革蘭氏陰性菌檢測

選擇培養(yǎng)基(selectivemedium)選擇培養(yǎng)基是用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基。根據(jù)不同種類微生物的特殊營養(yǎng)需求或?qū)δ撤N化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生物的生長，有利于所需微生物的生長。一種類型選擇培養(yǎng)基是依據(jù)某些微生物的特殊營養(yǎng)需求設(shè)計(jì)的，例如，利用以纖維素或石蠟油作為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，可以從混雜的微生物群體中分離出能分解纖維素或石蠟油的微生物；利用以蛋白質(zhì)作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以分離產(chǎn)胞外蛋白酶的微生物;缺乏氮源的選擇培養(yǎng)基可用來分離固氮微生物。另一類選擇培養(yǎng)基是在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，這種化學(xué)物質(zhì)沒有營養(yǎng)作用，對所需分離的微生物無害，但可以抑制或殺死其他微生物，例如，在培養(yǎng)基中加入數(shù)滴10%酚可以抑制細(xì)菌和霉菌的生長，從而由混雜的微生物群體中分離出放線菌；在培養(yǎng)基中加入亞硫酸銨，可以抑制革蘭氏陽性細(xì)菌和絕大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌的生長，而革蘭氏陰性的傷寒沙門氏菌(Salmomnellatyphi)可以在這種培養(yǎng)基上生長；在培養(yǎng)基中加入染料亮綠(brilliantgreen)或結(jié)晶紫(crystalvio1et)，可以抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長，從而達(dá)到分離革蘭氏陰性細(xì)菌的目的；在培養(yǎng)基中加人青霉素、四環(huán)素或鏈霉素，可以抑制細(xì)菌和放線菌生長，而將酵母菌和霉菌分離出來?，F(xiàn)代基因克隆技術(shù)中也常用選擇培養(yǎng)基，在篩選含有重組質(zhì)粒的基因工程菌株過程中，利用質(zhì)粒上具有的對某種(些)抗生素的抗性選.擇標(biāo)記，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)抗生素，就能比較方便地淘汰非重組菌株，以減少篩選目標(biāo)菌株的工作量。糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法及注解GB7918.3-87化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法糞大腸菌群及注解中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法糞大腸菌群UDC668：576.85.07(GB7918.3-87)StandardmethodsofmicrobiologicalexaminationforcosmeticsFecalcoliforms糞大腸菌群細(xì)菌來源于人和溫血動物的糞便。檢出糞大腸菌群表明該化妝品已被糞便污染，有可能存在其他腸道致病菌或寄生蟲等病原體的危險(xiǎn)。因此糞大腸菌被列為重要的衛(wèi)生指標(biāo)菌。1方法提要根據(jù)糞大腸菌群所具有的生物特性，如革蘭氏陰性無芽胞桿菌在44°C培養(yǎng)24?48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，能在選擇性培養(yǎng)基上產(chǎn)生典型菌落，能分解色氨酸產(chǎn)生靛基質(zhì)。2培養(yǎng)基和試劑2.1乳糖膽鹽培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g豬膽鹽5g乳糖5g0.4%漠甲酚紫水溶液2.5ml蒸餾水1000ml制法：將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于蒸餾水中，調(diào)pH到7.4,加入指示劑，混勻，分裝試管(每支試管中加一個小例管)。115°C(101b)20min滅菌。2.2雙倍濃度乳糖膽鹽培養(yǎng)基按上述乳糖膽鹽培養(yǎng)基成分，蒸餾水量不變，其他成分量加倍。2.3伊紅美藍(lán)(EMB)瓊脂成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g2%伊紅水溶液20ml0.5%美藍(lán)水溶液13ml蒸餾水1000ml制法：先將瓊脂加到900ml蒸餾水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補(bǔ)足至1000ml。校正pH值為7.2?7.4，分裝于燒瓶內(nèi)，121C(151b)15min高壓滅菌備用。臨用時加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60C左右以無菌手續(xù)加入滅菌的伊紅美藍(lán)溶液，搖勻。傾注平皿備用。2.4蛋白胨水(作靛基質(zhì)試驗(yàn)用)成分：蛋白胨(或胰蛋白胨)20g氯化鈉5g蒸餾水1000ml制法:將上述成分加熱熔化，調(diào)pH值為7.0?7.2,分裝小試管，高壓滅菌121°C(151b)15min。2.5靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75ml戊醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25ml。試驗(yàn)方法：接種細(xì)菌于蛋白豚水中，于44C培養(yǎng)24h。沿管壁加柯凡克試劑0.3?0.5ml,輕搖試管。陽性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注：蛋白豚應(yīng)含有豐富的色氨酸，每批蛋白豚買來后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。2.6革蘭氏染色法2.6.1染液制備結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫1g95%酒精20ml1%草酸銨水溶液80ml將結(jié)晶紫溶于灑精中，然后與草酸銨溶液混合。脫色液：95%乙醇。復(fù)染液：a.沙黃復(fù)染液：沙黃0.25g95%酒精10ml蒸餾水90ml將沙黃溶解于酒精中，然后用蒸餾水稀釋。b.稀石碳酸復(fù)紅液：稱取堿性復(fù)紅10g，研細(xì)，加95%乙醇100ml，放置過夜，濾紙過濾。取該液10ml，加5%石碳酸水溶液90ml混合，即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液10ml加水90ml即為稀石碳酸復(fù)紅液。2.6.2染色法將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。滴加95%酒精脫色，約30s，或?qū)⒕凭螡M整個涂片，立即傾去，再用酒精滴滿整個涂片，脫色10s，水洗。滴加復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗，待干，鏡檢。2.6.3染色結(jié)果革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用1：10稀釋石碳復(fù)紅染色液作復(fù)染液，復(fù)染時間僅需10s。3儀器3.1恒溫水浴或隔水式恒溫箱：44°C。3.2溫度計(jì)。3.3顯微鏡。3.4載玻片。3.5接種環(huán)。3.6電爐。3.7錐形瓶。3.8試管。3.9小倒管。3.10pH計(jì)或pH試紙。3.11高壓消毒鍋。3.13滅菌平皿。4操作步驟4.1取10ml1：10稀釋的樣品，加到10ml雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中，置44°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?48h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報(bào)告為糞大腸菌群陰性。4.2如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置37C培養(yǎng)18?24h。同時取該培養(yǎng)液1?2滴接種到蛋白胨水中，置44C培養(yǎng)24h。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長。大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落。亦常為大腸菌群，均應(yīng)注意挑選。4.3挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。4.4在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5ml，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。5檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告平板上有典型菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性，則可報(bào)告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。附加說明：本標(biāo)準(zhǔn)由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由“化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法”起草小組起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人周淑玉。本標(biāo)準(zhǔn)由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所負(fù)責(zé)解釋注解：（1） 用糞大腸菌群作為化妝品受糞便污染的指示菌是比較合適的。考慮到總大腸菌群中的細(xì)菌除生活在腸道中外，在自然環(huán)境（水與土壤）中亦經(jīng)常存在。在糞大腸菌群這一組群細(xì)菌中大腸埃希氏菌（E.coli）數(shù)量最多，是較理想的指示菌，但欲正確鑒定此細(xì)菌，手續(xù)較繁復(fù)，因此在化妝品檢驗(yàn)中采用糞大腸菌群作為指示菌。（2） 本方法采用乳糖膽鹽培養(yǎng)基，是具有選擇性作用的培養(yǎng)基。其中膽鹽具有抑制革蘭氏陽性菌的作用。膽鹽的品種來源及用量不同，其抑菌效果也不同。目前國內(nèi)常見的膽鹽有國產(chǎn)的生檢7號和3號膽鹽，進(jìn)口的Difco和Oxoid,No.3膽鹽，以及牛膽鹽、羊膽鹽、豬膽鹽，免膽鹽和家禽膽鹽等。有時因某種膽鹽不易購得，需用其他膽鹽代替時，應(yīng)重新測定抑菌的有效劑量，這些情況給使用者帶來不便。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察，豬、牛、羊三種膽鹽對大腸菌群的檢驗(yàn)效果無明顯、差異，可互相替代；而其他膽鹽的檢驗(yàn)效果則不一致。不宜相互代替。在膽鹽用量上，實(shí)驗(yàn)表明1%、0.5%和0.25%三個劑量間無何差異，所以本方法采用的膽鹽劑量（0.5%）是適宜的，在稱量時稍有誤差，亦不致影響大腸菌群的檢出。（3） 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)使用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，細(xì)菌分解糖類是依靠細(xì)菌細(xì)胞所產(chǎn)生的各種酶類的作用，細(xì)菌產(chǎn)生的分解糖的酶隨細(xì)菌種類不同而異，可以此鑒別細(xì)菌。大腸桿菌能分解乳糖而產(chǎn)生酸，使培養(yǎng)基的pH降低（指示劑變色）。這一現(xiàn)象可作為觀察結(jié)果的指標(biāo)。大腸桿菌細(xì)胞在酸性環(huán)境中，由于甲酸脫氫酶的作用，可使甲酸分解成C02和H2,在培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量氣體而進(jìn)入倒管中，以觀察產(chǎn)氣。在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)有極微量的氣泡，類似這樣的情況能否算產(chǎn)氣陰性？一般來說產(chǎn)氣量與大腸菌群檢出率呈正相關(guān)，但產(chǎn)氣量小不一定大腸菌群都是陰性，因此應(yīng)慎重處理。對這種產(chǎn)氣量小或倒管內(nèi)雖無氣泡，糊液面及管壁可看到緩緩上浮的小氣泡的情況時，均應(yīng)作進(jìn)一步觀察與鑒別。（4） 伊紅美蘭瓊脂分離大腸菌群細(xì)菌大腸菌群細(xì)菌發(fā)酵乳糟產(chǎn)酸，使伊紅與美蘭結(jié)合成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，有時還可產(chǎn)生金屬光澤。不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌（如沙門氏菌、志賀氏菌）則為無色菌落。糞大腸菌群菌落在伊紅美蘭瓊脂上呈黑紫色有光澤或無光澤的檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。菌落形態(tài)的其他方面（如菌落大小、光滑與粗糙、邊緣完整情況、隆起情況、濕潤與干燥等）雖亦應(yīng)注意，但不如色澤更為重要。影響糞大腸菌群檢出率的因素很多。如化妝品種類，茵落色澤和形態(tài)，細(xì)菌種類等，如只挑一個菌落，由于機(jī)率問題，很難避免假陰性出現(xiàn)，尤其當(dāng)菌落呈不典型時：因此挑選菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應(yīng)多挑幾個，以免出現(xiàn)假陰性。表1糞大腸菌群在幾種常用分離培養(yǎng)上的菌落特征培養(yǎng)基菌落特征伊紅美國微軟公司蘭培養(yǎng)基（EMB）紫黑色、有金屬光澤，紫黑色、不帶或略帶光澤，淡紫紅色、中心紫黑色、黑紅或深紫紅色口紅亞硫酸納（遠(yuǎn)藤氏平板）紫紅色、有金屬光澤，深紅色、不帶或略帶金屬光澤，淡紅色、中心較深中國蘭平板深藍(lán)色，淺藍(lán)色、中心深藍(lán)色麥康凱平板（MacC）桃紅色，粉紅色、中心桃紅色中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)