(完整word版)細(xì)菌的生理生化鑒定方法

(完整(完整word版)細(xì)菌的生理生化鑒定方法方法2.3。5細(xì)菌的生理生化鑒定1、形態(tài)學(xué)觀察采用插片法、埋片法,對(duì)該拮抗細(xì)菌的菌落形態(tài)特征作鏡檢觀察。用革蘭氏染色進(jìn)行油鏡觀察。革蘭氏染色溶液和試劑：革蘭氏染液，草酸銨結(jié)晶紫染液，盧戈式碘液，95％乙醇，番紅復(fù)染液等.試驗(yàn)步驟：(1)涂片：取活躍生長(zhǎng)期菌種按常規(guī)方法涂片(不易過(guò)厚)、干燥和固定。初染：滴加草酸銨結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位1?2min,用水沖洗至流出水無(wú)色。媒染：先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋Imin,傾去碘液，水洗至流出水無(wú)色。脫色：在上述涂片上流加95%乙醇溶液(一般20~30s)，當(dāng)脫色至流出液無(wú)色時(shí)立即用水洗去乙醇。復(fù)染：將玻片上殘留水用吸水紙吸去，用番紅復(fù)染液染色2min,水洗，用吸水紙吸去殘水晾干。鏡檢：用油鏡觀察。芽孢染色制片:按常規(guī)方法涂片、干燥及固定。加熱染色：向載玻片滴加數(shù)滴5%孔雀綠水溶液覆蓋涂菌部位，用夾子夾住載玻片在微火上加熱至染液冒蒸汽并維持5min,加熱時(shí)應(yīng)注意補(bǔ)充染液，切勿讓涂片干涸.脫色：待玻片冷卻后，用緩流自來(lái)水沖洗至流出水無(wú)色.復(fù)染：用0.5%番紅水溶液復(fù)染2min。水洗:用緩流自來(lái)水沖洗至無(wú)色。鏡檢：晾干載玻片后油鏡鏡檢。鞭毛染色（硝酸銀染色法）（1）載玻片準(zhǔn)備:將載玻片置于含洗衣粉或洗滌劑的水中煮沸20min,然后用清水充分洗凈,再置于95%乙醇中浸泡，使用時(shí)取出在火焰上燒去乙醇及可能殘留的油跡。（2）菌液制備：用接種環(huán)挑取菌落邊緣菌體，懸浮于1?2mL無(wú)菌水中制成菌懸液，不能劇烈震蕩。（3）制片:取一滴菌懸液滴到載玻片一側(cè)，傾斜玻片,使菌懸液流向另一邊,用吸水紙吸取多余的菌懸液,自然干燥。（4）染色：滴加硝酸銀染色A液覆蓋3?5min，用蒸餾水充分洗去A液，再滴加B液染色約1min,期間可用微火加熱，當(dāng)涂面出現(xiàn)明顯褐色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗。自然干燥后用油鏡觀察。菌體呈深褐色,鞭毛顯褐色。（5）鏡檢：用油鏡鏡檢觀察。A、B液需現(xiàn)用現(xiàn)配（4h內(nèi)效果最佳，1d內(nèi)可用）：A：?jiǎn)螌幩?g,三氯化鐵1.5g，蒸餾水100mL，加1%氫氧化鈉1mL，15%甲醛2mL.B：硝酸銀粉末2g,水100mL，溶解勻均，取出10mL回滴用，往90mL溶液中加濃氨水到出現(xiàn)大量沉淀時(shí)再加濃氨水至溶液澄清。加10mL回滴液回滴至出現(xiàn)薄霧。2、糖類分解試驗(yàn)配方：蛋白胨1。0g;NaCI0。5g;0。2%溴百里香酚蘭1。2mL;葡萄糖1.0g;蒸餾水100mL。基本原理：糖類分解實(shí)驗(yàn)是常用的鑒別微生物的生化反應(yīng)，鑒定細(xì)菌能否利用分解某種糖產(chǎn)生有機(jī)酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氨氣、甲烷、二氧化碳等）。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸是，指示劑可有紫色（pH6。8）轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色（pH5。2）.氣體的產(chǎn)生可由倒置的小管中有無(wú)氣泡來(lái)證明。試驗(yàn)步驟:用記號(hào)筆在試管外面分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱和所接種的細(xì)菌的編號(hào)。取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管，按編號(hào)接種細(xì)菌，每種細(xì)菌做兩個(gè)平行,可留一個(gè)空白，作為對(duì)照。在接種后要輕搖試管，防止倒置的小試管進(jìn)入氣泡.再將將上述已接種的和對(duì)照管置37°C溫室中培養(yǎng)2?3d。觀察顏色變化及小試管中有無(wú)氣泡。3、V—P試驗(yàn)配方：蛋白胨1.5g;葡萄糖1。5g;KHP01。5g;蒸餾水300mL；pH：7。424基本原理：此實(shí)驗(yàn)也是常用的檢驗(yàn)細(xì)菌的生化反應(yīng)之一。某些細(xì)菌能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再縮合，脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強(qiáng)堿環(huán)境再被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基生成紅色化合物，稱V—P反應(yīng)。試驗(yàn)步驟：將被檢菌接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2?7d后，于培養(yǎng)物中加入1mL10%的

NaOH，混勻，再加入3?4滴2%氯化鐵溶液.數(shù)小時(shí)后，培養(yǎng)基表面的下層出現(xiàn)紅色者，為陽(yáng)性.4、甲基紅試驗(yàn)配方：與V-P試驗(yàn)的配方相同基本原理：某些細(xì)菌在糖代謝過(guò)程中，會(huì)分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸還可進(jìn)一步分解，產(chǎn)生甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基pH將至4。5以下，當(dāng)加入甲基紅試劑則呈紅色，為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性。若細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸量小，或者產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)（如醇、酮、醚、氣體和水等），則培養(yǎng)基的酸度仍會(huì)在pH6。2以上，故加入甲基紅指示劑呈黃色，為陰性。試驗(yàn)步驟:接種細(xì)菌于培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)2~7d后，于培養(yǎng)物中加入幾滴甲基紅酒精溶液（0。1g甲基經(jīng)溶于300mL95%乙醇中，加蒸餾水至500mL）,如呈紅色，表示陽(yáng)性.5、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)配方：檸檬酸鈉1g;硫酸鎂0.2g；NaCI5g;NHHPO1g;KHPO1g;瓊脂20g；1%溴42424麝香草酚藍(lán)酒精溶液10mL;蒸餾水1000mL?；驹恚簷幟仕猁}試驗(yàn)是用來(lái)檢測(cè)檸檬酸鹽能否被利用。細(xì)菌在分解檸檬酸鹽及培養(yǎng)基中的磷酸銨后，產(chǎn)生堿性化合物，是培養(yǎng)基的pH升高，當(dāng)加入1%溴麝香草酚藍(lán)指示劑時(shí)，培養(yǎng)基就會(huì)有綠色轉(zhuǎn)變?yōu)樯钏{(lán)色。溴麝香草酚藍(lán)的指示范圍為：pH小于6。0時(shí)呈黃色，pH在6。5?7.0時(shí)為綠色，pH大于7.6時(shí)呈藍(lán)色。試驗(yàn)步驟：將被檢菌接種到Simmons固體檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，37°C下培養(yǎng)2?4d，能利用檸檬酸（完整word版）細(xì)菌的生理生化鑒定方法鹽的細(xì)菌表現(xiàn)為有細(xì)菌生長(zhǎng),培養(yǎng)基變?yōu)樗{(lán)色，不能利用檸檬酸鹽的細(xì)菌不生長(zhǎng)，培養(yǎng)基不變色。6、硝酸鹽還原試驗(yàn)配方：硝酸鉀0。2g；蛋白胨5g;蒸餾水1000mL；pH：7。4。甲液：4-苯胺磺酸（對(duì)氨基苯磺酸）0.4g；5mol/L冰醋酸50mL。乙液：a—萘胺0。25g;5mol/L冰醋酸50mL.基本原理：某些細(xì)菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用，生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的4-苯胺磺酸作用生成重氮基苯磺酸，后者與a-萘胺結(jié)合生成N—a萘胺偶苯磺酸。試驗(yàn)步驟:將被檢細(xì)菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)1~2d,每管中先加入甲試劑0.1mL,再加乙試劑數(shù)滴，如出現(xiàn)紅色，表示陽(yáng)性。注：本試驗(yàn)陰性的原因有三：細(xì)菌不能還原硝酸鹽；亞硝酸鹽繼續(xù)分解，生成氨和氮；培養(yǎng)基不適于細(xì)菌的生長(zhǎng)。如欲檢查培養(yǎng)基中硝酸鹽是否未被分解，可再加入鋅粉少許，可使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽而呈現(xiàn)紅色。7、淀粉水解試驗(yàn)配方：牛肉膏0°5g;蛋白胨1g;氯化鈉0°5g;可溶性淀粉0°2g；蒸餾水100mL；瓊脂2g；pH：7.0?7.2。基本原理：有些細(xì)菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解為麥芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再變藍(lán)色?試驗(yàn)步驟：將細(xì)菌劃線接種于平板上，37C左右培養(yǎng)1?2d,生長(zhǎng)后取出，在菌落處滴加革蘭氏碘液少許，能水許解淀粉的細(xì)菌菌落周圍有透明環(huán)，培養(yǎng)基會(huì)呈深藍(lán)色。8、吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)配方：蛋白胨1g；NaCI0.5g;蒸餾水1000mL；pH：7.6。吲哚試劑自行配制：對(duì)二甲基氨基苯甲醛0。5g；乙醇（95%）47。5mL;濃鹽酸10mL.基本原理：有些細(xì)菌可以產(chǎn)生色氨酸酶，分解色氨酸，產(chǎn)生吲哚和丙酮酸。吲哚與二甲基氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色的玫瑰吲哚，因此可根據(jù)細(xì)菌能否分解色氨酸產(chǎn)生吲哚來(lái)鑒定菌種.（完整word版）細(xì)菌的生理生化鑒定方法試驗(yàn)步驟:將待檢菌種接種于鄧享氏蛋白質(zhì)的胨溶液中，37°C培養(yǎng)1?2d.于培養(yǎng)液中加入戊醇或二甲苯2?3mL,搖勻，靜置片刻后，沿管壁加入吲哚試劑2ml,如出現(xiàn)紅色沉淀，表示為陽(yáng)性。9、接觸酶試驗(yàn)配方:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基基本原理：具有過(guò)氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過(guò)氧化氫生成水和新生態(tài)氧，繼而形成分子氧出現(xiàn)氣泡。試驗(yàn)步驟：將1ml3%的HO傾注于生長(zhǎng)物（菌落或菌苔）上，有氣泡（0）發(fā)生者為陽(yáng)222性。也可于清潔小試管中加少量（30%），再用清潔無(wú)菌的細(xì)玻棒（或火焰封口的毛細(xì)管或鎳鉻做成的接種環(huán)）醮細(xì)菌少許，插入H0液面下，有氣泡者為陽(yáng)性.也可在玻片上滴一滴H02222蘸取少許培養(yǎng)物，混合，有氣泡者為陽(yáng)性.2.3.6確定菌種類型參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（Buchanan＆Gibbons，1984）和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，1999）確定菌種類型。結(jié)果3.3菌株的生理生化鑒定3.3。1菌落的特征分析通過(guò)顯微鏡觀察菌落形態(tài)特征，結(jié)果見表3。表3拮抗細(xì)菌K1、K2與K3的菌落特征菌株K1K2K3形狀橢圓狀圓形桿狀革蘭氏染色陰性陰性陰性芽孢無(wú)無(wú)無(wú)菌落形態(tài)橢圓形圓形梅花形菌落顏色乳白淺黃棕黃菌落隆起度凸起凸起凸起（完整（完整word版）細(xì)菌的生理生化鑒定方法菌落邊緣形狀光滑光滑粗糙菌落表面狀態(tài)光滑光滑光滑菌落光澤有光澤有光澤無(wú)光澤菌落干濕程度干燥濕潤(rùn)干燥菌落透明程度不透明不透明不透明3。3.2菌株的生理生化鑒定糖類分解試驗(yàn)K11K22K3111V-P試驗(yàn)KMK2?K3|甲基紅試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)K1糖類分解試驗(yàn)K11K22K3111V-P試驗(yàn)KMK2?K3|甲基紅試驗(yàn)淀粉水解試驗(yàn)K1『K2.K3?吲哚（靛基質(zhì)）試驗(yàn)檸檬酸鹽利用試驗(yàn)接觸酶試驗(yàn)圖3拮抗細(xì)菌K1、K2與K3的生理生化特征表4細(xì)菌的生理生化鑒定結(jié)果

菌種K1K2K3糖類分解試驗(yàn)+－+V