發(fā)酵工程原理與技術(shù)江南大學(xué)陳堅(jiān)

第七章生產(chǎn)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)與保藏目前工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵罐容積已達(dá)成幾十立方米或幾百立方米。如按百分之十左右的種子量計(jì)算，就要投入幾立方米或幾十立方米的種子。要從保藏在試管中的微生物菌種逐級(jí)擴(kuò)大為生產(chǎn)用種子是一個(gè)由實(shí)驗(yàn)室制備到車間生產(chǎn)的過程。其生產(chǎn)方法與條件隨不同的生產(chǎn)品種和菌種種類而異。如細(xì)菌、酵母菌、放線菌或霉菌生長(zhǎng)的快慢；產(chǎn)孢子能力的大?。患皩?duì)營(yíng)養(yǎng)、溫度、需氧等條件的規(guī)定均有所不同。因此，種子擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)根據(jù)菌種的生理特性，選擇合適的培養(yǎng)條件來獲得代謝旺盛、數(shù)量足夠的種子。這種種子接入發(fā)酵罐后，將使發(fā)酵生產(chǎn)周期縮短，設(shè)備運(yùn)用率提高。種子液質(zhì)量的優(yōu)劣對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)起著關(guān)鍵性的作用。種子擴(kuò)大培養(yǎng)：是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處在休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，在通過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)放大培養(yǎng)而獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中的種子的必須滿足以下條件：（1）菌種細(xì)胞的生長(zhǎng)活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長(zhǎng)，遲緩期短；（2）生理形狀穩(wěn)定；（3）菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的規(guī)定；（4）無雜菌污染；（5）保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。第一節(jié)種子的制備過程在發(fā)酵生產(chǎn)過程中，種子制備的過程大體可分為兩個(gè)階段：（1）實(shí)驗(yàn)室種子制備階段（2）生產(chǎn)車間種子制備階段一、實(shí)驗(yàn)室種子的制備實(shí)驗(yàn)室種子的制備一般采用兩種方式：對(duì)于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡(jiǎn)便，不易污染雜菌。對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。（一）孢子的制備1，細(xì)菌孢子的制備細(xì)菌的斜面培養(yǎng)基多采用碳源限量而氮源豐富的配方。培養(yǎng)溫度一般為37℃。細(xì)菌菌體培養(yǎng)時(shí)間一般為1~2天，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌培養(yǎng)則需要5~10天。2，霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養(yǎng)一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。培養(yǎng)的溫度一般為25~28℃。培養(yǎng)時(shí)間一般為4~14天。3，放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養(yǎng)一般采用瓊脂斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中具有一些適合產(chǎn)孢子的營(yíng)養(yǎng)成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些無機(jī)鹽等。培養(yǎng)溫度一般為28℃。培養(yǎng)時(shí)間為5~14天。（二）液體種子制備1，好氧培養(yǎng)對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，如產(chǎn)鏈霉素的灰色鏈霉菌（S.griseus）、產(chǎn)卡那霉素的卡那鏈霉菌（S.Kanamuceticus）可以用搖瓶液體培養(yǎng)法。將孢子接入含液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于搖瓶機(jī)上恒溫振蕩培養(yǎng)，獲得菌絲體，作為種子。其過程如下：試管→三角瓶→搖床→種子罐2，厭氧培養(yǎng)對(duì)于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其種子的制備過程如下：試管→三角瓶→卡式罐→種子罐例如生產(chǎn)啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂或MYPG培養(yǎng)基（培養(yǎng)基配制：3克麥芽浸出物，3克酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克瓊脂與升水中）的斜面上，于4℃冰箱內(nèi)保藏。每年移種3-4次。將保存的酵母菌種接入含10ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培養(yǎng)2-3天后，再擴(kuò)大至具有250-500ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培養(yǎng)2天后，移種至具有5-10L麥芽汁的卡氏培養(yǎng)罐中，于15-20℃培養(yǎng)3-5天即可作100L麥芽汁的發(fā)酵罐種子。從三角瓶到卡氏培養(yǎng)罐培養(yǎng)期間，均需定期搖動(dòng)或通氣，使酵母菌液與空氣接觸，以有利與酵母菌的增殖。二、生產(chǎn)車間種子制備實(shí)驗(yàn)室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，種子罐的培養(yǎng)基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌運(yùn)用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，假如是需氧菌，同時(shí)還需供應(yīng)足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。1，種子罐的作用：重要是使孢子發(fā)芽，生長(zhǎng)繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長(zhǎng)，達(dá)成一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。2，種子罐級(jí)數(shù)的擬定種子罐級(jí)數(shù)：是指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于：（1）菌種生長(zhǎng)特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度；（2）所采用發(fā)酵罐的容積。比如：細(xì)菌：生長(zhǎng)快，種子用量比例少，級(jí)數(shù)也較少，二級(jí)發(fā)酵。茄子瓶→種子罐→發(fā)酵罐霉菌：生長(zhǎng)較慢，如青霉菌，三級(jí)發(fā)酵孢子懸浮液→一級(jí)種子罐（27℃,40小時(shí)孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲）→二級(jí)種子罐（27℃，10~24小時(shí)，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發(fā)酵罐放線菌：生長(zhǎng)更慢，采用四級(jí)發(fā)酵酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級(jí)種子3，擬定種子罐級(jí)數(shù)需注意的問題（1）種子級(jí)數(shù)越少越好，可簡(jiǎn)化工藝和控制，減少染菌機(jī)會(huì)（2）種子級(jí)數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，減少發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增長(zhǎng)染菌機(jī)會(huì)（3）雖然種子罐級(jí)數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級(jí)數(shù)。第二節(jié)種子質(zhì)量的控制一、影響孢子質(zhì)量的因素及控制影響孢子質(zhì)量的因素通常有：培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間等。1，培養(yǎng)基生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)種子質(zhì)量不穩(wěn)定的現(xiàn)象，其重要因素是原材料質(zhì)量波動(dòng)。例如在四環(huán)素、土霉素生產(chǎn)中，配制產(chǎn)孢子斜面培養(yǎng)基用的麩皮，因小麥產(chǎn)地、品種、加工方法及用量的不同對(duì)孢子質(zhì)量的影響也不同。蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對(duì)孢子影響也不同。原材料質(zhì)量的波動(dòng)，起它要作用的是其中無機(jī)離子含量不同，如微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會(huì)影響孢子的質(zhì)量。水質(zhì)的影響：地區(qū)不同、季節(jié)變化和水源污染，均可導(dǎo)致水質(zhì)波動(dòng)，影響種子質(zhì)量。菌種在固體培養(yǎng)基上可呈現(xiàn)多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現(xiàn)的菌落類型也越多，不利于生產(chǎn)的穩(wěn)定。解決措施：（1）培養(yǎng)基所用原料要通過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)合格才可使用；（2）嚴(yán)格控制滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量；（3）斜面培養(yǎng)基使用前，需在適當(dāng)溫度下放置一定期間；（4）供生產(chǎn)用的孢子培養(yǎng)基要用比較單一的氮源，作為選種或分離用的培養(yǎng)基則采用較復(fù)雜的有機(jī)氮源。2，培養(yǎng)條件（1）溫度溫度對(duì)多數(shù)品種斜面孢子質(zhì)量有顯著的影響。如土霉素生產(chǎn)菌種在高于37℃培養(yǎng)時(shí)，孢子接入發(fā)酵罐后出現(xiàn)糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價(jià)減少等現(xiàn)象。一般各生產(chǎn)單位都嚴(yán)格控制孢子子斜面的培養(yǎng)溫度。（2）濕度制備斜面孢子培養(yǎng)基的濕度對(duì)孢子的數(shù)量和質(zhì)量有較大的影響。例如土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌，孢子制備時(shí)發(fā)現(xiàn)：在北方氣候干燥地區(qū)孢子斜面長(zhǎng)得較快，在具有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長(zhǎng)得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含濕度大的地區(qū)，斜面孢子長(zhǎng)得慢，重要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。從表中看出相對(duì)濕度在40%~45%時(shí)孢子數(shù)量最多，且孢子顏色均勻，質(zhì)量較好。表7-1不同相對(duì)濕度對(duì)龜裂鏈霉菌斜面生長(zhǎng)的影響相對(duì)濕度（%）斜面外觀活孢子計(jì)數(shù)（億/支）16.5~1925~3640~45上部稀薄、下部稠略黃上部薄、中部均勻發(fā)白一片白，孢子豐富，稍皺1.22.35.73，培養(yǎng)時(shí)間和冷藏時(shí)間（1）培養(yǎng)時(shí)間一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，由于衰老的孢子已在逐步進(jìn)入發(fā)芽階段，核物質(zhì)趨于分化狀態(tài)。過于衰老的孢子會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)能力的下降。解決措施：孢子培養(yǎng)的時(shí)間應(yīng)當(dāng)控制在孢子量多、孢子成熟、發(fā)酵產(chǎn)量正常的階段終止培養(yǎng)。（2）冷藏時(shí)間斜面冷藏對(duì)孢子質(zhì)量的影響與孢子成熟限度有關(guān)。如土霉素生產(chǎn)菌種孢子斜面培養(yǎng)4天左右即于4℃冰箱保存，發(fā)現(xiàn)冷藏7~8天菌體細(xì)胞開始自溶。而培養(yǎng)5天以后冷藏，20天未發(fā)現(xiàn)自溶。冷藏時(shí)間對(duì)孢子的生產(chǎn)能力也有影響。例如在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在6℃冷藏兩個(gè)月后的發(fā)酵單位比冷藏一個(gè)月減少18%，冷藏3個(gè)月后減少35%。4，接種量接種量大小影響到培養(yǎng)基中孢子的數(shù)量，進(jìn)而影響菌體的生理狀況。二、影響種子質(zhì)量的因素及控制生產(chǎn)過程中影響種子質(zhì)量的因素通常有：孢子的質(zhì)量、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、種齡、接種量。1，培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基要滿足以下規(guī)定：（1）營(yíng)養(yǎng)成分適合種子培養(yǎng)的需要（2）選擇有助于孢子發(fā)芽和菌體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基；（3）營(yíng)養(yǎng)上要易于被菌體直接吸取和運(yùn)用；（4）營(yíng)養(yǎng)成分要適當(dāng)豐富和完全，氮源和維生素含量要高（5）營(yíng)養(yǎng)成分要盡也許與發(fā)酵培養(yǎng)基相近。2，培養(yǎng)條件（1）溫度（2）通氣量在種子罐中培養(yǎng)的種子除保證供應(yīng)易被運(yùn)用的培養(yǎng)基外，有足夠的通氣量可以提高種子質(zhì)量。例如，青霉素的生產(chǎn)菌種在制備過程中將通氣充足和局限性兩種情況下得到的種子分別接入發(fā)酵罐內(nèi)，它們的發(fā)酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產(chǎn)菌，一級(jí)種子罐的通氣量小對(duì)發(fā)酵有利。3，種齡種齡：是指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級(jí)種子罐或發(fā)酵罐時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間。通常種齡是以處在生命力極旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體量尚未達(dá)成最大值時(shí)的培養(yǎng)時(shí)間較為合適。時(shí)間太長(zhǎng)，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；種齡太短，導(dǎo)致發(fā)酵前期生長(zhǎng)緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不同樣的，一般需通過多種實(shí)驗(yàn)來擬定。如嗜堿性芽孢桿菌生產(chǎn)堿性蛋白酶，12小時(shí)最佳（見下圖）。4，接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。接種量的大小決定于生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中生長(zhǎng)繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖達(dá)成高峰的時(shí)間，使產(chǎn)物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長(zhǎng)機(jī)會(huì)。但接種量過大或者過小，均會(huì)影響發(fā)酵。過大會(huì)引起溶氧局限性，影響產(chǎn)物合成；并且會(huì)過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過小會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，減少發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。通常接種量，細(xì)菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有時(shí)20~25%三、種子質(zhì)量的控制措施種子質(zhì)量的最終指標(biāo)是考察其在發(fā)酵罐中所表現(xiàn)出來的生產(chǎn)能力。因此一方面必須保證生產(chǎn)菌種的穩(wěn)定性，另一方面是提供種子培養(yǎng)的適宜環(huán)境保證無雜菌侵入，以獲得優(yōu)良種子。因此在生產(chǎn)過程中通常進(jìn)行以下兩項(xiàng)檢查。（1）菌種穩(wěn)定性的檢查（2）無（雜菌）檢查四、種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1，細(xì)胞或菌體菌絲形態(tài)、菌絲濃度和培養(yǎng)液外觀（色素、顆粒等）單細(xì)胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還規(guī)定有一定的排列或形態(tài)；霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對(duì)某些染料著色力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛、菌絲分枝情況和內(nèi)含物情況好。2，生化指標(biāo)種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。3，產(chǎn)物生成量在抗生素發(fā)酵中，產(chǎn)物生成量是考察種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，由于種子液中產(chǎn)物生成量的多少間接反映種子的生產(chǎn)能力和成熟限度。4，酶活力種子液中某種酶的活力，與目的產(chǎn)物的產(chǎn)量有一定的關(guān)聯(lián)。五、種子異常分析菌種生長(zhǎng)速度，過快或過慢菌絲結(jié)團(tuán)菌絲粘壁第三節(jié)實(shí)例一、谷氨酸發(fā)酵的菌種擴(kuò)大培養(yǎng)斜面菌種→一級(jí)種子培養(yǎng)→二級(jí)種子培養(yǎng)→發(fā)酵罐1，斜面菌種的培養(yǎng)菌種的斜面培養(yǎng)必須有助于菌種生長(zhǎng)而不產(chǎn)酸，并規(guī)定斜面菌種絕對(duì)純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有助于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多具有機(jī)氮而不含或少含糖為原則。(1)斜面培養(yǎng)基組成葡萄糖0.1%，蛋白陳1.0%，牛肉膏1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂2.0~2.5%，pH7.0~7.2（傳代和保藏斜面不加葡萄糖）。(2)培養(yǎng)條件33~34℃，培養(yǎng)18~24h。2，一級(jí)種子培養(yǎng)一級(jí)種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強(qiáng)的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分，多具有機(jī)氮為主，培養(yǎng)條件從有助于長(zhǎng)菌考慮。(1)培養(yǎng)基組成葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸鎂0.04%，磷酸氫二鉀0.1%，玉米漿2.5~3.5%(按質(zhì)增減)，硫酸亞鐵、硫酸錳各2ppm，pH7.0。(2)培養(yǎng)條件用1000mL三角瓶裝入培養(yǎng)基200mI，滅菌后置于沖程7.6cm、頻率96次/min的往復(fù)式搖床上振蕩培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度33~34℃。(3)一級(jí)種子質(zhì)量規(guī)定種齡：12h，pH值：6.4±0.1光密度：凈增OD值0.5以上殘?zhí)牵?.5％以下無菌檢查：(-)噬菌體檢查：(-)鏡檢：菌體生長(zhǎng)均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽性反映。3，二級(jí)種子培養(yǎng)為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級(jí)種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)而擴(kuò)大到種子罐的二級(jí)種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。(1)培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成（%）T6-13B9T738AS1.299水解糖玉米漿磷酸氫二鉀硫酸鎂尿素Fe++（ppm）Mn++（ppm）pH2.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.20.050.5227.02.52.50.10.040.5226.5-6.8(2)培養(yǎng)條件接種量：0.8~1.0％培養(yǎng)溫度：32~34℃培養(yǎng)時(shí)間：7~8h通風(fēng)量：50L種子罐1:0.5攪拌轉(zhuǎn)速340r／min；250L種子罐1:0.3攪拌轉(zhuǎn)速300r／min500L種子罐1:0.25攪拌轉(zhuǎn)速230r／min(3)二級(jí)種子的質(zhì)量規(guī)定種齡：7~8hpH：7.2左右OD值凈增0.5左右無菌檢查(-)噬菌體檢查(-)二、啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)一般可采用三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大倍數(shù)：第1級(jí)到第2級(jí)為8-10倍，第2級(jí)到第3級(jí)為4-6倍。1，實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大培養(yǎng)2，車間擴(kuò)大培養(yǎng)第三節(jié)生產(chǎn)發(fā)酵罐的無菌接種生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐的接種，涉及兩個(gè)方面：從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或孢子懸浮液容器中移種入一個(gè)種子罐；從一個(gè)種子罐移入另一個(gè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中。（1）從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或孢子懸浮液容器接種通常有兩種方式2，從種子罐接種第四節(jié)菌種的保藏與復(fù)壯一、菌種的保藏1、菌種保藏的意義菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是運(yùn)用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)一方面是使菌種不致死亡，同時(shí)還要盡也許設(shè)法把菌種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。2、菌種保藏的原理菌種保藏重要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)人工發(fā)明條件使孢子或菌體的生長(zhǎng)代謝活動(dòng)盡量減少，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處在“體眠”狀態(tài)，克制其繁殖能力。一種好的保藏方法一方面應(yīng)能長(zhǎng)期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時(shí)還需考慮到方法自身的簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)，以便生產(chǎn)上能推廣使用。3、菌種保藏的方法（1）斜面低溫保藏法將菌株接種于合適斜面培養(yǎng)基上，待生長(zhǎng)好后置于4冰箱保藏，每隔一定期間進(jìn)行移接培養(yǎng)后再將新斜面繼續(xù)保藏。這種保藏方法簡(jiǎn)樸，存活率高，易于推廣，經(jīng)常使用的菌種可采用這種方法。其缺陷是菌種仍有一定強(qiáng)度的代謝活動(dòng)條件，保存時(shí)間不長(zhǎng)，并且傳代多，因此菌種客易產(chǎn)生變異。（2）石蠟油封保藏法將生長(zhǎng)好的新鮮斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層要高出斜面上端1cm，使之與空氣隔絕，然后垂直放于室溫或冰箱內(nèi)保藏即可。這種方法也比較簡(jiǎn)便，且保藏時(shí)間一般可長(zhǎng)達(dá)l年以上。適于保存部分霉菌、酵母菌、放線菌，但對(duì)細(xì)菌效果較差，對(duì)某些能同化烴類的微生物則不合用。（3）砂土管保藏法將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至滅過菌的砂土管中，于真空干燥器內(nèi)用真空泵抽干，再轉(zhuǎn)至有干燥劑的容器中，密封低溫保藏。本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。合用于細(xì)菌的芽孢、霉菌和放線菌孢子的保藏，不適于對(duì)干燥敏感的無芽孢的細(xì)菌和酵母菌。重要涉及砂土制備和真空抽干兩步。（4）冷凍干燥法此法的原理是在低溫下迅速將細(xì)胞凍結(jié)以保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，然后在真空下使水分升華。這樣菌種的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)處在極低水平，不易發(fā)生變異和死亡，因而能長(zhǎng)期保存，一般為5~2023。微生物在此條件下易死亡，所以需加入一些物質(zhì)作保護(hù)劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清等。該法存活率高，變異率低，并能廣泛合用于細(xì)菌（有芽孢和無芽孢的）、酵母、霉菌孢子、放線菌孢子和病毒等，因此是目前廣泛采用的好方法。其缺陷是手續(xù)麻煩，操作復(fù)雜，規(guī)定嚴(yán)格，并需有一定設(shè)備條件。（5）超低溫保藏法由于現(xiàn)在超低溫冰箱的使用已較普及，所以菌種的超低溫保藏法在生產(chǎn)公司和研究機(jī)構(gòu)已得到廣泛應(yīng)用。該方法的要點(diǎn)是：將要保藏的菌種置于10%甘油或二甲基亞砜保護(hù)劑中，密封于試管或安瓿管中，然后將其放入超低溫冰箱中于-70℃下保藏。該法簡(jiǎn)便易行，并且保藏效果較好。二、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的衰退與復(fù)壯微生物具有生命活動(dòng)能力，其世代時(shí)間一般是很短的，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此經(jīng)常導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化，并有也許使優(yōu)良菌種丟失，所以，如何保持菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定是研究菌種保藏的重要課題。（一）微生物菌種的衰退菌種退化通常是指在較長(zhǎng)時(shí)期傳代保藏后，菌株的一個(gè)或多個(gè)生理性狀和形態(tài)特性逐漸減退或消失的現(xiàn)象。常見的菌種衰退在形態(tài)上表現(xiàn)為分生孢子的減少或菌落顏色的改變。在生理上常指菌種發(fā)酵能力的減少，有些菌的抗噬菌體能力下降。對(duì)誘變育種而獲得的高產(chǎn)變異株則常表現(xiàn)出恢復(fù)野生型性狀等。但菌種的真正退化必須與由于環(huán)境因素變化而引起菌種形態(tài)、和生理上的變異區(qū)別開來。如培養(yǎng)基中微量元素缺少會(huì)導(dǎo)致孢子數(shù)量減少，也會(huì)引起孢子顏色的改變。此外，溫度、pH、不同碳氮源都會(huì)導(dǎo)致菌種變化。但只要一旦恢復(fù)正常條件，這些現(xiàn)象就會(huì)消失。此外，雜菌污染也會(huì)導(dǎo)致菌種退化的假象。因此，必須對(duì)的判斷是否退化，才干找出對(duì)的的解決辦法。一般菌種退化是從量變到質(zhì)變逐漸發(fā)生的，同時(shí)也是整個(gè)群體中產(chǎn)量減少及其相聯(lián)系的種種特性的變化，而不是指單個(gè)細(xì)胞的改變。引起菌種退化的因素重要有：1、基因突變菌種退化的重要因素是有關(guān)基因的負(fù)突變。假如控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變則會(huì)引起產(chǎn)量下降，假如控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變則孢子性能就會(huì)下降。當(dāng)然，這些負(fù)突變都是自發(fā)形成的。經(jīng)常處在旺盛生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞比休眼狀態(tài)細(xì)胞發(fā)生突變的機(jī)率大得多。在發(fā)酵生產(chǎn)中常用營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，如缺陷型發(fā)生回復(fù)突變就會(huì)使產(chǎn)量水平下降。如粘質(zhì)賽氏桿菌(Serratiamarcescens)H-2892菌株生產(chǎn)力為18g/L組氨酸，經(jīng)5次傳代后因回復(fù)突變型增多，產(chǎn)量下降至4g/L。很多抗生素生物合成、產(chǎn)氣憤生菌絲和色素等性狀都部分或所有受質(zhì)?；蚩刂?。當(dāng)菌株連續(xù)傳代、菌體發(fā)生質(zhì)粒脫落而出現(xiàn)大量光禿型菌落，則生產(chǎn)能力也顯著下降。2、變異菌株性狀分離變異菌株性狀分離也會(huì)引起高產(chǎn)型狀的喪失。在菌種篩選工作中經(jīng)常碰到初篩搖瓶產(chǎn)量很高，復(fù)篩產(chǎn)量逐漸下降而被淘汰的現(xiàn)象，在霉菌中更為常見。這是一種廣義的退化現(xiàn)象。當(dāng)誘變的單菌落是由一個(gè)以上孢子或細(xì)胞形成，而其中只有一個(gè)孢子或細(xì)胞是高產(chǎn)時(shí)，在移接傳代過程中，這個(gè)高產(chǎn)菌株數(shù)量減少，當(dāng)然產(chǎn)量也就下降。即使菌落是由一個(gè)孢子或單個(gè)細(xì)胞形成，只要它是多核細(xì)胞，在誘發(fā)突變中核的變化不會(huì)都同樣，隨著菌種傳代和核的分離也會(huì)使性狀表現(xiàn)多樣化，產(chǎn)量也會(huì)隨之變化，即使是單核孢子發(fā)生突變時(shí)，假如雙鏈DNA上僅一條鏈上某個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化，經(jīng)移殖后也會(huì)出現(xiàn)性狀分離。因此一個(gè)較穩(wěn)定的變異株的獲得必須通過多次分離純化。為了得到較多純種，有人考慮提高誘變劑量，使單核細(xì)胞DNA雙鏈中一條鏈的某一點(diǎn)發(fā)生突變，另一條鏈完全失活不再?gòu)?fù)制來提高純菌產(chǎn)生率。通過實(shí)驗(yàn)得到下表所示數(shù)據(jù)。不同劑量紫外線解決裂殖酵母時(shí)不純菌落百分?jǐn)?shù)劑量（以存活率計(jì)，%）菌落總數(shù)突變菌落數(shù)突變頻率（突變菌落/103）不純菌落（%）純不純100（對(duì)照）80~10060~8020~601~2012165120608553492298841134665195—122017280.0822716.722.6—43302113誘變突變株的穩(wěn)定性和誘變劑作用機(jī)制有關(guān)，一般認(rèn)為誘發(fā)DNA堿基轉(zhuǎn)換或顛換時(shí)不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較多，而誘發(fā)缺失交界時(shí)不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較少，由于缺失是不能回復(fù)的。3、連續(xù)傳代連續(xù)傳代也是菌種退化的直接因素。個(gè)別細(xì)胞性狀改變局限性以引起菌種退化，經(jīng)多次傳代，退化細(xì)胞在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，于是退化性狀表現(xiàn)逐步明朗化，最終成為一株退化菌株。以芽孢桿菌的黃嘌呤缺陷型在斜面上移殖代數(shù)對(duì)回復(fù)突變率和產(chǎn)量的關(guān)系為例，如下表所示。產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中產(chǎn)量和回復(fù)子數(shù)量間的關(guān)系實(shí)驗(yàn)移接代數(shù)每代斜面保存時(shí)間（天）回復(fù)子比數(shù)腺苷產(chǎn)量（g/L）1234560267912147133，1447，3，9，3，71，1447，3，9，3，13，58，1447，3，9，3，13，8，3，47，447，3，9，3，13，8，3，4，14，6，6，311/4.5×1061/2.4×1061/2.2×1051/3.5×1051/5.3×1031/1.0×10313.514.910.713.18.17.4由上表可見，雖菌種總的保存時(shí)間都是147天，但隨著移植代數(shù)的增長(zhǎng)，回復(fù)突變率也增長(zhǎng)，腺苷產(chǎn)量下降。這也說明，退化并不忽然明顯，而是當(dāng)退化細(xì)胞在繁殖速率上大于