標準 DB37T 3673-2019 牡蠣皰疹病毒制型檢測技術(shù)規(guī)范 巢式PCR法規(guī)范

1、ICS FORMTEXT 11.220 FORMTEXT B 41 FORMTEXT DB FORMTEXT 37DB FORMTEXT 37/T 36732019 FORMTEXT FORMTEXT 牡蠣皰疹病毒型檢測技術(shù)規(guī)范巢式PCR法 FORMTEXT Ostreid herpesvirus-1 Detection Specification- Nested PCR2019 - 08 - 30發(fā)布2019 - 09 - 30實施 FORMTEXT 山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB37/T 36732019 HYPERLINK l _Toc7179859 前言 PAGEREF _Toc7179

2、859 h II HYPERLINK l _Toc7179860 1 范圍 PAGEREF _Toc7179860 h 1 HYPERLINK l _Toc7179861 2 規(guī)范性引用文件 PAGEREF _Toc7179861 h 1 HYPERLINK l _Toc7179862 3 術(shù)語和縮略語 PAGEREF _Toc7179862 h 1 HYPERLINK l _Toc7179863 3.1 術(shù)語和定義 PAGEREF _Toc7179863 h 1 HYPERLINK l _Toc7179864 3.2 縮略語 PAGEREF _Toc7179864 h 1 HYPERLINK

3、 l _Toc7179865 4 試劑及儀器 PAGEREF _Toc7179865 h 1 HYPERLINK l _Toc7179866 4.1 試劑 PAGEREF _Toc7179866 h 2 HYPERLINK l _Toc7179867 4.2 儀器 PAGEREF _Toc7179867 h 2 HYPERLINK l _Toc7179868 5 采樣 PAGEREF _Toc7179868 h 3 HYPERLINK l _Toc7179869 5.1 采樣對象 PAGEREF _Toc7179869 h 3 HYPERLINK l _Toc7179870 5.2 采樣數(shù)量、

4、方法和保存運輸 PAGEREF _Toc7179870 h 3 HYPERLINK l _Toc7179871 5.3 樣品的采集 PAGEREF _Toc7179871 h 3 HYPERLINK l _Toc7179872 6 檢測 PAGEREF _Toc7179872 h 3 HYPERLINK l _Toc7179873 6.1 DNA的提取 PAGEREF _Toc7179873 h 3 HYPERLINK l _Toc7179874 6.2 巢式PCR操作步驟 PAGEREF _Toc7179874 h 3 HYPERLINK l _Toc7179875 6.3 電泳及測序 PA

5、GEREF _Toc7179875 h 4 HYPERLINK l _Toc7179876 7 結(jié)果 PAGEREF _Toc7179876 h 4 HYPERLINK l _Toc7179877 7.1 結(jié)果判定 PAGEREF _Toc7179877 h 4 HYPERLINK l _Toc7179878 7.2 結(jié)果表述 PAGEREF _Toc7179878 h 4 HYPERLINK l _Toc7179879 附錄A （規(guī)范性附錄） 試劑及配制方法 PAGEREF _Toc7179879 h 5 HYPERLINK l _Toc7179880 附錄B （資料性附錄） 檢測目的片段的

6、DNA序列及電泳圖 PAGEREF _Toc7179880 h 7前言本標準按照GB/T 1.12009給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標準由山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并監(jiān)督實施。本標準由山東省漁業(yè)標準化技術(shù)委員會(魯TC 03)歸口。本標準起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、濟寧濱陽生物科技股份有限公司、泰安益海生物科技有限公司、泰安智博生物科技有限公司、南京根洋生物科技有限公司、南京少伯生物科技有限公司、南京福海生物科技有限公司。本標準起草人：王雪鵬、丁雷、閆現(xiàn)廣、王方鵬、郭志明、孫永燦、付天增、姜衡、黃金菁。牡蠣皰疹病毒型檢測技術(shù)規(guī)范巢式PC

7、R法范圍本標準規(guī)定了牡蠣皰疹病毒型（Ostreid herpesvirus-1，OsHV-1）的巢式PCR檢測方法，適用于對貝類樣品進行皰疹病毒型帶毒情況的定性檢測，以進行牡蠣皰疹病毒型的流行病學(xué)調(diào)查、診斷、檢疫和監(jiān)測。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法SC/T 7205.1牡蠣包納米蟲病診斷規(guī)程術(shù)語和縮略語術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。牡蠣皰疹病毒型牡蠣皰疹病毒型屬于軟體動物皰疹病毒科（Malacohe

8、rpesviridae）、牡蠣皰疹病毒屬（Ostreavirus），是一種雙鏈DNA病毒，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，主要危害牡蠣、扇貝和魁蚶等多種雙殼貝類，對貝類養(yǎng)殖業(yè)造成重大的損害。縮略語下列縮略語適用于本文件。bp：堿基對（base pair）dNTPs：脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）EB：溴化乙啶（ethidium bromide）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid）PCR：聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase cha

9、in reaction）Taq：水生棲熱菌（thermus aquaticus）TE：Tris鹽酸和EDTA緩沖液（EDTA TrisHCl）Tris：三羥甲基氨基甲烷（tris hydroxymethyl aminomethane）試劑及儀器試劑除非另有說明，實驗用水均為GB/T 6682規(guī)定的三級水或相當純度的水。無水乙醇：分析純。TE緩沖液按附錄A.1的規(guī)定。抽提緩沖液按附錄A.2的規(guī)定。蛋白酶K按附錄A.3的規(guī)定。10 mol/L乙酸銨按附錄A.4的規(guī)定。Tirs飽和酚（pH7.8）：分析純。4.1.8 酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)：分析純。4.1.9 氯仿/異戊醇(24:1)：

10、分析純。50TAE：見附錄A.5，也可以直接購買市售產(chǎn)品。1TAE：見附錄A.5。70 %乙醇按附錄A.6的規(guī)定。dNTP（各2.5 mmol/L）：生化試劑，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5 mmol/L的混合物，-20 保存，用于PCR。10PCR反應(yīng)緩沖液：見附錄A.7，也可以直接購買市售產(chǎn)品。MgCl2 (25 mmol/L)：生化試劑，-20 保存。Taq DNA聚合酶(5 U/L)：生化試劑，-20 保存。外引物CF：5-ATTACCCAGATTCCCCTC-3，-20 保存。外引物CR：5-CCACAAATGTAAACTGTGAC-3，-20 保存。內(nèi)引物C3：5

11、-GTGTTCTATACCATACGACCTACA-3，-20 保存。內(nèi)引物C2：5-TTGCGTTCCGTGACTTCT-3-20 保存。PCR檢測陽性對照：已知受牡蠣皰疹病毒型感染的貝類組織樣品，-80 保存。PCR檢測陰性對照：已知未受牡蠣皰疹病毒型感染的貝類組織樣品，-80 保存。PCR檢測空白對照以滅菌雙蒸水作模板。瓊脂糖：分析純。見附錄A.8。6Loading Buffer：附錄A.9，也可以直接購買市售產(chǎn)品。DNA分子量標準。溴化乙錠（EB）：分析純，10 mg/mL，見A.10，或其他等效產(chǎn)品。儀器離心機。PCR儀。電泳儀。水平電泳槽。凝膠成像系統(tǒng)或紫外儀。多功能振蕩器。水浴鍋

12、或金屬浴。-20 普通冰箱。80 超低溫冰箱。微波爐電爐或其他加熱設(shè)備。微量移液器：量程0.5 L1 000 L。采樣采樣對象牡蠣、扇貝和魁蚶等易感雙殼貝類。采樣數(shù)量、方法和保存運輸采樣數(shù)量、方法和保存運輸應(yīng)符合SC/T 7205.1的要求。樣品的采集稚貝（附著后2 mm）和幼貝（2 mm3 cm）取內(nèi)臟團；成貝（3 cm）取外套膜和斧足。樣品采集后分別置于1.5 mL離心管中，立即進行DNA提取操作或暫時保存于-20 。檢測DNA的提取取30 mg50 mg組織樣品，加入抽提緩沖液500 L，充分研磨，37 溫浴1 h。提取過程同時設(shè)置陽性對照、陰性對照、空白對照。加入2.5 L 20 mg

13、/mL蛋白酶K，至終濃度100 g/mL，混勻后置于50 水浴3 h，不時旋動。將溶液冷卻至室溫，加入等體積平衡酚，顛倒混合10 min，于10 000 r/min離心3 min分離兩相。水相移至新1.5 mL離心管中，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，顛倒混合10 min，于10 000 r/min離心1 min分離兩相。水相移至一新1.5 mL離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:1)，顛倒混合10 min，于10 000 r/min離心1 min分離兩相。水相移至一新1.5 mL離心管中，加入100 L 10 mol/L乙酸銨，混勻后，再加入兩倍體積預(yù)冷無水乙醇(-20 )

14、混勻，-20 放置2 h。10 000 r/min離心10 min，棄上清。用70 %乙醇洗滌沉淀2次，每次10 000 r/min離心5 min，傾去上清，沉淀于室溫晾干。加入100 L滅菌雙蒸水溶解DNA。若DNA樣品需要保存，可溶解于100 L TE緩沖液中并保存于-20 ?？梢圆捎猛瘸樘嵝Ч钠渌椒ɑ蚴褂蒙唐坊疍NA抽提試劑盒。巢式PCR操作步驟第一步反應(yīng)體系及反應(yīng)擴增程序PCR反應(yīng)體系如表1所示（25 L反應(yīng)體系）。陽性樣品：牡蠣皰疹病毒型DNA；陰性樣品：健康雙殼貝類組織DNA；空白對照：超純水；檢測樣品：待檢測樣品組織DNA。PCR反應(yīng)條件為：94 預(yù)變性5 min；94 變

15、性30 sec、46 退火30 sec、72 延伸1 min，32個循環(huán)；72 延伸10 min，4 保溫。25 L反應(yīng)體系所加試劑名稱濃度體積PCR反應(yīng)緩沖液10.02.5 L表125 L反應(yīng)體系所加試劑（續(xù)）名稱濃度體積dNTPs2.5 mM2.0 LCF25.0M0.5 LCR25.0M0.5 LTaq DNA 聚合酶5.0 U/L0.5 L基因組DNA100.0 ng/L1.0 L超純水18.0 L合計25.0 L第二步反應(yīng)體系及反應(yīng)擴增程序取6.2.1中PCR擴增產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，以內(nèi)引物C3、C2為引物進行PCR擴增，反應(yīng)體系成分同第一步擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為：94 預(yù)

16、變性5 min；94 變性30 sec、48 退火30 sec、72 延伸35 sec，32個循環(huán)；72 延伸10 min，4 保溫。電泳及測序配制1.5 %的瓊脂糖凝膠，加入10 mg/mL EB 至終濃度0.5 g/mL，搖勻。制備瓊脂糖凝膠。將5 L PCR反應(yīng)產(chǎn)物與1 L 6載樣緩沖液混勻后加入到加樣孔中。同時設(shè)立DNA分子量標準對照。在1 V/cm5 V/cm的電壓下電泳，使DNA由負極向正極移動。當載樣緩沖液中的溴酚藍指示劑的色帶遷移至瓊脂糖凝膠的1/2 2/3處時停止電泳，將凝膠置于紫外觀察儀或凝膠成像儀下觀察或拍照。如果觀察到結(jié)果陽性，對PCR擴增產(chǎn)物進行測序。結(jié)果結(jié)果判定陽性

17、對照在657 bp處出現(xiàn)條帶，陰性對照在657 bp處不出現(xiàn)條帶，空白對照不出現(xiàn)任何條帶，判斷為本批檢測結(jié)果可靠（如圖1所示）。陽性對照未在657 bp處出現(xiàn)條帶，或陰性對照在657 bp處出現(xiàn)條帶，判斷為本批檢測失敗，需查找原因，重新取樣檢測。檢測樣品在657 bp處有條帶，測序結(jié)果同參考序列（參見附錄B）進行比較，若序列符合可判斷待測樣品為牡蠣皰疹病毒型PCR陽性；當檢測樣本無條帶或條帶大小與陽性對照的擴增條帶大小不一致，報告結(jié)果為陰性。結(jié)果表述陽性結(jié)果報告為該貝類樣本中存在牡蠣皰疹病毒型DNA。陰性結(jié)果報告為該貝類樣本中不存在牡蠣皰疹病毒型DNA。（規(guī)范性附錄）試劑及配制方法TE緩沖液(

18、pH8.0)1 mol/L TrisHCl(pH8.0)10 mL0.5 mol/L EDTA (pH8.0)2 mL加水定容至 1 000 mL高壓蒸氣滅菌，4 貯存。抽提緩沖液1 mol/L TrisHCl(pH8.0)1 mL0.5 mol/L EDTA(pH8.0)20 mL1 mg/mL 胰RNA酶2 mL10 % SDS5 mL加水定容至 100 mL混勻，室溫貯存。20 mg/mL 蛋白酶K蛋白酶K20 mg水 1 mL溶解后分裝于無菌離心管中(0.25 mL/管)，20 下保存。10 mol/L 乙酸銨乙酸銨77 g水30 mL加水定容至100 mL，經(jīng)0.45 m濾膜過濾除菌

19、。4 貯存。50和1 TAE緩沖液50 配制方法：稱取242 g Tris堿、37.2 g Na2EDTA2H2O 于錐形瓶中，然后加入800 ml去離子水充分攪拌溶解，再加入57.1 mL冰醋酸，充分混勻后定容至1 L，室溫保存。1 TAE緩沖液：取100 mL 50TAE緩沖液，加900 mL去離子水混勻，室溫保存。70 %乙醇無水乙醇70 mL加水30 mL，混勻，定容至100 mL分裝后，室溫貯存。10PCR反應(yīng)緩沖液10PCR反應(yīng)緩沖液配制方法：稱取Tris-HCl 31.52 mg，置于15 ml塑料離心管中，向離心管中6 ml去離子水，充分攪拌溶解。加入KCl 74.55 mg，

20、加入MgCl2 2.86 mg，充分攪拌溶解，最終用去離子水定容至10 ml，-20 冰箱保存?zhèn)溆?。瓊脂糖凝膠在電泳區(qū)用1TAE電泳緩沖液配制1.2 %的瓊脂糖凝膠，建議于三角燒瓶中配制，在電爐上或微波爐中加熱至溶液完全透明(為避免煮沸時液體外溢，膠液體積應(yīng)少于容器體積的1/4)。待溶液冷卻至60 左右，加入10 mg/mL溴化乙錠(EB)(有毒)至終濃度0.5 g/mL，搖勻。將凝膠液緩緩倒入設(shè)置好樣孔梳和防漏條/套的水平放置的凝膠船，膠液厚度0.6 cm0.8 cm。樣孔梳底部水平深入凝膠層約0.3 cm0.5 cm，并距凝膠底部0.2 cm，以免穿透。待凝膠完全凝固后，小心拔掉樣孔梳，去

21、掉防漏條/套，即可用于電泳。6Loading Buffer6Loading Buffer配制方法：稱取溴酚蘭25 mg、二甲苯腈藍FF 25 mg，置于15 ml塑料離心管中，向離心管中6 ml去離子水，充分攪拌溶解。加入3 ml甘油混勻，最終用去離子水定容至10 ml，室溫保存。10 mg/mL 溴化乙錠(EB)貯存液溴化乙錠(EB)10 mg水 1 mL磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解。室溫保存于棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中。（資料性附錄）檢測目的片段的DNA序列及電泳圖擴增目的片段的DNA序列Attacccagattcccctcgaggtagcttttgtcaagatgaaacaaaatatt

22、atgcaacgaggaaattatacgtcaacatacaacatcactgtgaatacaacggagatttgacaaggtgttctataccatacgacctacacaaacctgtttttgaaaacaggtgtgaagagaaaccaaatgtgtgttatcccaatgcactctttaccatgaagatacccaccaatgtggtaaagacggaacaatctttttctaggatatggagctgcggcgctatggatttaacgagtgccaccaaaagttgggataatgattttagaatagatgtgatgtgcggcaagatgaatggcaagatacacaatgagctattacccgaccacaaacctaacgttgtattcgattacggattaagaaaatgggttccacaatctaaaattaaaaacccacatgggggccaaggaatttaaagccccggggaaaaaagtataaataggcgcgatttgtcagtttagaatcatacccacactcaatctcgagtataccacaactgctaaattaacagcatctactactactactgaaaaatgcagcctt