分離科學(xué)與技術(shù)

7/7分離科學(xué)與技術(shù)分離科學(xué)與技術(shù)

技術(shù)比分離技術(shù)明顯地顯得豐富多樣且高效先進(jìn)。例如，色譜技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)和紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振譜、氨基酸序列分析等等對(duì)微量樣品的分析鑒定技術(shù)都已較普遍地得到應(yīng)用。而對(duì)物質(zhì)的分離純化技術(shù)則顯得較為匱乏。面對(duì)社會(huì)的進(jìn)步和人類對(duì)高科技含量精制產(chǎn)品的要求，極其缺乏既能實(shí)現(xiàn)高純度物質(zhì)的分離純化，又能實(shí)現(xiàn)相當(dāng)量級(jí)制備能力的新技術(shù)[3]。如果沒有這樣的新技術(shù)，就很難實(shí)現(xiàn)新一代產(chǎn)物的研發(fā)與生產(chǎn)，就不能實(shí)現(xiàn)高純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備和高精度質(zhì)量檢定與控制方法的建立。因此，研發(fā)和采用先進(jìn)高效的分離純化技術(shù)，是值得倍加關(guān)注的命題。

二、常見的藥物分離技術(shù)與方法

1.兩相溶劑萃取法

1.1簡(jiǎn)單萃取法[4]

液—液萃取法即兩相溶劑提取法，是利用混合物中各組分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離目的的方法。簡(jiǎn)單的萃取過程是將萃取劑加入到樣品溶液中，使其充分混合，因某些組分在萃取劑中的平衡濃度高于其在原樣品溶液中的濃度，于是這些組分從樣品溶液中向萃取劑中擴(kuò)散，使這些組分與樣品溶液中的其他組分分離。

組分A在兩相間的平衡關(guān)系可以用平衡常數(shù)K表示：

K＝CA／CA'

式中：CA——組分A在萃取劑中的濃度；

CA'——組分A在原樣品溶液中的濃度。

這就是分配定律。在液—液萃取中，K通常為分配系數(shù)，可將其近似地看作組分在萃取劑和原樣品溶液中的溶解度之比。

影響分離效果的主要因素包括：萃取劑、被萃取的物質(zhì)在萃取劑與原樣品溶液兩相之間的平衡關(guān)系(主要表現(xiàn)為被萃取物質(zhì)在萃取劑與原樣品溶液兩相中的溶解度差別)、在萃取過程中兩相之間的接觸情況。在—定的條件下，被萃取物質(zhì)的分離效果，主要決定于萃取劑的選擇和萃取次數(shù)。

1.2逆流連續(xù)萃取法[4]

逆流連續(xù)萃取法是一種連續(xù)的兩相溶劑萃取法。是利用兩相溶劑密度不同，即密度小的溶劑作為分散相，逆流連續(xù)穿過密度大的固定相，使某種成分發(fā)生轉(zhuǎn)溶的原理。對(duì)于乳化嚴(yán)重的液—液萃取，通常用逆流連續(xù)萃取法。萃取過程中可用薄層色譜、紙色譜，以及顯色反應(yīng)或沉淀反應(yīng)檢查萃取是否完全。

1.3逆流分配法[4]

逆流分配法又稱逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法與兩相溶劑逆流萃取法原理一致，是一種在加樣量一定，并不斷在一定量的兩相溶劑中，

經(jīng)多次移位萃取分配而達(dá)到混合物分離的方法。

1.4液滴逆流分配法[4-6]

液滴逆流分配法又稱液滴逆流層析法，是近年來在逆流分配法基礎(chǔ)上改進(jìn)的兩相溶劑萃取法。對(duì)溶劑系統(tǒng)的選擇基本同逆流分配法，但要求能在短時(shí)間內(nèi)分離成兩相，并可生成有效的液滴。由于移動(dòng)相形成液滴，在細(xì)的分配萃取管中與固定相有效地接觸、摩擦不斷形成新的表面，促進(jìn)溶質(zhì)在兩相溶劑中的分配，故其分離效果往往比逆流分配法好，且不會(huì)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，用氮?dú)鈮候?qū)動(dòng)移動(dòng)相，被分離物質(zhì)不會(huì)因遇大氣中氧氣而氧化。本法必須選用能生成液滴的溶劑系統(tǒng)，但對(duì)高分子化合物的分離效果較差，處理樣品量小(1g以下)，并要求有一定的設(shè)備。

2.結(jié)晶法[4]

結(jié)晶法是提純固體化合物的一種重要方法，它適用于產(chǎn)品與雜質(zhì)性質(zhì)差別較大、產(chǎn)品中雜質(zhì)含量小于5％的體系。

固體有機(jī)物在溶劑中的溶解度與溫度有密切關(guān)系。一般是隨溫度升高溶解度增大。若把固體物質(zhì)溶解在熱的溶劑中達(dá)到飽和，冷卻時(shí)由于溶解度降低，溶液變成過飽和溶液而析出結(jié)晶。利用溶劑對(duì)被提純物質(zhì)及雜質(zhì)的溶解度不同，可以使被提純物質(zhì)從過飽和溶液中析出，而讓雜質(zhì)全部或大部分仍留在溶液中(或被過濾除去)，從而達(dá)到提純的目的。進(jìn)行結(jié)晶時(shí)，溶劑的選擇是關(guān)鍵，只有選擇合適的溶劑，才能得到有效的分離。

結(jié)晶法通常包括以下幾個(gè)步驟：(1)制備提純物的飽和液；(2)脫色；(3)熱過濾；(4)冷卻結(jié)晶；(5)抽濾；(6)晶體干燥。干燥晶體可通過測(cè)熔點(diǎn)來確定結(jié)晶的純度。

3.沉淀法[4]

沉淀法是在天然藥物提取液中，加入某些試劑使產(chǎn)生沉淀，通過過濾將成分分離的方法。依據(jù)加入沉淀劑的不同，沉淀法可分為以下幾種。

3.1酸堿沉淀法

酸堿沉淀法根據(jù)酸(堿)成分堿(酸)試劑反應(yīng)成鹽而溶于水，再加酸(堿)試劑反應(yīng)重新生成。游離酸(堿)從溶液中又析出以達(dá)到分離的目的。

3.2醇沉淀法

在濃縮的水提取液中，加入一定量的乙醇(使含乙醇量達(dá)80％以上)，則難溶于乙醇的成分，如淀粉、樹膠黏液質(zhì)、蛋白質(zhì)等從溶液中析出，經(jīng)過濾除去。

3.3鉛鹽沉淀法

鉛鹽沉淀法是分離某些天然藥物成分的經(jīng)典方法之一。該法是利用中性醋酸鉛或堿式醋酸鉛水溶液能與多種天然藥物成分生成難溶的鉛鹽，或配合物沉淀的

原理，利用這種性質(zhì)使有效成分與雜質(zhì)分開。

4.透析法

透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中可通過半透膜，而大分子物質(zhì)不能通過半透膜的性質(zhì)達(dá)到分離的方法。在分離純化蛋白質(zhì)、多肽、多糖、皂苷等相對(duì)分子質(zhì)量較大的成分時(shí)，常采用本法除去無機(jī)鹽、單糖、雙糖等小分子雜質(zhì)。反之，如果雜質(zhì)是大分子的蛋白質(zhì)、淀粉、樹脂等，采用此法將其留在半透膜內(nèi)，而將所要的小分子成分通過半透膜進(jìn)人膜外溶液中，從而加以分離精制[4]。

5.分餾法

分餾法是利用混合物中各成分的沸點(diǎn)不同，在分餾過程中產(chǎn)生不同的蒸汽壓，收集不同溫度的餾分，借以分離液體混合物的一種方法。在天然產(chǎn)物有效成分研究中，揮發(fā)油及一些液體生物堿常用此法分離。分餾法是將多次蒸餾的復(fù)雜操作集中在一支分餾柱中完成。經(jīng)分餾所得各餾分，仍然可能是混合物，須結(jié)合薄層色譜及氣相色譜檢查，再進(jìn)一步純化[4]。

6.色譜法

色譜法是分離純化和定性定量鑒定藥物成分的有效方法之一。色譜技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展，藥物各類成分的分離鑒定起到了巨大的推動(dòng)作用。一些性質(zhì)相近、結(jié)構(gòu)類似的化合物，采用經(jīng)典的溶劑法和結(jié)晶法不能很好分離的，使用色譜法往往可以收到很好的分離效果。

色譜法的基本原理是利用混合物中的各組分在互不相溶的兩“相”溶劑之間的分配系數(shù)(分配色譜)不同、待分離物對(duì)吸附劑吸附能力不同(吸附色譜)、分子的大小差異(凝膠色譜)或其他親和作用的差異進(jìn)行反復(fù)地吸附或分配，從而使混合物中的各組分達(dá)到分離。

色譜法是由固定相(可以是固體或液體)和流動(dòng)相(流動(dòng)的溶液或氣體)兩種不同的相組成。流動(dòng)相為液體的稱為液相色譜，流動(dòng)相為氣體的稱為氣相色譜。根據(jù)各組分在固定相中的作用原理不同，又可分為吸附色譜、分配色譜、排阻色譜、離子交換色譜等。根據(jù)操作條件和載體的不同，又可分為紙色譜、薄層色譜、柱色譜、氣相色譜、高效液相色譜等。

6.1吸附色譜法

吸附色譜法是利用吸附劑對(duì)混合物中的各種組分的吸附能力不同而使各成分達(dá)到分離的方法。此法主要適用于脂溶性、中等相對(duì)分子質(zhì)量成分的分離。一般不適用于相對(duì)分子質(zhì)量高的成分，如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水性化合物的分離。吸附色譜法分離效果如何，完全由吸附劑、溶劑和被分離物質(zhì)的性質(zhì)3種因素決定[7]。

6.2分配色譜法

分配色譜法是利用混合物中的各種成分在互不相溶的兩相溶劑中的分配系數(shù)不同而將混合物中的組分分離的一種色譜方法。把作為固定相的溶劑吸附于某種惰性固體物質(zhì)的表面，這些惰性物質(zhì)主要起支撐這種溶劑的作用，稱為支持劑或載體，而溶劑就是固定相。被分離物質(zhì)置于固定相上端，用流動(dòng)相進(jìn)行洗脫(或展開)。混合物就在固定相和流動(dòng)相之間不斷進(jìn)行分配，不同組分由于在兩相溶劑中分配系數(shù)不同而得以分開[4]。

根據(jù)固定相和流動(dòng)相的不同，分配色譜可分為正相分配色譜和反相分配色譜。以水或親水溶劑為固定相，與水不相溶的有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相的分配色譜稱為正相分配色譜，用于分離水溶性或極性較大的成分。以親脂性有機(jī)溶劑作為固定相，以水或親水性有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相的分配色譜稱為反相分配色譜，用于親脂性物質(zhì)的分離。

6.3高效液相色譜法

在液相色譜中，采用高效固定相，并使用高壓泵輸送流動(dòng)相，全部工作通過儀器來完成對(duì)有機(jī)物的分析，我們稱之為高效液相色譜法。其優(yōu)點(diǎn)主要是：(1)高壓，(2)高選擇性，(3)高靈敏度，(4)高速。高效液相色譜的基本分析方法的分類有:(1)定性分析方法:①色譜鑒別法；②化學(xué)鑒別法；③光譜鑒別法。(2)定量分析方法:①峰高和峰面積；②外標(biāo)法；③內(nèi)標(biāo)法；④內(nèi)加法。(3)藥物雜質(zhì)總量限度測(cè)定法。(4)制備型高效液相色譜法。此方法適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量200~1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。常用于分離同分異構(gòu)體[8]。

高效液相色譜與其他技術(shù)的聯(lián)用是高效液相色譜今后的主要發(fā)展方向。主要是色譜—色譜聯(lián)用、色譜—光譜聯(lián)用、高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用，還有柱切換技術(shù)以及高效液相色譜-傅立葉變換紅外吸收光譜聯(lián)用等。

高效液相色譜法在西藥的分析中應(yīng)用于質(zhì)量控制，尤其表現(xiàn)在微量成分和痕量成分的分析。而在中藥材鑒定和質(zhì)量分析上也越來越重要，它的應(yīng)用將促進(jìn)我國(guó)中藥質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。

6.4氣相色譜法

氣相色譜法是利用氣體（載氣）作流動(dòng)相的一種色譜分離方法。由于其高分離效能，高靈敏度，用量少，速度快等優(yōu)點(diǎn)，氣相色譜常用于瞬間汽化且不分解、沸點(diǎn)小于350℃的穩(wěn)定的有機(jī)化合物的分離和測(cè)定。氣相色譜法被廣泛應(yīng)用于環(huán)境樣品中污染物的分析、藥品質(zhì)量檢測(cè)、天然藥物成分分析、食品中農(nóng)殘分析、工業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量控制等領(lǐng)域[4]。

6.5大孔吸附樹脂法

大孔吸附樹脂技術(shù)目前已比較廣泛地用于天然藥物新藥的開發(fā)和中成藥的生產(chǎn)中，其設(shè)備較簡(jiǎn)單，工藝操作也簡(jiǎn)便，且樹脂可反復(fù)使用，成本低廉。目前，

主要用于分離和提純苷類、生物堿、黃酮類成分及大規(guī)模生產(chǎn)，并在抗生素成分提純等方面也顯示出獨(dú)特的作用。其應(yīng)用原理主要是利用特殊的吸附劑—大孔吸附樹脂的吸附性和分子篩相結(jié)合原理，從天然藥物水提取液中選擇性地吸附其中的有效成分，去除雜質(zhì)。特別是非極性吸附樹脂在吸附藥液中的有效成分時(shí)，主要是物理吸附(如比表面積、孔徑等)在起作用。此方法主要應(yīng)用于中藥復(fù)方有效部位的提取和天然藥物有效成分的提取。

6.6凝膠色譜法

凝膠色譜也稱凝膠滲透色譜，分子篩過濾，是利用分子篩原理來分離物質(zhì)的方法。凝膠是一種球形顆粒，具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，不溶于水，但可在水中膨脹的高分子化合物。當(dāng)凝膠用水膨脹裝柱后，加入樣品，用同一溶劑洗脫時(shí)，由于各種化合物的相對(duì)分子質(zhì)量不同，受凝膠網(wǎng)孔半徑限制也不同，大分子不能滲入凝膠顆粒內(nèi)部，隨溶劑在顆粒間移動(dòng)先被洗脫；小分子因可自由滲入并擴(kuò)散到凝膠顆粒內(nèi)部中，受到的阻力增大，流速減慢，故后被洗脫。這樣混合物就按相對(duì)分子質(zhì)量由大到小流出順序不同而得到分離。該技術(shù)已發(fā)展成為天然產(chǎn)物化學(xué)和生物化學(xué)研究中的常規(guī)分離方法[5,6,9]。

6.7聚酰胺色譜法

利用聚酰胺對(duì)混合物中各成分進(jìn)行分析的方法稱聚酰胺色譜法。自20世紀(jì)50年代中期發(fā)現(xiàn)聚酰胺可以分離酸性物質(zhì)以來，目前已發(fā)展成為分離極性和非極性物質(zhì)如黃酮類、酚類、酮類、有機(jī)酸、氨基酸、生物堿、甾體等用途廣泛的色譜方法。對(duì)黃酮類、酚類、酮類等化合物的分離，遠(yuǎn)比用其他方法優(yōu)越[4]。

聚酰胺分離黃酮類、酚類、酮類等化合物的原理，是通過聚酰胺分子中酰胺基與上述化合物分子上的酚羥基、羰基或醌基形成氫鍵締合而產(chǎn)生吸附作用進(jìn)行分離的。吸附強(qiáng)度主要與溶劑種類、化合物分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。

6.8離子交換色譜法[7,9]

有些藥物成分分子中具有酸性、堿性及兩性基因，在水中多呈解離狀，因此可根據(jù)解離度不同采用離子交換樹脂進(jìn)行色譜分離。這種以離子交換樹脂代替吸附劑進(jìn)行色譜分離的方法就稱為離子交換色譜法。離子交換樹脂本身具有解離的陽離子或陰離子，可與水溶液中相同電荷的離子發(fā)生交換作用，而被吸附到柱上，再用適當(dāng)流動(dòng)相洗脫，即可分離混合物中離子型的化合物。

根據(jù)離子交換樹脂中交換離子的性質(zhì)不同，離子交換樹脂分兩大類：

(1)陽離子(酸性)交換樹脂：含有活潑的酸性基團(tuán)，能交換陽離子?？煞譃閺?qiáng)酸型、弱酸型和中等酸型。

(2)陰離子(堿性)交換樹脂：含有活潑的堿性基團(tuán)，能交換陰離子。可以分為強(qiáng)堿型、弱堿型和中等堿型。

6.9高速逆流色譜法

高速逆流色譜法是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種連續(xù)高效的液—液分配色譜分離技術(shù)，它不用任何固態(tài)的支撐物或載體，利用兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動(dòng)力學(xué)平衡，當(dāng)其中一相作為固定相，另一相作為流動(dòng)相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相。相對(duì)于傳統(tǒng)的固—液柱色譜技術(shù)，此法具有適用范圍廣、操作靈活、高效、快速、制備量大、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。目前此技術(shù)正在發(fā)展成為一種備受關(guān)注的新型分離純化技術(shù)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、天然產(chǎn)物、食品和化妝品等領(lǐng)域，特別在天然產(chǎn)物行業(yè)中已被認(rèn)為是一種有效的新型分離技術(shù)，適合于中小分子類物質(zhì)的分離純化[5,6,10]。7.超臨界流體萃取技術(shù)

超臨界流體萃取(SFE)技術(shù)是20世紀(jì)興起的一種新型分離技術(shù)，由于其選擇性高、分離效果好、提取率高、產(chǎn)物沒有有機(jī)溶劑殘留、有利于熱敏性物質(zhì)和易氧化物質(zhì)的萃取等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)外已廣泛用于香料、食品、石油、化工等領(lǐng)域。SFE技術(shù)自20世紀(jì)80年代中期以來逐漸被應(yīng)用于藥物有效成分的提取分離，并與氣相色譜法、高效液相色譜法聯(lián)用形成有效的分離技術(shù)。

超臨界流體萃取的基本原理是：通過控制溫度或壓力，引起超臨界流體獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)的顯著變化，從而引起待萃取物質(zhì)的溶解度發(fā)生變化達(dá)到萃取的目的。然后經(jīng)過減壓、升溫或吸附的方法使超臨界流體變成普通的氣體，讓被萃取的物質(zhì)分離析出，以達(dá)到分離提純的目的。二氧化碳、乙烷、乙烯、甲醇、乙醇和水等多種物質(zhì)均可用作超臨界流體的溶劑，二氧化碳因其無毒、無臭、無味、不燃燒、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不易與被分離成分反應(yīng)，臨界點(diǎn)低(Tc＝3l.26℃，Pc＝7.2MPa)、容易達(dá)到臨界條件，純度高、價(jià)廉、易得、易與溶質(zhì)分離和使用安全等優(yōu)點(diǎn)，是目前最常用、研究較多的超臨界萃取中一種較理想、較普遍使用的溶劑[4,6]。

8.毛細(xì)管電泳技術(shù)

毛細(xì)管電泳是一類以高壓電場(chǎng)（E，可達(dá)30kV）為驅(qū)動(dòng)力，以小內(nèi)徑的石英毛細(xì)管（常用20～70μm，有效長(zhǎng)度50～75cm）為分離通道，依據(jù)各組分之間電泳遷移率或分配系數(shù)的差異而實(shí)現(xiàn)分離的新型液相分離分析技術(shù)，它迅速發(fā)展于20世紀(jì)80年代中后期。毛細(xì)管電泳實(shí)際上包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，它兼有高壓電泳的高速、高分辨率及高效液相色譜的高效率等優(yōu)點(diǎn)，是分析科學(xué)中繼高效液相色譜之后的又一重大進(jìn)展，它使分析科學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析乃至單分子分析成為可能。長(zhǎng)期困擾我們的生物大分子如蛋白質(zhì)的分離分析也因此有了新的轉(zhuǎn)機(jī)。目前，國(guó)際上毛細(xì)管的研究側(cè)重于應(yīng)用，研究的內(nèi)容是多方面的，其中最富特色者有蛋白質(zhì)分離、糖分析、DNA測(cè)序、手性分離、單細(xì)胞分析等。在藥物分離中，此方法也廣泛用于中藥材各類有效成

分分析和中藥復(fù)方制劑分析，如生物堿、黃酮、苷類、酚類、有機(jī)酸、蒽醌類及多糖等成分[6]。

毛細(xì)管電泳技術(shù)作為一種新的分離手段已應(yīng)用到藥物制劑及原料分析的各個(gè)方面，且分離效率高、速度快、操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低，在中藥及其復(fù)方制劑中有著廣泛的應(yīng)用前景。它的高效，使中藥多種成分分析成為可能，它的快速提高了分離效率。此外，毛細(xì)管電泳技術(shù)與其它技術(shù)聯(lián)用，可達(dá)到快速完成眾多復(fù)雜成分的分離和結(jié)構(gòu)測(cè)定的目的。

9.膜分離技術(shù)

膜分離是一種新型分離技術(shù)，它利用經(jīng)特殊制造的具有選擇透過性的薄膜，在外力(如膜兩側(cè)的壓力差、濃度差、電位差等)推動(dòng)下對(duì)混合物進(jìn)行分離、分級(jí)、提純和濃縮等操作，以獲取需要的產(chǎn)品。膜分離應(yīng)用廣泛，既可用于液體混合物的分離，也可用于氣體混合物的分離。目前，膜分離技術(shù)不僅在電子工業(yè)、食品工業(yè)、環(huán)境保護(hù)和生物工程等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，而且正在逐步成為醫(yī)藥工業(yè)的分離純化工藝、液體制劑除菌和除微粒工藝的基本操作單元。膜分離技術(shù)在中藥領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛，主要用于中藥注射劑和口服液的澄清除雜、除菌和除熱原，此外在中藥有效成分分離純化、中藥固體制劑生產(chǎn)、中藥藥液濃縮和中藥膜控制釋放制劑方面的應(yīng)用也日益增多。膜分離技術(shù)作為一種新型高效分離技術(shù)，與傳統(tǒng)分離方法相比，具有工藝簡(jiǎn)單、節(jié)能、成本低等優(yōu)點(diǎn)[11,12]。

10.微波與超聲波提取分離技術(shù)[13]

微波提取法是一種近年新興的提取方法，其提取原理是利