MTT比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)擬合、課件

1、1.MTT比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)2.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的擬合及細(xì)胞群體倍增時(shí)間的簡(jiǎn)化計(jì)算1.MTT比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。 一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過(guò)短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過(guò)長(zhǎng)短不同的遲緩期（潛伏期），即進(jìn)入大量分裂的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長(zhǎng)，進(jìn)入穩(wěn)定期，然后退化衰亡。 以存活細(xì)胞數(shù)(萬(wàn)/mL)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間(h或d)作圖，即得生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 一般而言，我們主要研究的是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的方法1.細(xì)胞計(jì)數(shù)法（簡(jiǎn)單、最常用、有誤差） （1）傳代后把細(xì)胞重懸

2、，得到細(xì)胞懸液，把懸液均勻加到24孔板中 （2）24 h后開(kāi)始進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以后每隔24 h計(jì)數(shù)一次，每次取4孔細(xì)胞，分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果取4孔的平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)6天。 （3）根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞數(shù)/mL)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 24孔板 細(xì)胞計(jì)數(shù)板2.MTT法（復(fù)雜，誤差小）原理MTT：全稱(chēng)為3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide漢語(yǔ)化學(xué)名： 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽商品名：噻唑藍(lán)，是一種黃顏色的染料。 活細(xì)胞的線(xiàn)粒體中琥珀酸脫氫酶能夠使外源性的

3、MTT還原，同時(shí)在細(xì)胞色素C 的作用下，生成不溶于水的藍(lán)色（或藍(lán)紫色）絡(luò)合物甲臜。 按照時(shí)間間隔，通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm（或570nm）波長(zhǎng)處測(cè)定甲臜 的光吸收值（A值）。 在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，因此可根據(jù)光吸收值推算出活細(xì)胞的數(shù)目。 由于死細(xì)胞中不含琥珀酸脫氫酶，因此加入 MTT 不會(huì)有反應(yīng)。 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的測(cè)定: 例如：用培養(yǎng)液將待檢細(xì)胞重懸，得到細(xì)胞懸液，按照4x104/ml細(xì)胞密度梯度 ,分別接種于 96孔板 ,每孔 100l,重復(fù) 3孔;采用 MTT法測(cè)量吸光值A(chǔ)值,同一濃度下測(cè)得的A值為該濃度下3孔的平均值。 依檢測(cè)結(jié)果 ,得到吸光值 A值與細(xì)胞濃度的對(duì)

4、應(yīng)關(guān)系，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定: 例如：用培養(yǎng)液將待檢細(xì)胞制成 1104/ml的細(xì)胞懸液;分別接種于多塊96孔板 ,每孔 100l ;在 24、 48、 72、 96及 120 h時(shí)間點(diǎn)取一塊 96孔板 ,采用 MTT法測(cè)量吸光值A(chǔ)值得到吸光值A(chǔ)值與時(shí)間的關(guān)系。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞數(shù) ,再繪出細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 2.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)擬合及細(xì)胞群體倍增時(shí)間的簡(jiǎn)化計(jì)算曲線(xiàn)擬合曲線(xiàn)擬合（curve fitting）是指選擇適當(dāng)?shù)那€(xiàn)類(lèi)型來(lái)擬合觀測(cè)數(shù)據(jù)，并用擬合的曲線(xiàn)方程分析兩變量間的關(guān)系。SPSSSPSS是世界上最早的統(tǒng)計(jì)分析軟件，由美國(guó)斯坦福大學(xué)的三位研究生Norman H. N

5、ie、C. Hadlai (Tex) Hull 和 Dale H. Bent于1968年研開(kāi)發(fā)成功，同時(shí)成立了SPSS公司，并于1975年成立法人組織、在芝加哥組建了SPSS總部。1984年SPSS總部首先推出了世界上第一個(gè)統(tǒng)計(jì)分析軟件微機(jī)版本SPSS/PC+，開(kāi)創(chuàng)了SPSS微機(jī)系列產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)方向，極大地?cái)U(kuò)充了它的應(yīng)用范圍，并使其能很快地應(yīng)用于自然科學(xué)、技術(shù)科學(xué)、社會(huì)科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。 通常地，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的函數(shù)擬合模型是但由于細(xì)胞增值是二次分裂生長(zhǎng)，所以選用 作為細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的擬合模型更為合適。又因?yàn)樵赟PSS中的曲線(xiàn)擬合功能選項(xiàng)中并沒(méi)有 的 函數(shù)擬合模型，只有于是我們可以通過(guò)變換從而能使用SPSS中的函數(shù)擬合模型進(jìn)行曲線(xiàn)擬合。原始數(shù)據(jù)曲線(xiàn)1. 培養(yǎng)天數(shù) X ln2曲線(xiàn)2.進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期天數(shù) X ln2依據(jù)以上變量進(jìn)行曲線(xiàn)擬合,記錄相應(yīng)的a,b值。2.2 細(xì)胞群體倍增時(shí)間的簡(jiǎn)化計(jì)算方法細(xì)胞群體倍增時(shí)間的計(jì)算方法有2種。1.做圖法:在細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期找出細(xì)胞增加一倍所需的時(shí)間,即倍增時(shí)間,2.公式法,按細(xì)胞倍增時(shí)間計(jì)算細(xì)胞群體倍培時(shí)間,其為公式為：（Nt為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期任一點(diǎn)的理論觀察值,N0為