叢枝菌根實(shí)驗(yàn)方案

1、 13叢枝菌根試驗(yàn)方案李曉林(1990)30 m 不能排解外界微生物及澆灌施肥等措施造成的影響 絲分別開(kāi)來(lái)，使菌絲進(jìn)入菌絲室，而將根阻擋在菌根室中，不讓二者混在一起，為深入爭(zhēng)辯菌根菌絲的生理生化特性供給的技術(shù)和方法。Glomus intraradices 44 m 117 m77 m，呈橢球形或(41 圖版I 6)Gmargarita孢子和 Ssinuosa 孢子果的萌發(fā)。雖然較前兩種孢子和孢子果的芽管數(shù)略少，但它仍很快。Gintraradices 菌絲的分枝呈垂直方向。生成的菌絲較聯(lián)孢菌絲直徑更細(xì)，對(duì)根段進(jìn)展侵染會(huì)更簡(jiǎn)潔。9cm 的培育皿底部，30 m 的尼龍網(wǎng)黏貼在有機(jī)玻璃條及培育皿壁，直

2、至培育皿上蓋，阻擋根的進(jìn)入(圖 42)。將轉(zhuǎn)移 RiTDNA GintraradicesSchenck&Smith 叢枝菌根真菌孢子，共同培育的室稱為菌根室(MC)(HC)42 培育皿中的兩M 10mL 倒入菌根室中，用于離體雙重培育叢枝菌根真菌與轉(zhuǎn)移RiTDNA 胡蘿 I-10mL NO -N3NH -N(N 的含量與M pH 4溴甲酚紫作為指示劑；倒入10mL 不含蔗糖的M 培育基，pH 55。在相應(yīng)的菌根Gintraradices M 培育基上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)移RiTDNA i-根的5cm-7cm Gintraradices 孢子直徑小，每個(gè)培育皿移進(jìn)30 個(gè)孢子。將培育皿在271的恒溫培育箱中

3、黑暗培育。菌根室中共生聯(lián)合體生長(zhǎng)狀況：Gintraradices 菌根真菌相像于Gmargarita菌根真菌， 基質(zhì)中形成了大量的養(yǎng)分孢子及成熟的孢子(圖 43)。養(yǎng)分孢子的大小為 4l m-62 m49 m67 m 93 m78 m。物質(zhì)。質(zhì)的雙向流淌有助于進(jìn)一步探究菌絲對(duì)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)淖饔抿?qū)動(dòng)力(Smith，1997)。孢子不僅是作為叢枝菌根真菌養(yǎng)分儲(chǔ)存的器官，更是一種穩(wěn)定 心法(李曉林、馮固，2023)。這些方法的共同點(diǎn)都是能夠?qū)⒕咦訌纳L(zhǎng)基質(zhì)中富積起來(lái)，但是孢子與基質(zhì)的小顆粒特別是沙粒顏色相近，不易于區(qū)分。測(cè)定叢枝菌根孢子密度方法一：常規(guī)的濕篩傾析法(Gerdemann 和 Nieol

4、son，1963)：(1) 稱取確定重量的土壤樣品，放在容器內(nèi)用水浸泡20min-30min，盡量使土壤松散。假設(shè) (2m一034 m 面略微傾斜。(3)用玻璃棒攪動(dòng)浸泡土壤的水溶液，停置幾秒鐘后，使大的石礫和雜 物篩面的一個(gè)點(diǎn)上，避開(kāi)整個(gè)篩面都沾有土壤溶液。(4)用清水依次輕輕沖洗停留在篩 面(5)將濾液通過(guò)細(xì)篩并用水沖洗。在不同直徑的孢子。(6)將含有篩出物的培育皿放在雙目實(shí)體解剖顯微鏡下觀看并計(jì)數(shù)。測(cè)定叢枝菌根孢子密度方法二：濕篩傾析染色法(簡(jiǎn)稱染色法)改進(jìn)的濕篩傾析法，前 4 步驟同方法一。(5)用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個(gè)清潔的試管內(nèi)，滴 90。C 水浴鍋或烘箱中加熱半

5、小時(shí)，進(jìn)展染色。(6)將染色后的濾液通過(guò)細(xì)篩，并沖洗篩上的濾物，可洗去染色劑，將篩出物放在清潔的培育皿里。在的孢子。(7)將含有篩出物的培育皿放在雙目實(shí)體解剖顯微鏡下觀看并計(jì)數(shù)，可觀測(cè) 到紫色孢子。兩種方法對(duì)菌根孢子的形態(tài)特性以及測(cè)定精度比較 據(jù)。孢子在土壤中主要呈無(wú)色透亮、白色、淡黃、黃棕、棕色、金黃、紅棕和黑色等顏色(李曉林、馮固，2023)，很多孢子的顏色與基質(zhì)沙土的顏色相近，在計(jì)數(shù)時(shí)不易被區(qū)分 (51 圖111)(52 圖版一2)，通過(guò)濕篩傾析法篩選出的菌根孢子或多或少帶有菌絲，菌絲同時(shí)也被染色，與四周沙粒顏色反差較大，觀測(cè)孢子形態(tài)特性比較明顯，孢子的圖51 濕篩傾析法觀測(cè)到孢子形態(tài)(

6、棕黃色)52 染色法觀測(cè)到的孢子形態(tài)(紫色) 后的孢子(紫色)比沒(méi)染色的孢子(棕黃色)易于觀測(cè)，可以明顯地提高計(jì)數(shù)工作效率。以 寧夏大武口煤矸石山接種菌根處理的沙土樣品為例 來(lái)統(tǒng)計(jì)孢子密度，10g 350 個(gè)。而利用染色法來(lái)測(cè)定一樣樣品的380 個(gè)。每個(gè)土壤樣品精度上平均提高了8，染色法較常規(guī)的濕篩傾析 為誤差，提高了孢子密度測(cè)定的精度，染色后的孢子(紫色)比沒(méi)染色的孢子(棕黃色)易 品為例，本試驗(yàn)條件下以傳統(tǒng)的濕篩傾析法來(lái)統(tǒng)計(jì)孢子密度，10g 沙土樣品孢子數(shù)平均350 380 平均提高了 8，染色法較常規(guī)的濕篩傾析法更易于識(shí)別和識(shí)別，提高了孢子密度測(cè)定的精度。(350 個(gè)孢子10g)25mi

7、n30min 1 個(gè)樣品(380 個(gè)孢子10g)1 個(gè)樣品縮(25 min-30min)，本試驗(yàn) 40 個(gè)土樣，在測(cè)定速度上節(jié)約 1000min 一 大規(guī)模樣品的孢子密度監(jiān)測(cè)供給了一種快速的方法種可行的快速測(cè)定方法。該方法與常規(guī)的濕篩傾析法相比，也存在缺乏，經(jīng)過(guò)在 90 水浴鍋或烘箱里加熱 30min 染色后的孢子失去了活力變成了死孢子，孢子不能再發(fā)芽 叢枝菌根的種類(lèi)和活性，因而不適合用于收集活孢子。55 小結(jié)(1)染色法對(duì)于陜速測(cè) 定叢枝菌根孢子密度總量是可行的，精度較高，對(duì)于大批量樣品孢子密度的測(cè)定可行。(2)染色法缺乏之處是孢子經(jīng)高溫加熱和染色，不同種或?qū)冁咦硬灰子谧R(shí)別，活孢子數(shù) 量不能

8、夠統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確。因此本方法不適合測(cè)定活性孢子密度統(tǒng)計(jì)。10-100g 10-100m1500-1000ml 水，攪拌，靜10s 后過(guò)雙層分樣篩(20 400 目)。反復(fù)沖洗待測(cè)樣品并過(guò)篩3-4 次，收集400目篩子上的殘留物于大離心管中3000min離心3min450的蔗糖，攪勻后快速放人離心機(jī)，1500rmin 15min 400 目篩，再用。菌根侵染狀況觀看與侵染率測(cè)定：(1)活體鏡檢法：將要檢查的植物冷靜器或田間輕輕 發(fā)育狀況，并可節(jié)約植株。缺點(diǎn)是并不格外準(zhǔn)確。(2)染色鏡檢法：為了準(zhǔn)確檢查菌根 發(fā)育狀況、測(cè)定侵染率，則需承受染色法。一般要經(jīng)過(guò)根系透亮染色分色過(guò)程。具體FAA 固定的根系剪成

9、長(zhǎng) 0.5-1.0cm 小段放人試管或其他染色容器，參與5-10KOH 溶液，放在9020-60min，通常草本植物的幼嫩根系透亮?xí)r間較短，而木本植物的根系則較長(zhǎng)。去掉堿液然后用自來(lái)水輕輕沖洗根系3 次，2HCl 5min。去掉酸液后參與酸性品紅(001)乳酸甘油染色液(875ml63ml63ml01g)90水浴鍋內(nèi)20-60min，或室溫下過(guò)夜?；厥杖旧嚎芍貜?fù)再用。參與乳酸分色后即可鏡檢、如用乳酸酚翠盤(pán)藍(lán)(005)染色液(300g250ml250ml300ml；翠盤(pán)藍(lán)(Trypan blue 05g)則不必參與HCl 酸化，可以直接染色，并可用水分色。植物細(xì)胞不著色(有時(shí)中柱著色)，真菌組

10、織染成紅色(酸性品紅染色)或藍(lán)色(翠盤(pán)藍(lán)染色) 用的有方格穿插法和根段頻率標(biāo)準(zhǔn)法(BiermannLindermanl981) 而準(zhǔn)確的根段頻率標(biāo)準(zhǔn)法。該方法測(cè)定的結(jié)果在確定程度上能反映出菌根侵染的程度。將經(jīng)過(guò)上述染色處理的根樣，用鑷子和挑針選擇25 條粗細(xì)全都的根段整齊地排列在干凈200 下檢查每條根段的侵染狀況，依據(jù)每段根系菌根構(gòu)造的多少按0，10，20，30， 100的侵染數(shù)量給出每條根段的侵染率。例如，沒(méi)有菌根構(gòu)造的根段其侵染率為 0， 假設(shè)100，只有一半長(zhǎng)度的根段被侵染形成菌根的則該根段的侵染率為 50，依此類(lèi)推，并記錄各侵染率下根段的條數(shù)。依以下公式即可計(jì)算該樣品菌根的侵染率。另

11、外，可利用目鏡測(cè)微尺測(cè)定單位根系長(zhǎng)度泡囊、侵入點(diǎn)的數(shù)量。對(duì)于脂膠、五色指甲油等封固后可長(zhǎng)期保存。叢枝菌根真菌的接種方法叢枝菌根真菌有多種接種方法當(dāng)?shù)慕臃N方法然而不管承受何種方法操作人員和有關(guān)器具必需在接種前進(jìn)展消毒處 理，以盡量削減污染的時(shí)機(jī)。對(duì)需要接種處理的植物種子、根系培育植物用的各種容 器和培育基質(zhì)苗床和苗圃土壤等都要消毒甚至滅菌對(duì)于大田土壤有條件的最好也進(jìn) 行消毒處理。另外，必需留意，接種劑類(lèi)型、接種物形式、劑量和接種方法的不同會(huì)直接影響(施亞琴等1993，Yineta11997)叢枝菌根真菌的接種效果一、按接種物形式區(qū)分的接種方法孢子接種法即以叢枝菌根真菌的孢子作為接種物進(jìn)展接種處理

12、是 常用的接種方法可先將孢子從菌劑中分別出來(lái)挑到濾紙上或放進(jìn)盛有生理鹽水的小 瓶中便可用來(lái)接種假設(shè)菌劑中只含有孢子可依據(jù)單位重量或單位體積孢子含量直 接參與確定重量或體積的菌劑。按孢子用量又可進(jìn)一步分為： (1)單孢接種即只挑一個(gè)孢子用來(lái)接種。通常用于菌種純化分別、分類(lèi)鑒定等爭(zhēng)辯目的事先在滅菌沙中 播種煙草等寄主植物，培育至36 片真葉，即可用于接種處理。解剖鏡下用毛細(xì)管把孢子直接放在幼苗根系上，然后將該苗定植于育苗器中，承受半水培法培育24 周后一般即有菌根侵染。(2)雙孢接種挑出兩個(gè)相像的孢子接種，類(lèi)似于單孢接，但接 種成功的時(shí)機(jī)大于單孢接種法。(3)多孢接種即選擇外部形態(tài)全都的3 個(gè)或多

13、個(gè)孢子進(jìn)展接種可以大大提高接種成功的時(shí)機(jī)但有時(shí)所接孢子可能不是來(lái)自一個(gè)種因 此，該法不宜用來(lái)菌種純化、分別鑒定等工作。但可用于生理效應(yīng)、生態(tài)等爭(zhēng)辯工作， 如一般每棵幼苗可接5001000 個(gè)孢子。2根段接種法將已充分形成菌根的根段 (侵染率達(dá)80以上，且含有較多泡囊)，剪成小碎段，可用作接種物。一般每個(gè)養(yǎng)分缽接種0205g 穎根段即可無(wú)論穎或風(fēng)干的根段均可測(cè)定出接種勢(shì)單位數(shù)量。依據(jù)需要的接種勢(shì)單位數(shù)量，換算成根段長(zhǎng)度或重量，即可接種。3培育基質(zhì)接種法 是最常用的叢枝菌根真菌的接種方法。由于用石英砂、純潔的河沙、蛭石、沙土等作培育基質(zhì)來(lái)生殖菌種。因此，這些培育基質(zhì)中含有大量孢子、菌絲、菌根根段(

14、和)孢子 果等生殖體其接種勢(shì)較大且穎的接種物優(yōu)于風(fēng)干的用此培育基質(zhì)接種物作菌劑， 侵染成功率高速度快具體操作上可依上述方法測(cè)得單位重量或體積培育基質(zhì)接種物 的接種勢(shì)單位數(shù)量一般每個(gè)養(yǎng)分缽或每盆可分別參考施用5000 或10 000 接種勢(shì)單位；對(duì)于苗圃或大田可按每m2 為5X10*一5X10接種勢(shì)單位的菌劑進(jìn)展接種。二、按接種部位區(qū)分的接種方法1對(duì)種子接種是播種時(shí)或播種前對(duì)種子進(jìn)展的接種處理。依據(jù)不同處理方式又可將其分為：種子球衣化接種法種子球衣化是生產(chǎn)上常用的 方法大體作法是將接種物粘合劑與種子一起經(jīng)過(guò)球衣機(jī)加工使種子外表包圍一層 均勻的接種劑，涼干后便可播種。此法本錢(qián)較高拌種接種法：將接種

15、劑與種子拌勻 后再播種。2對(duì)幼苗根系接種對(duì)各種來(lái)源的組培苗、脫毒苗、少于6 片真葉的生長(zhǎng)在滅菌基質(zhì)中的幼苗均可將接種劑直接放到根系上或根系四周此法菌根侵染速度 較快，假設(shè)用穎的菌劑則侵染速度會(huì)更快。3對(duì)容器接種當(dāng)前越來(lái)越多的經(jīng)濟(jì)作物承受各種容器育苗如紙質(zhì)或塑膜養(yǎng)分缽各種育苗器花盆等均常用來(lái)短期培育 或栽培植物。可將菌劑與滅菌后的培育基質(zhì)混勻裝入容器，然后播種或定植幼苗。也 可先將滅菌后的培育基質(zhì)裝入養(yǎng)分缽或育苗器中在培育基質(zhì)上挖數(shù)個(gè)將接種劑 放人穴內(nèi)或?qū)⒔臃N劑放在容器中部然后在培育基質(zhì)外表播種此法的特點(diǎn)是因容器 體積限定了根系的擴(kuò)展范圍同時(shí)由于菌劑比較集中故有利于強(qiáng)迫侵染可以培育出 優(yōu)質(zhì)菌根苗

16、，當(dāng)其侵染率達(dá)50以上時(shí)，便可移栽到苗圃或大田中4。對(duì)苗床和苗圃 接種在苗床或苗圃基質(zhì)或土壤上開(kāi)溝然后將接種劑條播到溝內(nèi)最終播種5對(duì) 大田接種開(kāi)溝后可將接種劑撒播到溝內(nèi)，然后再播種，這樣可以削減接種劑用量。如地表撒播，然后耙入土內(nèi)，接種物用量較多。國(guó)外已有用飛機(jī)撒播接種物，這在飛播造林上是常用的方法。三、其他接種方法1大田直接定植養(yǎng)分缽接種法將菌劑參與養(yǎng)分缽并播種后直接將其按確定株行距定植到大田中這樣可以省去養(yǎng)分缽育苗過(guò)程由于菌劑被限制在養(yǎng)分缽內(nèi)可以大大提高侵染速率和侵染強(qiáng)度從而增加接種菌 根真菌的效果。2。多菌混合接種法所謂多菌混合接種法是指同時(shí)將兩種或兩種以 上叢枝菌根真菌的接種劑施加到要進(jìn)展接種處理的土壤或植物上有時(shí)也指將叢枝菌 根真菌與外生菌根真菌根瘤菌解磷或解鉀細(xì)菌其他生防細(xì)菌或真菌等同時(shí)混合接 種，這是科研上針對(duì)不同試驗(yàn)?zāi)康某惺艿姆椒ā?。掩蓋作物接種法即幼齡果園一般間作花生、大豆、地瓜、三葉草、玉米、小麥等。這些間作物都適合于叢枝菌根真菌的侵染。因此在果園間作作物播種同時(shí)接種菌根，生長(zhǎng)確定階段后可增加土壤中叢 枝菌根真菌的數(shù)量削減土壤中病原物的數(shù)量從而改善建果園土壤中微生物區(qū)系組 成和土壤安康狀況作物收獲后大局部根系保存于土壤中由于這些根系都形成了