算氨基酸氮的含量。計(jì)算氨基酸態(tài)氮(%)=MV×0.014×100/W式中：M—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液摩爾濃度V—?dú)溲趸瘍?nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的總量(毫升)W—樣品溶液相當(dāng)樣品重量(克)0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量g/mmol1.2 雙指示劑甲醛滴定法原理與單色法相同，只是在此法中使用兩種指示劑。從分析結(jié)果看，雙指示劑甲醛滴定法與亞硝酸氮?dú)馊萘糠?此法操作復(fù)雜，但準(zhǔn)確，不作介紹)相近。單色滴定法稍偏低，主要因?yàn)閱沃竸┘兹┑味ǚㄒ园被醦H值作為麝香酚酞的終點(diǎn)，pH值在9.3。而雙指示劑法是以氨基酸溶液的pH值作為中性紅的終點(diǎn)，pH值為7.0。從理論計(jì)算看，雙色滴定法較為準(zhǔn)確。試劑三種試劑同單指示劑法0.1%中性紅(50%乙醇溶液)操作步驟取相同的兩份樣品，分別注入100毫升三角瓶當(dāng)中，一份加入中性紅指示劑2～3滴，用0.100mol/LNaOH溶液滴定終點(diǎn)(由紅變琥珀色)，記錄用量，另一份加麝香草酚酞3滴和中性甲醛20毫升，搖勻，以0.100mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡藍(lán)色。按下述公式計(jì)算計(jì)算氨基態(tài)氮(%)=M(V2-V1)×0.014/W×100式中：V2—用麝香草酚酞為指示劑時(shí)消耗標(biāo)準(zhǔn)堿液量(毫升)V1—用中性紅作指示劑時(shí)堿液的消耗量(毫升)M—標(biāo)準(zhǔn)堿摩爾濃度W—樣品的重量(克)0.014—氮的量毫摩爾質(zhì)量(g/mmol)注意事項(xiàng)單色指示劑甲醛滴定法，用堿完全中和—COOH基時(shí)pH8.5～9.5。測定時(shí)樣品的顏色較深，應(yīng)加活性炭脫色之后再滴定。1.3茚三酮比色法原理氨基酸在一定pH范圍內(nèi)，能與茚三酮生成藍(lán)紫色化合物，可以比色定量。反應(yīng)式如下：這種反應(yīng)不是特異反應(yīng)，主要根據(jù)氨基酸的性質(zhì)而定。根據(jù)目前的報(bào)道，認(rèn)為在一些事例中，都能觀察到形成紫色的雙一1，3一二酮茚。試劑磷酸緩沖液(pH8.04)：制備方法如下：先配M/15磷酸二氫鉀液：取磷酸二氫鉀4.5350克溶于水中，定容至500毫升。M/15磷酸氫二鈉液：稱取Na2HPO4·12H2O11.9380克，溶于水中，定容至500毫升。取M/15磷酸二氫鉀10毫升與M/15磷酸氫二鈉190毫升混合即為pH8.04的磷酸緩沖液。2%茚三酮液：稱取茚三酮1克，溶于35ml熱水中，加入毫克氯化亞錫(SnCl2·H2O)，攪拌過濾(作防腐劑)。置冷暗處過夜，定容至50毫升?；針?biāo)準(zhǔn)液：稱取試劑純干燥氨基酸(如異亮氨酸)0.2000克，先用少許水溶解并定容至100毫升，搖勻。從容量瓶中取出10毫升于100毫升容量瓶中，加水至刻度。每毫升含氨基酸為200微克/毫升。操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精確吸取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(200微克/毫升)0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0……毫升(相當(dāng)于0，100，200，300，400，500，600……微克氨基酸)，分別注入幾個(gè)25毫升容量瓶中，加水補(bǔ)足為4毫升，再加入茚三酮和磷酸鹽緩沖液各1毫升，混合均勻。于水浴上加熱15分鐘，取出迅速冷至室溫，加水至刻度，搖勻。靜置15分鐘，在570納米波長下測定消光值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的處理同單指示劑法，取澄清的樣品溶液2～4毫升，以下同標(biāo)準(zhǔn)曲線操作。以水代替樣液同時(shí)作一空白，在570納米波長下，測定消光值。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得氨基酸微克量，按下列公式計(jì)算出樣品中氨基酸含量：氨基酸總量(毫克%)=C/（W×1000）×100式中：C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得氨基酸數(shù)量(微克)W—測定的樣品溶液相當(dāng)于樣品的重量(克)1000—把微克換算成毫克注意事項(xiàng)茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響易被氧化呈顯淡紅或深紅色，使用前要進(jìn)行純化，方法如下：10克茚三酮溶于40毫升熱水中，加入1.0