高粱中直鏈淀粉和支鏈淀粉檢測方法研究報告

檢測中心文件————方法研究報告擬稿：馮金娜核稿：汪詠曾高粱中直鏈淀粉和支鏈淀粉檢測方法研究報告【簡述】淀粉是一種天然高分子化合物，按照結(jié)構(gòu)可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩種。自然淀粉中支鏈淀粉比例較高，一般約占總淀粉的70%以上，糯高粱中支鏈淀粉含量尤其高，直鏈淀粉含量很低，且不同品種、生長時期的高粱其支鏈淀粉和直鏈淀粉含量也有差異。直鏈淀粉是D-葡萄糖基以a-(1,4)糖苷鍵連接的多糖鏈，具有抗?jié)櫭浶?，水溶性較差，不溶于脂肪；支鏈淀粉又稱膠淀粉,分子相對較大,難溶于水。高粱是我公司主要的釀酒原料，高粱中直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量對白酒的出酒率和白酒品質(zhì)都有重要的影響，因此建立高粱中直鏈淀粉和支鏈淀粉的檢測方法，對釀酒生產(chǎn)與白酒品質(zhì)的提升均具有重要的指導(dǎo)意義。根據(jù)公司年度計劃的要求，檢測中心以國家標準GB7648-87《水稻、玉米、谷子粒直鏈淀粉測定法》為基礎(chǔ)建立高粱中直鏈淀粉和支鏈淀粉的檢測方法。1實驗原理淀粉與碘形成碘-淀粉復(fù)合物，并具有特殊的顏色反應(yīng)，支鏈淀粉與碘生成棕紅色復(fù)合物，直鏈淀粉與碘生成深藍色復(fù)合物。在淀粉總量不變的條件下，直鏈淀粉和支鏈淀粉的物質(zhì)波峰處對應(yīng)的兩個波長λ1和λ2，樣品在這兩個波長下均有吸收。由于吸光度值具有疊加性，測定樣品在某一波長下的吸光度值時其結(jié)果為直鏈淀粉和支鏈淀粉在該波長下吸光度值的總和。由直鏈淀粉和支鏈淀粉的性質(zhì)可知這兩種物質(zhì)與碘反應(yīng)時互不干擾，故可根據(jù)直鏈淀粉和支鏈淀粉顯色反應(yīng)后在不同波長下的吸光度值進而將樣品中單一組分的吸光度值計算出來，再從建立的回歸曲線方程得到相應(yīng)的含量。2儀器與試劑：2.1試劑實驗中所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的三級水。2.1.1氫氧化鈉溶液：1moL/L。2.1.2鹽酸（1+1）。2.1.32.1.4碘貯備溶液：稱取2g碘和20g2.1.5碘試劑：取10mL碘貯備液稀釋至100mL2.1.62.1.7高梁支鏈淀粉2.1.8馬鈴薯直鏈淀粉標準溶液：1mg/mL，稱取干燥馬鈴薯直鏈淀粉標準品（2.1.6）0.1031g（相當于純品0.1000g）于燒杯中，加入1mL95%乙醇充分濕潤，再加9mL1moL/L氫氧化鈉溶液，于沸水中分散10min，冷卻后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中并2.1.9高梁支鏈淀粉標準溶液：1mg/mL，稱取干燥高梁支鏈淀粉標準品（2.1.7）0.1271g（相當于純品0.1000g）于燒杯中，同2.1.82.2儀器2.2.1粉碎機2.2.2電子天平：FA20042.2.3雙光束紫外可見分光光度計：TU-19012.2.4篩子：80目2.2.5索氏提取器3檢測波長的選擇配制一系列濃度的直鏈淀粉和直鏈淀粉標準溶液，加入碘試劑反應(yīng)10min，在紫外分光光度計中進行全波段掃描，其中支鏈淀粉最大吸收峰在532nm處，直鏈淀粉最大吸收峰在641nm處，因此將支鏈淀粉和直鏈淀粉的檢測波長分別定為532nm和641nm。4空白溶液的確定和直鏈淀粉、支鏈淀粉疊加性探究4.1空白溶液的選擇準確吸取2.5mL高粱淀粉溶液到100mL容量瓶中，調(diào)節(jié)pH值為3.0，加入2.0mL碘試劑反應(yīng)10min后進行測定。其中一組采用蒸餾水作為參比液，另外一組采用試劑空白溶液作為參比液，進行紫外全波段掃描，得到以蒸餾水為參比的掃描圖譜和以試劑空白溶液的掃描圖譜如圖1所示。再對試劑空白溶液進行紫外全波段掃描，其掃描圖譜如圖2所示。從圖1得知用蒸餾水作為參比液測得的紫外數(shù)據(jù)與試劑空白參比測得的數(shù)據(jù)在約550nm以上一致，但在550nm以下開始出現(xiàn)差異，其原因是碘開始有紫外吸收，使得水參比實驗組呈現(xiàn)出了碘的吸收特點。為保證結(jié)果的準確性，故需采用試劑空白溶液作為參比液，來消除碘對碘-淀粉復(fù)合物的紫外干擾。圖1同一淀粉溶液在不同參比下的紫外吸收光譜圖2試劑空白溶液的紫外吸收光譜4.2直鏈淀粉、支鏈淀粉疊加性實驗取3個100mL容量瓶，準確吸取0.5mL直鏈淀粉標準溶液（2.1.8）于第一個容量瓶中，取3.5mL支鏈淀粉標準溶液（2.1.9）于第二個容量瓶中，準確吸取0.5mL直鏈淀粉標準溶液（2.1.8）和3.5mL支鏈淀粉標準溶液（2.1.9）于第三個容量瓶中，圖3直鏈淀粉和支鏈淀粉紫外吸收光譜5α、β值的確定以及標準曲線的建立5.1α、β值的確定按照表1配置兩組淀粉標準溶液，分別進行紫外全波段掃描和532nm處與641nm處吸光度值的測定。由測定的實驗數(shù)據(jù)可得α平均值為0.4507，β平均值為0.4857。表1不同濃度淀粉標準溶液在532nm處與641nm處吸光度值A(chǔ)532A641A532A64112.00.03060.06370.48041315.00.06410.0290.452423.00.04710.09610.49011418.00.07570.03360.443935.00.07850.16110.48731520.00.08650.03880.448648.00.12560.25720.48831622.00.09580.04310.4499510.00.16540.34060.48561725.00.10830.04840.4469612.00.19050.39370.48391830.00.13230.05970.4512715.00.23710.4880.48591935.00.15380.06980.4538818.00.28350.5850.48462038.00.16750.07520.4490920.00.32080.66390.48322140.00.17960.08140.45321022.00.3470.7140.48602243.00.18660.08430.45181125.00.39630.81320.48732345.00.19950.09090.45561230.00.46960.96610.48612450.00.22160.10010.4517系列淀粉標準溶液的紫外全波段光譜如圖4、圖5：圖4直鏈淀粉系列標準溶液紫外圖譜圖5支鏈淀粉系列標準溶液紫外圖譜5.2標準曲線的繪制取7個100mL容量瓶，按照表2和表3分別配制直鏈淀粉和支鏈淀粉標準溶液，以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。5.表2：直鏈淀粉標準曲線序號加入直鏈淀粉標準溶液（2.1.8濃度，mg/lA64110.22.00.0720.55.00.16231.010.00.335641.515.00.493652.020.00.668762.525.00.818873.030.00.9823擬合標準曲線為：R值：0.99995.表3：支鏈淀粉標準曲線序號加入支鏈淀粉標準溶液（2.1.9濃度，mg/lA53213.030.00.114224.040.00.155335.050.00.193346.060.00.233457.070.00.271668.080.00.308479.090.00.3412擬合標準曲線為：R值：0.99956穩(wěn)定性試驗取1個混合標準溶液，顯色后在532nm波長條件下，每間隔10min檢測吸光度，檢測結(jié)果表明在30min內(nèi)吸光度值基本穩(wěn)定。表4：穩(wěn)定性檢測數(shù)據(jù)時間10min20min30min40min50min60min吸光度值0.65120.65100.65110.64800.64300.63897樣品前處理與測定7.1樣品的選取和制備挑選干凈的高粱樣品，用粉碎機粉碎，過80目篩，混勻后測定樣品中的水分。7.2脫脂稱取干燥后的樣品放入索氏提取器中，加入甲醇30mL，加熱回流脫脂4h，然后放入干燥箱中干燥，并測定樣品中的粗脂肪含量。7.3樣品分散精確稱取0.1g脫脂后的干燥樣品于100mL容量瓶中，加入1mL95%乙醇，充分濕潤樣品，再加入9mL1mol/L氫氧化鈉溶液后7.4顯色與測定吸取分散后的樣液10mL于100mL容量瓶中，加水30mL，調(diào)節(jié)pH值為3.0，再加入碘試劑2mL，用水定容至刻度。顯色10min后，于紫外分光光度計中測定532nm處和641nm處的吸光度值，同一樣品平行測定5次，取平均值。7.5結(jié)果計算：直鏈淀粉：X=式中X——直鏈淀粉占樣品干重的百分比，%；A641——樣品溶液在641nm處的吸光度值；A532——樣品溶液在532nm處的吸光度值；α——由實驗計算出的常數(shù)；β——由實驗計算出的常數(shù)；m——樣品的質(zhì)量，g；H——水分百分率；——樣品粗脂肪含量。支鏈淀粉：X=式中X——支鏈淀粉占樣品干重的百分比，%；A641——樣品溶液在641nm處的吸光度值；A532——樣品溶液在532nm處的吸光度值；α——由實驗計算出的常數(shù)；β——由實驗計算出的常數(shù)；m——樣品的質(zhì)量，g；H——水分百分率；——樣品粗脂肪含量。8精密度試驗精密稱取0.1克左右高粱樣品（按7.1和7.2進行樣品制備）至100mL容量瓶中按7.3進行樣品分散，再按7.4和7.5進行顯色測定與計算，連續(xù)測量6次，計算其直鏈淀粉和支鏈淀粉的含量以及RSD值，具體結(jié)果如下：表5：精密度試驗結(jié)果編號直鏈淀粉含量，%支鏈淀粉含量，%1#6.302460.64902#6.302260.64913#6.302560.64884#6.302060.64825#6.301960.64856#6.302160.6489RSD值，%0.00370.000569．重復(fù)性試驗精密稱取0.1克左右高粱樣品（按7.1和7.2進行樣品制備）至表6：重復(fù)性試驗結(jié)果編號直鏈淀粉含量，%支鏈淀粉含量，%1#21.096161.43842#21.095861.43883#21.090661.43904#21.095561.43955#21.092361.43756#21.097061.4350RSD值，%0.0120.002710準確度試驗10.1直鏈淀粉精密稱取0.1克高粱樣品（按7.1和7.2進行樣品制備）至100mL容量瓶中按照7.3進行樣品分散，按照表7添加直鏈淀粉標準溶液，再按照7.4和7.5進行顯色測定，得到表7：直鏈淀粉準確度試驗結(jié)果編號1#2#3#4#5#6#加樣濃度，mg/L2.05.010.015.020.025.0測定濃度，mg/L1.91454.939.921914.716519.888624.3860回收率，%95.7398.7799.2298.1199.4497.5410.2支鏈淀粉精密稱取0.1克高粱樣品（按7.1和7.2進行樣品制備）至100mL容量瓶中按照7.3進行樣品分散，按表8添加支鏈淀粉標準溶液，再按照7.4和7.5進行顯色測定，表8：支鏈淀粉準確度試驗結(jié)果編號1#2#3#4#5#6#加樣濃度，mg/L10.020.025.030.040.050.0測定濃度，mg/L10.224520.534523.354826.335334.538545.3612回收率，%102.25102.6793.4287.7886.3590.7211檢測總結(jié)11.1直鏈淀粉和支鏈淀粉標準曲線：直鏈淀粉和支鏈淀粉分別在641nm和532nm處有最大的吸收峰，直鏈淀粉在2～30mg/L、支鏈淀粉在30～90mg/L有很好的線性關(guān)系。11.2精密度試驗：同一顯色后的樣品溶液，分別在641nm和532nm處連續(xù)測定6次，6次實驗結(jié)果的RSD值分別為0.0037%和0.00056%，說明儀器的精密度良好。11.3穩(wěn)定性試驗：在60min內(nèi)每間隔10min測定1次，結(jié)果顯示在30min內(nèi)穩(wěn)定性良好。11.4重復(fù)性試驗：同一樣品的直鏈淀粉和支鏈淀粉平行實驗結(jié)果的RSD值分別為0.012%和0.0027%，說明重復(fù)性良好。11.5準確度試驗：通過對同一高粱樣品添加不同濃度的直鏈淀粉和支鏈淀粉標準溶液并進行測定，直鏈淀粉的加標回收率為95～100%左右，而支鏈淀粉的加標回收率在86～103%之間，說明準確度良好。11.6通過以上試驗結(jié)果說