高效液相色譜儀的使用

1、色譜柱它包括空柱和填料?？罩莾?nèi)壁拋光的不銹鋼管，內(nèi)徑為45mm，長(zhǎng)10025 0mm。按氣相色譜法中洗滌空柱的方法洗凈，用勻漿法填充固定相。將此柱裝入儀器的管 路中，用柱式機(jī)械往復(fù)泵輸入新鮮脫氣的流動(dòng)相。等基線平直后可用苯、萘、菲的混合試液， 用正己烷（含0.05%甲醇）或甲醇：水（83： 17）為流動(dòng)相測(cè)定柱效及分離度塔板數(shù)在2 3萬(wàn)/ml以上及分離度在1.5以上者，柱效好。為防止柱污染，常用1個(gè)50mm長(zhǎng)，45m m內(nèi)徑，裝有硅膠（40-50mm）或立柱相同填料的保護(hù)柱（預(yù)柱）接在主柱之前，以延長(zhǎng) 色譜柱的壽命。反相鍵合相柱用畢。必須用水充分流經(jīng)，以洗去鹽類、酸堿等雜質(zhì)防止柱生 銹及填料

2、中雜質(zhì)的積聚，再用甲醇流經(jīng)洗滌使色譜柱獲得再生。流動(dòng)相的洗脫方式配好經(jīng)脫氣的流動(dòng)相放于貯液瓶中，經(jīng)過有濾過頭、內(nèi)徑2mm 的聚四氟乙烯管流入高壓泵進(jìn)入色譜柱，最后自檢測(cè)器流出或收集或作廢液回收。用流動(dòng)相 洗脫的方式有恒溶劑脫洗法（isocratic dlution），即自洗脫開始到結(jié)束，溶劑的配比恒定。 另一類為梯度洗脫法（gradicnt clution），即使溶劑的極性強(qiáng)度在色譜過程中逐漸增加。須 按一定程序不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，從而使同一個(gè)試樣中組分性質(zhì)相差較小的及較大的 都能在一次色譜過程中很好分離，而整個(gè)色譜過程縮短。必須注意，梯度洗脫法不能用于分 子排阻色譜及用電化學(xué)檢測(cè)的反相

3、高效液相色譜法中。檢測(cè)器適用于血藥濃度的檢測(cè)器有紫外線吸收，熒光發(fā)射和電化學(xué)三種。紫外檢測(cè) 器應(yīng)用于對(duì)紫外光有吸收的藥物，大多數(shù)藥物分子對(duì)紫外光有吸收，故能較普遍采用，檢測(cè) 限有0.1pg左右。紫外檢測(cè)器有固定波長(zhǎng)型、可變波長(zhǎng)型及掃描器，既能使流動(dòng)相停流作組 分的定性定量檢測(cè)，又能提高測(cè)定靈敏度，重現(xiàn)性較好。熒光發(fā)射檢測(cè)器對(duì)能產(chǎn)生熒光的藥 物才能使用。80年代應(yīng)用激光替代氙燈光源，光強(qiáng)度增加了 34倍，對(duì)某些藥物的檢測(cè)限 可達(dá)pg級(jí)。電化學(xué)檢測(cè)器是由一個(gè)碳糊或破碳做成的蒲層電解池。常用于檢測(cè)兒茶酚胺類 及有酚類基團(tuán)的各種藥物和代謝物。流出組分進(jìn)入2pl的薄層電解池，在一暄電壓下電解產(chǎn) 生電流，

4、放大后檢測(cè)，檢測(cè)限pg級(jí)。數(shù)據(jù)處理現(xiàn)代高效液相色譜儀帶有數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，除記錄譜外，還能自動(dòng)記錄峰的 保留時(shí)間，能自動(dòng)積分求算峰面積，并能按照預(yù)定的程序作有關(guān)計(jì)算，報(bào)告分析結(jié)果。1液相色譜儀系統(tǒng)液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進(jìn)樣器、柱、柱溫箱、檢測(cè)器、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成（如圖1 所示）。對(duì)于整個(gè)系統(tǒng)而言，柱子、泵和檢測(cè)器是核心部件，同時(shí)也是容易出事故的主要場(chǎng) 所。2常見問題及解決方法1針對(duì)柱壓?jiǎn)栴}（表1）柱壓?jiǎn)栴}是使用高效液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩(wěn)定與色譜圖峰形的好 壞、柱效、分離效果及保留時(shí)間等密切相關(guān)。所謂柱壓穩(wěn)定并不是指壓力值穩(wěn)定于一個(gè)恒定 值，而是指壓力波動(dòng)范圍在50PSI之

5、間。壓力過高、過低及波動(dòng)較大都屬于柱壓?jiǎn)栴}，但 柱壓的高低與色譜柱的種類、品牌、液相系統(tǒng)本身及使用的流動(dòng)相種類相聯(lián)系。值得注意的 是在使用梯度洗脫時(shí)，進(jìn)柱壓的平穩(wěn)緩慢的變化是允許的。在實(shí)際應(yīng)用中柱壓過高可從以下幾個(gè)方面來考慮1。首先考慮柱子是否被堵，此時(shí)可更換 一根新柱子進(jìn)行檢測(cè)。2針對(duì)保留時(shí)間漂移的問題2, 3（表2）保留時(shí)間的改變是很多液相色譜使用者常碰到的問題，其包括了保留時(shí)間增大和減小。它的 產(chǎn)生與很多原因有關(guān)。3針對(duì)異常色譜峰問題2-4異常的色譜峰指的是色譜圖中無(wú)峰或出現(xiàn)負(fù)峰、寬峰、雙峰、肩峰、峰形不對(duì)稱等情況。具 體情況與原因分析如表3。3高效液相色譜儀的保養(yǎng)5-71 HPLC的日

6、常操作條件工作溫度1030C；相對(duì)濕度80%；最好是恒溫、恒濕，遠(yuǎn)離高電干擾、高振動(dòng)設(shè)備。2泵的保養(yǎng)使用流動(dòng)相盡量要清潔；進(jìn)液處的沙芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動(dòng)相交換時(shí)要防止沉淀；避免 泵內(nèi)堵塞或有氣泡。3進(jìn)樣器的保養(yǎng)每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染。3. 4柱的保養(yǎng)柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)；當(dāng)柱子和色譜儀連接時(shí)，閥件或管路一定要 清洗干凈；要注意流動(dòng)相的脫氣；避免使用高粘度的溶劑作為流動(dòng)相；進(jìn)樣樣品要提純；嚴(yán) 格控制進(jìn)樣量；每天分析工作結(jié)束后，要清洗進(jìn)樣閥中殘留的樣品；每天分析測(cè)定結(jié)束后， 都要用適當(dāng)?shù)娜軇﹣砬逑粗蝗舴治鲋L(zhǎng)期不使用，應(yīng)用適當(dāng)有機(jī)溶劑保存并封閉。3. 5檢測(cè)器(UV)的保養(yǎng)紫外燈的保養(yǎng)要在分析前、柱平衡得差不多時(shí)，打開檢測(cè)器;在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測(cè) 器。同時(shí)樣品池要保養(yǎng)。4結(jié)語(yǔ)在高效液相色譜使用過程中故障排出時(shí)要遵守以下原則：一次只改變一個(gè)因素，從而確定假 定因素與問題之間的聯(lián)系;如果通過更換組件來排查故障時(shí)要注意將拆下的完好組件裝回