陳洪惠-2015-6-4修改版

學(xué)校代碼：10904學(xué)校代碼：10904雙水相萃取蚓激酶的初步研究姓名：陳洪惠學(xué)號(hào)：201107140402指導(dǎo)教師：王飛：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)：制藥工程完成日期：2015年6月5日雙水相萃取蚓激酶的初步研究姓名：陳洪惠學(xué)號(hào)：201107140402指導(dǎo)教師：王飛：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)：制藥工程完成日期：2015年6月5日摘要為彌補(bǔ)蚓激酶現(xiàn)有提取方法的不足，本實(shí)驗(yàn)采用聚乙二醇-硫酸銨組成的雙水相體系對(duì)蚓激酶進(jìn)行分離純化，并運(yùn)用TAME底物法測(cè)定其效價(jià)。以蚓激酶的效價(jià)為考察指標(biāo)，探討聚乙二醇的分子量、聚乙二醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)雙水相萃取蚓激酶的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化萃取條件。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)蚓激酶的萃取影響最大，在聚乙二醇分子量為6000、聚乙二醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)組成的雙水相體系，對(duì)所分離得到的蚓激酶效價(jià)較高，提取的蚓激酶活力達(dá)12.23U/mg。結(jié)果表明，該雙水相體系用于蚓激酶分離純化具有良好的選擇性，而且保持了較高的活性。關(guān)鍵詞：雙水相；萃取；蚓激酶；正交試驗(yàn)AbstractInordertoremedythedeficiencyofLumbrokinaseextractionmethod,separationofLumbrokinasedirectlyfromearthwornhomogenateinaqueoustwo-phasesystems(ATPS)ofpolyethyleneglycol-ammoniumsulfatewasstudied.Theeffectsofpolyethyleneglycolmolecularweight,(NH4)2SO4concentrationontheextractionwereinvestigatedintermsoftiter.OrthogonalexperimentwasusedtofurtheranalyzeandoptimizetheseparationofLumbrokinase.Theresultsindicatedthatthecontrolofpolyethyleneglycolmolecularweighthadthegreatestinfluence.Thepolyethyleneglycolmolecularweightwas6000,polyethyleneglycolconcentrationwas16%,18%sodiumsulfateconcentrationofaqueoustwo-phasesystemcanobtainhighLumbrokinasetiter.TheseparationwassuccessfulwiththeLumbrokinaseactivityof12.23U/mg.Testshowedthatpolyethyleneglycol-ammoniumsulfateaqueoustwo-phasesystemforseparationLumbrokinasefromtheearthwormprovidesanewextractionmethod,rsultsshowedthattheaqueouswaterphasesystemusedinLumbrokinasepurificationhasgoodselectivity,andkepthighactivity.KeyWords:Aqueoustwophase;Extraction;Lumbrokinase;Orthogonalexperiment目錄TOC\o"1-3"\h\u31509第1章引言 ③高錳酸鉀，操作時(shí)盡量避免高錳酸鉀溶液粘附在試管的口、壁，如果粘附，可以用亞硫酸鈉溶液將粘附的高錳酸鉀溶液蕩洗下來(lái)；亞硫酸鈉溶液必須臨用前配制，以保證亞硫酸鈉溶液的還原能力。研究證明，蚓激酶的分離純化還可以采用超濾、硫酸銨鹽析和分子篩、離子交換層析、柱層析分離[23-26]等方法對(duì)蚓激酶的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，也可以將分離純化的蚓激酶制成凍干粉或者凍干粉針劑[27-29]。參考文獻(xiàn)[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.113-114.[2]WS1-(X-052)-2001Z-2010,國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)-蚓激酶[S].北京:國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局,2010.[3]滕文嬌,孫晉民.蚓激酶的藥學(xué)與臨床研究進(jìn)展[J].西北藥學(xué)雜志,2011,26(1):69-72.[4]周海,王春維,張怡,等.蚓激酶的提取純化及性質(zhì)研究[J].中國(guó)生化藥物雜志,2011,32(3):212-216.[5]從玉文,劉耀明,陳家佩,等.蚓激酶的研究進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志,2000,21(3):159-162.[6]劉美艷,張雙全,張健,等.蚯蚓纖溶酶的純化及pH值、溫度和胰蛋白酶對(duì)其纖溶活性的影響[J].中國(guó)生化藥物雜志,2003,24(4):167-170.[7]王雪英,伍曉斌,徐鳳彩,等.蚯蚓纖溶酶的分離純化及其部分酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].藥物生物技術(shù),2003,10(2):88-91.[8]陳曉玲.蚓激酶的分離純化及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞作用的研究[D].重慶大學(xué),2006.[9]譚志堅(jiān).雙水相萃取體系在分離純化蘆薈活性成分中的應(yīng)用研究[博士學(xué)位論文].湖南:中南大學(xué),2013.[10]劉楊,王雪青,龐廣昌.雙水相萃取法富集分離螺旋藻藻藍(lán)蛋白的研究[J].海洋科學(xué),2008,32(7):30-32,37.[11]郭輝,張中玉,羅宇倩.雙水相萃取法分離竹葉黃酮的工藝研究[J].氨基酸和生物資源,2012,34(2):24-28.[12]趙云燦,薛學(xué)東,趙波.頭孢菌素C的新型雙水相萃取[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,2012.43(5):337-339,371-371.[13]王碧,阮尚全,覃松,等.聚乙二醇-硫酸銨體系雙水相萃取光度法測(cè)定鈀[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003,40(1):108-111.[14]李劍梅,苗玉琨,李鑫,等.TAME法對(duì)康脂口服液中蚓激酶單位效價(jià)的測(cè)定[J].微生物學(xué)雜志,2001,21(3):61-62.[15]周海,王春維,張怡.蚓激酶的提取純化及性質(zhì)研究[J].中國(guó)生化藥物雜志,2011,32(3):212-216.[16]王瑋.蚓激酶導(dǎo)向溶栓給藥系統(tǒng)的研究[博士學(xué)位論文].四川:四川大學(xué),2003.[17]胡靜.納豆激酶的活性測(cè)定[J].海峽藥學(xué),2013,25(5):47-48.[18]焦連慶,于敏,黃青,等.TAME法測(cè)定金龍消栓合劑中蚓激酶單位效價(jià)[J].中草藥,2000,31(4):267-268.[19]王瑋,尹宗寧,李銅鈴,等.蚓激酶白蛋白納米粒中的酶活力測(cè)定[J].中國(guó)新藥雜志,2005,14(8):1019-1021.[20]沙琦,鄒愛(ài)峰.正交試驗(yàn)優(yōu)化鹽酸莫西沙星的合成工藝[J].中國(guó)抗生素雜志,2013,38(8):598-600.[21]周紅航,王維香.聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系萃取豬胰蛋白酶[J].化工進(jìn)展,2009,28(2):305-308,315.[22]孫晨,張海明.聚乙二醇/硫酸銨雙水相萃取甘草酸鉀[C].//中國(guó)化學(xué)會(huì)第十二屆全國(guó)應(yīng)用化學(xué)年會(huì)論文集.2011:30-33.[23]天津賈立明蚯蚓養(yǎng)殖有限公司.一種從蚯蚓中提取高活性蚓激酶的方法:中國(guó),CN201310338922.9[P].2015-2-11.[24]王高鋒.蚓激酶提取工藝以及酶學(xué)性質(zhì)研究[D].華南師范大學(xué),2010.[25]華南師范大學(xué).一種高活性蚓激酶的制備方法:中國(guó),CN201110103216.7[P].2011-11-16.[26]青島國(guó)大藥業(yè)有限公司.一種蚓激酶的制備工藝:中國(guó),CN200910231486.9[P].2010-6-30.[27]寧夏金豐源實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司.高活性蚓激酶干粉的制備方法:中國(guó),CN02129969.2[P].2003-4-30.[28]楊寶峰,哈爾濱九信科技實(shí)業(yè)有限公司,陳遠(yuǎn)聰.注射用地龍凍干粉針劑及其制作法:中國(guó),CN03111000.2[P].2004-8-18.[29]北京百奧藥業(yè)有限責(zé)任公司.蚓激酶干粉的制備方法:中國(guó),CN200410039186.8[P].2005-8-24.致謝本文是在王飛老師精心指導(dǎo)和大力支持下完成的，從畢業(yè)論文的選題、方案的確定與實(shí)施，以至實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行、論文的撰寫與修改，無(wú)不傾注王老師的心血與汗水。在此，對(duì)我的導(dǎo)師——王飛老師表示由衷的感謝。王飛老師嚴(yán)格要求學(xué)生，他淵博的知識(shí)、開(kāi)闊的視野、大膽的創(chuàng)新精神和敏銳的