實驗四 光學(xué)顯微標本的切片制作技術(shù)

實驗四光學(xué)顯微標本的切片制作技術(shù)一、實驗?zāi)康牧私夤鈱W(xué)顯微鏡切片制作技術(shù)的基本方法步驟。二、實驗原理采用光學(xué)顯微鏡研究一般生物體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，在自然狀態(tài)下是無法觀察清楚的，多數(shù)動、植物材料都必須經(jīng)過某種處理，將組織分離成單個細胞或薄片，光線才能通過細胞。為了適應(yīng)這個需要，就產(chǎn)生了光學(xué)顯微鏡制片技術(shù)。光學(xué)顯微鏡的制片技術(shù)方法可分為兩大類：一類是非切片法，另一類是切片法。非切片法，是用物理或化學(xué)的方法，使細胞彼此分離，如有分離法、涂布法、壓碎法等。非切片法的操作比較簡單，能保持細胞的完整，但是細胞之間的正常位置往往被更動，無法反映細胞之間的正常聯(lián)系。它可以與切片法配合使用，各取其長處。切片法，是利用銳利的刀具將組織切成極薄的片層，材料須經(jīng)過一系列特殊的處理，如固定、脫水、包埋、切片、染色等，過程十分繁復(fù)。在制作過程中，還要經(jīng)過一系列的物理和化學(xué)的處理，這些處理方法可根據(jù)各種不同材料的性質(zhì)要求進行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣，技術(shù)復(fù)雜，但是，它最能保持細胞間的正常的相互關(guān)系，能較好和較長時間地保留細胞的原貌，所以仍然是光學(xué)顯微鏡的主要制片方法。三、實驗材料1．材料洋蔥根或小鼠肝。2．試劑乙醚、無水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸、正丁醇、二甲苯、石蠟、甘油、雞蛋、紗布、加拿大樹膠、麝香草酚。3．儀器石蠟切片機、恒溫蠟箱、載玻片、蓋玻片。四、實驗步驟光學(xué)顯微鏡切片制作技術(shù)最簡單的切片法是徒手切片，但是由于組織塊往往十分柔軟，切削很困難，而且無法得到十分薄的切片，因此必須先用某些特殊物質(zhì)滲入組織塊的內(nèi)部起支持作用，并將整個組織塊包住，然后再用精密的切片機制作切片，才能獲得良好的效果。這種方法稱為包埋法，包埋的物質(zhì)稱為包埋劑。常用的包埋劑有石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等，水和塑料也可作為包埋劑。根據(jù)包埋劑的不同，分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等，它們各有長處，可以根據(jù)需要選用，但是使用得最多的還是石蠟切片技術(shù)。石蠟作為包埋劑，有其獨特的優(yōu)點，例如：石蠟?zāi)芮谐鰳O薄的蠟片2?10“m）；切片時能連成蠟帶，便于制作連續(xù)切片；操作較容易，組織塊可以包埋在石蠟中長期保存。然而石蠟切片的制作過程較長，步驟很多，一步不慎往往導(dǎo)致前功盡棄，而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮，切片時受濕度影響比較大，這些不足之處必須在制片過程中認真對待，盡量減小它的不良影響。石蠟切片的制作過程主要包括：取材、固定、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、貼片、染色、透明、封藏等步驟。1．取材材料的好壞直接影響到切片的質(zhì)量，無論取哪一種動植物材料，以下幾點是必須注意的。（1） 植物材料選擇時需盡可能不損傷植物體或所需要的部分；動物材料取用時常對動物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯仿和乙醚，或?qū)游餁⑺篮笱杆偃〕鏊枰慕M織。（2） 取材必須新鮮，這一點對于從事細胞生物學(xué)研究尤為重要，應(yīng)該盡可能割取生活著的組織塊，并隨即投入固定液。（3） 切取材料時刀要銳利，避免因擠壓細胞使其受到損傷。（4） 切取的材料應(yīng)該小而薄，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部。一般厚度不超過2mm,大小不超過5mmX5mmo2．固定組織和細胞離開機體后，在一定時間內(nèi)仍然延續(xù)著生命活動，會引起病理變化直至歸于死亡。為了使標本能反映它生前的正常狀態(tài)，必須盡早地用某些化學(xué)藥品迅速地殺死組織和細胞，阻抑上述變化，并將結(jié)構(gòu)成分轉(zhuǎn)化為不溶性物質(zhì)，防止某些結(jié)構(gòu)的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外，固定劑會使組織適當(dāng)硬化以便于隨后的處理，還會改變細胞內(nèi)部的折射系數(shù)并使某些部分易于染色。固定劑的作用對象主要是蛋白質(zhì)，至于其他成分如脂肪和糖，在一般制作時不加考慮，如要觀察這些物質(zhì)，可用特殊的方法將其固定下來。固定劑的作用表現(xiàn)在對材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小，都依所固定的材料性質(zhì)而定，同樣一種固定液對某一材料來說是良好的，但對另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特征是：穿透組織的速度快，能將細胞中的內(nèi)含物凝固成不溶解物質(zhì)，不使組織膨脹或收縮以保持原形，硬化組織的程度適中，增加細胞內(nèi)含物的折光度，增加媒染和染色能力，具有保存劑作用。固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。簡單固定劑即單一的固定劑，常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中，苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白，又能凝固核蛋白；乙醇只能凝固清蛋白，而醋酸只能凝固核蛋白；甲醛、鋨酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質(zhì)都不凝固。簡單固定劑的局限性較大，如將其適當(dāng)混合，制成復(fù)合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有：Bouin液（70份苦味酸飽和水溶液+25份4%甲醛+5份冰醋酸）、Zenker液（升汞5g+重鉻酸鉀2.58+硫酸鈉1.08+5ml冰醋酸+100ml蒸餾水）、Carnoy改良液（3份無水乙醇+1份冰醋酸）等。固定劑的種類甚多，必須依據(jù)其性能及制片的不同要求來加以選擇。固定時，須注意以下幾點：（1）固定型應(yīng)有足夠的量，一般為組織塊體積的10~15倍。（2）如所固定的材料外表有不易穿透的物質(zhì)，可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘，再移入水溶性的固定液。（3）材料固定后如不立即下沉，可將其中氣泡抽出。（4） 固定時間依材料大小、固定劑種類而異，可從1小時到幾十小時，有時中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強，作用時間應(yīng)嚴加控制，不能過長。（5） 一般固定劑都以新配制的為好，用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者，一定要在使用前才混合。（6） 固定完畢，根據(jù)所用固定劑的不同，用水或乙醇沖掉殘留的固定劑，以免固定劑形成沉淀，影響以后組織塊的染色。3．脫水生物組織中含有大量的水分，它和石蠟是不能相溶的，致使在包埋時石蠟無法滲入組織內(nèi)部，因此須使用脫水劑將水分除盡，這就是脫水的作用。脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類：一類是非石蠟溶劑，如乙醇、丙酮等，脫水后必須再經(jīng)過透明，才能透蠟包埋；另一類是兼石蠟溶劑，如正丁醇，脫水后即可直接透蠟。常用的脫水劑是乙醇，因為它價格便宜，易于得到。為了避免劇烈的擴散引起的組織的強烈收縮，脫水步驟應(yīng)從低到高以一定的濃度梯度來進行，一般組織從30%乙醇開始，經(jīng)過50%、70%、80%、95%、100%至完全脫水；對于一些柔軟的組織應(yīng)從15%開始。脫水時間依據(jù)組織的類型和大小而定，一般在各級乙醇中放置45min~1h，如果中間需停頓，應(yīng)使材料停留在70%乙醇中，因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體，高濃度乙醇有脆化組織作用，放置時間不能過長，另外，脫水必須在有蓋瓶中進行，以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導(dǎo)致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中，如需長期保存，可以加入等量的甘油。丙酮也是很好的脫水劑，其作用和用法與乙醇相同，不過其脫水力和收縮力都比乙醇強。甘油常用于藻類、菌類及柔弱材料的脫水。二氧六環(huán)為無色的石蠟溶劑，對組織沒有收縮及硬化等不良后果，但其蒸氣有毒，使用時須小心。正丁醇可與水及乙醇混合，亦為石蠟溶劑，其優(yōu)點是很少引起組織塊的收縮與變脆。叔丁醇的性質(zhì)、作用和用法同于正丁醇，但因其價格昂貴而很少使用。4．透明組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經(jīng)過透明。透明劑能同時與脫水劑和石蠟混合，它取代了脫水劑后，石蠟便能順利地滲入組織。透明劑的種類很多，較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。二甲莖作用較快，透明力強，但如果組織塊在其中停留過久，易收縮變脆變硬，同時若脫水不凈，會引起不良后果，在應(yīng)用時必須特別小心。通常將組織塊先經(jīng)純乙醇與二甲苯的等體積混合液，再進入純二甲苯，這樣可減少上述的缺點。透明時間應(yīng)由組織大小而定，一般各級停留時間在30min?2h，在純二甲苯中應(yīng)更換2次，總時間則以不超過3h為宜。材料經(jīng)過透明，會顯示出前一步脫水的效果如何，若脫水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀，說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分，并保持其無水狀態(tài)。甲苯一般性質(zhì)與二甲苯相似，用法亦同，只是沸點較低，透明較慢，但不會使組織變脆。苯的用法同于二甲苯，對組織的收縮作用小，但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適用于大塊組織的透明。5．透蠟和包埋包埋用的石蠟，熔點在50?60°C間，應(yīng)根據(jù)材料本身的硬度、切片的厚薄和當(dāng)時的氣溫條件來選用。一般動物材料最常用的石蠟熔點為52~56C，植物材料的用54?58C的；切片薄的用58~60C的，切片厚的則用52-54C的；室溫10?19C時選用52~54C的石蠟可順利切片，冬季可用熔點46~48C的石蠟，夏季可選56~58C的。石蠟的優(yōu)劣與切片的成敗密切相關(guān)。鑒別石蠟質(zhì)量的方法是：將石蠟熔化后倒入紙盒使其凝結(jié)且無氣泡和裂痕，30~35C放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點出現(xiàn)，蠟塊裂面不呈顆粒狀，切成薄片不碎成細粒。這種石蠟即為品質(zhì)優(yōu)良。含有雜質(zhì)的新蠟或用過的廢蠟可清潔后再用，方法是將石蠟放入鍋內(nèi)，加熱到開始冒白煙，然后用小火繼續(xù)加熱30min（注意別超過發(fā)火點），使其去除水分和揮發(fā)性雜質(zhì)，并在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。透蠟必須在恒溫箱中進行，恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石蠟熔點3C,使經(jīng)過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應(yīng)處理2?3次，透蠟的時間依材料、性質(zhì)而定，一般每次需15?30min。透蠟的關(guān)鍵關(guān)鍵是控制溫度的恒定，切忌忽高忽低，溫度過低石蠟?zāi)虩o法滲透，溫度過高使組織收縮發(fā)脆。包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是：先準備好紙盒，將熔蠟倒入盒內(nèi)，迅速用預(yù)溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部，切面朝下，再輕輕提起紙盒，平放在冷水中，待表面石蠟?zāi)毯罅⒓磳⒓埡邪慈胨?，使其迅速冷卻凝固，30min后取出。包埋用蠟的溫度應(yīng)略高于透蠟溫度，保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要，否則包埋塊中將會產(chǎn)生結(jié)晶。以后切片時引起碎裂。6．切片（1） 石蠟塊的固著與整修包埋以后，就可進行切片。包埋好的石蠟塊裝上切片機進行切片前還須進行固著和整修。1） 固著：一般旋轉(zhuǎn)式切片機上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤，這也可用同樣大小的臺木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊黏貼于固著物上，并使組織塊朝外，便于以后迅速切出所需的片子。2） 整修：用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，常保留組織周圍附著寬2~3mm的石蠟，而修好的蠟塊呈長方形。還可削去一角以便于在蠟帶上識別切片。（2） 切片機和切片刀切片機是用來做各種組織切片的一種專門設(shè)計的精密機械，常用的是旋轉(zhuǎn)式切片機，它的夾物部分是上下移動前后推進的，而夾刀部分則固定不動。主要部件是安裝切片刀的刀臺、安裝包埋塊的標本臺和控制切片厚度的微動裝置。切片時切片刀固定不動，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)輪，標本臺上下運動并按調(diào)好的切片厚度向前推進一定的距離，組織塊上下運動一次，便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。切片刀與切片的質(zhì)量直接相關(guān)。切片前必須磨刀，方法是：將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在于滑的磨刀石上，將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨，使用完畢后應(yīng)及時用二甲苯將石蠟油擦凈。（3）切片方法切片前，在放大鏡下選擇刀口平整無缺刻的部分來進行切削。將所要切的包埋塊固定在標本臺上，使包埋塊外切面與標本夾截面平行，并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺推至外緣后松開刀片夾的螺旋，上好刀片，使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角，包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調(diào)節(jié)切片要求的厚度，調(diào)節(jié)時應(yīng)注意指針不可在兩個刻度之間，否則容易損傷切片機，將刀臺移至近標本臺處，讓刀口與組織切面稍稍接觸，這時就可以開始切片了。方法是：右手轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)輪，左手持毛筆在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蠟帶，待蠟帶形成一定長度后，右手停止轉(zhuǎn)動，持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起，平放于襯有黑紙的紙盒內(nèi)，注意切片速度不宜太快，搖動轉(zhuǎn)輪用力應(yīng)均勻，防止切片機震動厲害

引起切片厚薄不均勻，還應(yīng)注意轉(zhuǎn)動的方向，以防標本臺后移而切不到片子。切片完畢，應(yīng)及時用氯仿將切片機的有關(guān)部分擦凈。（4）切片中存在的問題及補救方法石蠟切片是很不容易掌握的，有時很容易成功，有時則由于某種因素而造成切片的質(zhì)量

低劣，甚至完全失敗?，F(xiàn)將切片時經(jīng)常遇到的—些缺點、可能的原因以及補救辦法列于下表。表1-5石蠟切片可能產(chǎn)生的問題和解決方法缺點原因補救辦法石蠟帶彎曲不石蠟塊上下兩邊不平行；取下臺木，將兩邊修干；直石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行；調(diào)節(jié)標本臺，使兩者平行；刀口鋒利不—，局部產(chǎn)生差異；移動刀片，改用新的刀口；蠟塊的—邊較另—邊為軟，或兩邊的硬度不—致；待蠟塊冷卻后再切，或重新包埋；材料未居蠟塊正中央；用刀片切去部分石蠟，使材料居中；在大的一邊切去材料大而形不正；少許石蠟切片分離、不能室溫過低；在切片機上方開一電燈或提高室溫；連成帶狀石蠟過硬；在蠟塊面加一層45°C的軟蠟或用手指蠟塊面摩擦；重新包埋；材料邊緣留蠟太少；刀的角度不適合矯正刀的角度切片卷起呈圓室溫過低；提高室溫；筒狀石蠟過硬；加軟蠟；刀口太鈍；用毛筆將蠟片攤開壓住，切2-3片即成帶；刀的傾角太大減小傾角切片黏附于切室溫過高；降低室溫；片刀，皺褶在一石蠟過軟；將蠟塊投入涼水中稍浸；起刀口上留有一層石蠟；切片厚度，改用硬蠟包埋，用二甲苯拭去刀口的石蠟；刀口鈍磨刀或移動刀口切片縱裂刀有缺口；可移動刀口；石蠟塊中含有顆粒、雜質(zhì)；將顆粒拽去；刀口留有碎屑或細絲；清潔刀口；組織太硬讓包埋塊在水中浸泡切片有橫紋刀和臺木的固定螺絲太松；旋緊螺旋；刀口傾斜度太大；可放干1-2°后再切；刀口有石蠟屑用氯仿拭去切片厚薄不勻切片機有毛?。怀C正切片機裝置；夾刀不當(dāng)；對癥治療；未旋緊標本臺螺旋；旋緊螺旋；石蠟塊過硬將石蠟塊在水中浸泡每張切片厚薄刀口震動，是由于材料過硬；在蠟塊表面涂一層火棉膠；不勻刀的傾角太大減小傾角材料發(fā)生裂隙脫水不干凈；無法彌補；

破碎或脫落有透明劑殘留；石蠟透入時，溫度過高或時間過長；由于脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發(fā)脆切片時發(fā)生沙

沙聲石蠟塊將蠟帶

抬起切片時發(fā)生沙

沙聲石蠟塊將蠟帶

抬起增加浸蠟時間，重新包埋；無法補救；用正丁醇、叔丁醇等進行脫水和透明在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液浸泡水中軟化；無法補救；無法補救提高室溫；用刀片將碎屑清除；用二甲苯或氯仿清除7．貼片增加浸蠟時間，重新包埋；無法補救；用正丁醇、叔丁醇等進行脫水和透明在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液浸泡水中軟化；無法補救；無法補救提高室溫；用刀片將碎屑清除；用二甲苯或氯仿清除切好的切片必須貼附于載玻片上才能做進一步處理，但是切片常有細小的橫紋，必須經(jīng)展平后才能貼附，否則影響染色和觀察。貼片一般有撈片法和燙板法。撈片法比較簡單，首先將切片分割開，投入到48°C的溫水浴中，這時切片都浮在水面上，由于表面張力的作用使切片自然展平，然后用涂有甘油蛋白溶液（將雞蛋一個打破入杯中，去除蛋黃留下蛋白，用筷子充分調(diào)打成雪花狀泡沫，然后用雙層紗布過濾至容器中，加入等量的甘油，混合，最后加入百分之一體積的麝香草酚作防腐用，可保存幾個月到一年。）或5％明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片，使切片貼附在載玻片的合適位置，于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥。燙板法，是將涂有黏片劑的載玻片上涂上水，把已分割好的切片貼上去，再置載玻片于35C恒定的燙板上讓切片攤干，并傾斜或用吸水紙吸去水分，最后將載玻片再度放燙板上晾干。注意，不管是使用撈片法還是燙板法，所用