動物細胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)修改可使用課件

2.2.1動物細胞培養(yǎng)及核移植技術(shù)南澗一中生物組楊文宇學(xué)習(xí)目標：【知識能力】1、動物細胞培養(yǎng)的過程、條件及應(yīng)用2、應(yīng)用細胞的基礎(chǔ)知識，分析細胞工程的理論基礎(chǔ)【重點】動物細胞培養(yǎng)的過程及條件。用動物體細胞核移植技術(shù)克隆動物的過程?！倦y點】用動物體細胞核移植技術(shù)克隆動物的過程?；貞浥c思考：1.植物體細胞雜交的基本過程及原理？2.植物細胞工程的應(yīng)用？3.完整的動物體細胞有全能性嗎？

隨著細胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能變窄。只有細胞核仍具有全能性。4.能否用植物組織培養(yǎng)的方法使動物細胞發(fā)育成動物個體？

不能。一：動物細胞培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用和概念：1、概念：動物細胞培養(yǎng)就是從動物有機體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個細胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細胞生長和增殖.2、原理：細胞增殖強調(diào)一：細胞貼壁過程細胞貼壁：在培養(yǎng)瓶懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細胞貼壁。培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿壁要求：表面光滑、無毒、易于帖附?！霎斮N壁細胞分裂生長到表面相互接觸時,細胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細胞的接觸抑制。強調(diào)二：接觸抑制細胞株：能夠傳代到40-50代的細胞，叫細胞株。遺傳物質(zhì)一般不會發(fā)生改變強調(diào)四：細胞系、細胞株細胞系：當細胞株細胞傳到50代以后一般不能再傳下去，部分細胞遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，能連續(xù)傳代，獲得不死性，叫細胞系。總結(jié)：動物細胞培養(yǎng)過程動物胚胎或幼齡動物的組織、器官配置細胞懸液剪碎用胰蛋白酶處理10代細胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶40-50代細胞傳代培養(yǎng)無限傳代單個細胞加培養(yǎng)液稀釋傳代10代以內(nèi)，遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。傳代10-50代左右，增長緩慢以至于完全停止，部分細胞核型可能發(fā)生變化（遺傳物質(zhì)可能改變）為什么用胰蛋白酶處理？分瓶傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)特點：細胞貼壁、接觸抑制繼續(xù)傳代培養(yǎng)少部分細胞獲得不死性，細胞突變，遺傳物質(zhì)已經(jīng)改變，等同于癌細胞。細胞株：一般說遺傳物質(zhì)未改變細胞系：遺傳物質(zhì)已改變原代培養(yǎng)【易誤警示】

①動物細胞培養(yǎng)中兩次用到胰蛋白酶，第一次用胰蛋白酶處理剪碎的組織使之分散成單個細胞，第二次使貼壁細胞從瓶壁上脫落下來。②原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)的分界點為分瓶的繼續(xù)培養(yǎng)。問題3：為什么用胰蛋白酶處理？問題1：、為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細胞培養(yǎng)材料？因為其細胞生命力旺盛，分裂能力強，分化程度低。問題2、為什么培養(yǎng)前要將組織細胞分散成單個細胞？擴大細胞與培養(yǎng)液的接觸面積，利與細胞吸收營養(yǎng)。動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，胰蛋白酶處理動物組織，可以使動物組織細胞間的蛋白質(zhì)和細胞外的其他成分酶解，獲得單個細胞。

問題4：為什么用胰蛋白酶處理而不用胃蛋白酶？動物細胞培養(yǎng)的最適PH值為7.2-7.4，胰蛋白酶作用的適宜PH為7.2-8.4，胃蛋白酶適宜PH為2.胃蛋白酶在PH為7.2-7.4的動物細胞培養(yǎng)中無活性。問題5：用胰蛋白酶處理不會把所培養(yǎng)的細胞消化掉嗎？控制好時間！長時間處理當然會損傷細胞。問題6、動物細胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨特之處？問題7、動物細胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？主要成分：（葡萄糖、氨基酸）、（水、無機鹽）、維生素和動物血清等。獨特之處有：1、液體培養(yǎng)基2、成分中有動物血清等不能，動物細胞培養(yǎng)只能使細胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體問題8、動物細胞培養(yǎng)的原理：細胞增殖。問題9、目前使用的或冷凍保存的正常細胞通常在10代以內(nèi)，為什么？10代以內(nèi)的細胞遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較：比較項目植物組織培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原理培養(yǎng)基性質(zhì)培養(yǎng)基特有成分培養(yǎng)結(jié)果培養(yǎng)目的取材其他條件葡萄糖促生長因子動物血清植物體細胞株、細胞系快速繁殖、培育無病毒植株獲得細胞或細胞分泌蛋白植物幼嫩部分或花藥胚胎或幼齡動物的器官或組織無菌無毒，適宜條件無菌無毒，適宜條件細胞的全能性細胞增殖固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基蔗糖植物激素

1、定義：

動物核移植是將動物的一個細胞的細胞核,移入一個已經(jīng)去掉細胞核的卵母細胞中.使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎,這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體.3、分類：

胚胎核移植、體細胞核移植。胚胎細胞分化程度低，恢復(fù)其全能性相對容易。動物體細胞分化程度高，恢復(fù)其全能性十分困難2、原理：

動物細胞核具有全能性4、體細胞核移植過程（動物克隆、無性繁殖克隆羊多利培育過程：黑面綿羊去核母細胞白面綿羊乳腺細胞核細胞核移植重組細胞電脈沖刺激早期重組胚胎胚胎移植另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利◆特別注意：克隆動物性狀與供體動物完全一樣嗎？不可能！因為：①供體動物只提供細胞核，而細胞質(zhì)中的遺傳物質(zhì)（如線粒體DNA）來自于受體卵母細胞.②生物的性狀不僅與遺傳物質(zhì)有關(guān)，還受環(huán)境的影響。供體受體代孕受體卵細胞Ａ母綿羊Ｂ母綿羊乳腺細胞細胞質(zhì)細胞核細胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育過程融合后的卵細胞黑面綿羊去核卵母細胞白面綿羊乳腺細胞核a重組細胞電脈沖刺激早期重組胚胎b另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利①、寫出ab所代表細胞工程名稱：a表示：

b表示:

②、實施細胞工程時，所需受體細胞大多采用卵母細胞的原因：體積大，易操作。含有促使細胞核表達全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。③、多利面部毛色是：

根據(jù)遺傳學(xué)原理說明判斷依據(jù)。核移植胚胎移植白色多利全部的核基因都來自白面綿羊

◆取供體細胞傳代培養(yǎng)10代以內(nèi)的細胞.為什么？◆用的是去核的減數(shù)第二次分裂中期細胞（MⅡ中期）為什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：電刺激◆胚胎移植至代孕受體內(nèi)

妊娠、分娩5.核移植流程供體：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶牛受體：普通奶牛（卵母細胞的采集與培養(yǎng)）

1.體積大，易操作。2.含有促使細胞核表達全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。有人說它三個母親，對嗎？核移植流程:1、供體細胞的采集與培養(yǎng)5、電刺激促融使供體核進入受體卵母細胞，構(gòu)建重組胚胎。

6、用物理或化學(xué)方法激活受體細胞，使其完成減數(shù)分裂進程4、將供體細胞注入去核卵母細胞3、顯微操作去除卵母細胞中的核2、受體卵母細胞的采集與體外培養(yǎng)7、胚胎移植入代孕母牛體內(nèi)8、妊娠分娩與供體遺傳物質(zhì)基本相同的犢牛。歸納:（1）共分成兩大階段：（2）移植過程用到的生物技術(shù)：核移植和胚胎移植動物細胞培養(yǎng)、核移植、早期胚胎培養(yǎng)、胚胎移植等（3）嚴格來說新個體具有

親本的性狀兩個1.動物克隆實例很多，為何多莉就舉世聞名呢？在1997年2月英國羅斯林研究所維爾穆特博士科研組公布體細胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎細胞核移植技術(shù)已經(jīng)有了很大的發(fā)展。實際上，“多莉”的克隆在核移植技術(shù)上沿襲了胚胎細胞核移植的全部過程，但這并不能減低“多莉”的重大意義，因為它是世界上第一例經(jīng)體細胞核移植出生的動物，是克隆技術(shù)領(lǐng)域研究的巨大突破。這一巨大進展意味著：在理論上證明了，同植物細胞一樣，分化了的動物細胞核也具有全能性．

思考題思考題2、對比多莉羊和課本高產(chǎn)奶牛的克隆過程，找出操作過程的不同點？多莉克隆過程的受體細胞是去核卵細胞，而高產(chǎn)奶牛的克隆過程的受體細胞是去核卵母細胞；多莉克隆過程是將供體細胞核注入受體細胞，而高產(chǎn)奶牛的克隆過程是將供體細胞注入受體細胞。3、討論分析上述哪一種措施更科學(xué)？并說明理由？卵母細胞當中的細胞周期蛋白含量、活性比卵細胞高，用它作受體更容易成功將供體細胞注入受體細胞，使克隆動物更像供體動物，操作也方便動物細胞培養(yǎng)與動物體細胞核移植5.體細胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景(1)加速家畜

改良進程，促進

繁育。(2)保護瀕危物種。(3)生產(chǎn)

。(4)作為異種移植的

。(5)用于組織器官的移植。良種畜群遺傳醫(yī)用蛋白供體6.體細胞核移植技術(shù)存在的問題成功率非常低絕大多數(shù)克隆動物存在健康問題對克隆動物食品的安全性問題也存在爭議P50思考與探究1幼齡與老齡動物的組織細胞相比較，分化程度低的與分化程度高的組織細胞比較，哪一種更易于培養(yǎng)？思考一下，這是什么道理？提示：細胞的衰老與動物機體的衰老有著密切的關(guān)系，細胞的增殖能力與供體的年齡有關(guān)，幼齡動物細胞增殖能力強，有絲分裂旺盛，老齡動物則相反。所以，一般來說幼年動物的組織細胞比老年動物的組織細胞易于培養(yǎng)。同樣，組織細胞的分化程度越低，則增殖能力越強，所以更容易培養(yǎng)。2.動物細胞培養(yǎng)要經(jīng)過脫分化的過程嗎？為什么？提示：脫分化又稱去分化，是指分化細胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只毎匦缘倪^程。植物的任何一部分，甚至單個細胞都具有長成完整植株的能力。但要發(fā)育成完整植株，必須先脫分化，脫分化的細胞具有發(fā)育成任何組織的能力，然后進行再分化，形成完整植株。植物細胞培養(yǎng)主要用于農(nóng)林生產(chǎn)中的作物、苗木育種，快速繁育種苗、培育無病毒植株等，這就要求植物的組織或細胞先進行脫分化。動物細胞的培養(yǎng)有各種用途，一般而言，動物細胞培養(yǎng)不需經(jīng)過脫分化過程。因高度分化的動物細胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力，所以，動物細胞也就沒有類似植物組織或細胞培養(yǎng)時的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動物細胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動物干細胞，使其分化成所需要的組織或器官。3.1997年，美國威斯康星州的一個奶牛場有一頭名叫盧辛達（Lucinda）的奶牛，年產(chǎn)奶量為30.8t，創(chuàng)造了世界奶牛產(chǎn)奶量最高新紀錄。目前世界各國高產(chǎn)奶牛場奶牛，年平均產(chǎn)奶量一般為十幾噸，而我國奶牛產(chǎn)奶量年平均水平僅為3～4t。（1）能利用體細胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達嗎？請說明理由。提示：可以用體細胞核移植技術(shù)克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達。盧辛達的產(chǎn)奶量很高，說明它有高產(chǎn)奶的遺傳基礎(chǔ)，利用盧辛達的體細胞克隆的奶牛其遺傳物質(zhì)基本上全部來自該奶牛，其克隆牛具有高產(chǎn)的遺傳基礎(chǔ)，如果精心培育和飼養(yǎng)，有可能在世界范圍內(nèi)推廣，克隆牛再與高產(chǎn)的公牛自然繁殖，可得到很多高產(chǎn)的后代，從而加快奶牛改良進程。但同時需注意，該克隆牛不能無限制地推廣，其數(shù)量不宜過多，尤其是在小范圍內(nèi)不能無限的繁殖，以避免奶牛群出現(xiàn)近親繁殖而引起種質(zhì)衰退。（2）如果將克隆高產(chǎn)奶牛盧辛達的任務(wù)交給你，你將如何對它進行克?。刻崾荆菏紫葟谋R辛達耳朵（也可用別的組織、器官，耳朵在活體上容易?。┥霞羧∫恍K組織，在體外培養(yǎng)獲得該組織（如軟骨組織）的細胞。從屠宰場取廢棄的牛卵巢，抽取卵母細胞體外培養(yǎng)成熟。用顯微針去除卵母細胞的核，再將耳細胞注入卵母細胞，用電刺激方法使卵母細胞與體細胞融合，這時供體核就進入了受體卵母細胞，再用電刺激或化學(xué)物質(zhì)激活注入了體細胞核的卵母細胞，使其完成減數(shù)分裂和發(fā)育過程。核移植胚胎在體外短時間培養(yǎng)后，挑選正常卵裂的胚胎植入經(jīng)同期發(fā)情處理的受體母牛體內(nèi)。4.體細胞核移植技術(shù)在研究和應(yīng)用上還存在什么問題？請你查閱資料，了解這方面的前沿動態(tài)。提示：在研究方面，克隆動物基因組重新編程的機制尚不清楚，克隆技術(shù)效率低，克隆動物畸形率高、死亡率高、易出現(xiàn)早衰等問題。這些問題尚在研究中。在應(yīng)用上，生產(chǎn)克隆動物費用昂貴，距大規(guī)模應(yīng)用還有一定距離?！居懻揚46】多細胞動物和人體的細胞都生活在內(nèi)環(huán)境中，根據(jù)你所學(xué)的內(nèi)環(huán)境的知識，思考并討論以下問題：1.體外培養(yǎng)細胞時需要提供哪些物質(zhì)？充足的營養(yǎng)供給、適宜的溫度、適宜的pH和氣體環(huán)境。2.體外培養(yǎng)的細胞需要什么樣的環(huán)境條件？提示：無菌、無毒的環(huán)境。討論P49１、核在進行體細胞核移植之前，為何要去掉受體卵母細胞的核？為使核移植動物的遺傳物質(zhì)全部來自有利用價值的動物提供的細胞。２、用于核移植的供體細胞一般都選用傳代10代以內(nèi)的細胞，為什么？10代以內(nèi)的細胞保持一般保持正常二倍體的核型，未突變3、細胞核移植生產(chǎn)的克隆動物是對體細胞供體動物進行了100%的復(fù)制嗎？為什么？不是，克隆動物絕大部分DNA來自供體細胞核，但