植物同工酶分析技術(shù)課件

1、實(shí)驗(yàn) 8植物同工酶分析技術(shù)什么是同工酶同工酶（isozyme，isoenzyme）是指催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和免疫性能等方面都存在明顯差異的一組酶 。廣義是指生物體內(nèi)催化相同反應(yīng)而分子結(jié)構(gòu)不同的酶。按照國際生化聯(lián)合會(huì)（IUB）所屬生化命名委員會(huì)的建議，則只把其中因編碼基因不同而產(chǎn)生的多種分子結(jié)構(gòu)的酶稱為同工酶。最典型的同工酶是乳酸脫氫酶（LDH）同工酶。 同工酶的基因先轉(zhuǎn)錄成同工酶的信使核糖核酸，后者再轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生組成同工酶的肽鏈，不同的肽鏈可以不聚合的單體形式存在，也可聚合成純聚體或雜交體，從而形成同一種酶的不同結(jié)構(gòu)形式。同工酶應(yīng)用1、在生物學(xué)中，同工酶可用于研究物種進(jìn)

2、化、遺傳變異、雜交育種和個(gè)體發(fā)育、組織分化等。例如最原始的脊椎動(dòng)物七鰓鰻（Lamprey）只有一種LDH肽鏈，進(jìn)化到較高級(jí)的魚類才有A、B兩類肽鏈。又如通過對地理分布不同的物種間某一同工酶譜的普查可以推測物種的地理來源。動(dòng)、植物的遺傳變異可通過子代和親代同工酶譜的比較來鑒別。法醫(yī)學(xué)中也可用多種同工酶譜的分析來鑒定親子關(guān)系。細(xì)胞雜交或植物雜交育種后是否出現(xiàn)新品種也可用周工酶譜的比較來確定。在個(gè)體發(fā)育中，從胚胎到出生，再到成年，隨著組織的分化和發(fā)育，各種同工酶譜也有一個(gè)分化轉(zhuǎn)變的過程。某型同工酶在胚胎的大多數(shù)組織中出現(xiàn)，成為主要型式，稱為原始型同工酶。但出生后在某些組織中逐漸減少而被另一型同工酶取

3、代，后者在胚胎組織中幾乎不存在或含量極微，只在分化成熟的少數(shù)組織中存在，稱為成年型同工酶。在植物的不同發(fā)育階段，同樣可見同工酶譜的相應(yīng)改變。 2、在醫(yī)學(xué)方面，同工酶是研究癌瘤發(fā)生的重要手段，癌瘤組織的同工酶譜常發(fā)生胚胎化現(xiàn)象，即合成過多的胎兒型同工酶。如果這些變化可反映到血清中，則可利用血清同工酶譜的改變來診斷癌瘤。此外。因同工酶譜有臟器特異性，故測定血清同工酶?？奢^特異地反映某一臟器的病變，如血清的LDH1（B4）或MB型肌酸激酶（CK-MB）增加是診斷心肌梗塞較特異的指標(biāo)，較測定血清LDH或肌酸激酶（CK）總活力更為可靠。同工酶分離 同工酶分離方法主要有電泳法、層析法、酶學(xué)法和免疫學(xué)法等，

4、其中以電泳法應(yīng)用最為廣泛。其原理在于同工酶是功能相同但結(jié)構(gòu)不同的一組酶，由于其結(jié)構(gòu)中氨基酸序列或組成有差異，致使同工酶在電泳時(shí)，其遷移率也存在差異 電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個(gè)帶孔膠粒?；旌蠘悠冯娪痉较?電泳帶孔膠大分子 按分子大小分離 小分子影響電泳效果的因素1、帶電顆粒的大小和形狀：顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快；2、顆粒的電荷數(shù)：電荷越少，電泳速度越慢，反之越快；3、溶液的粘度：粘度越大，電泳速度越慢，反之越快；4、溶液的pH值：影響被分離物質(zhì)的解離度，離等電點(diǎn)越近，電泳速度越慢，反之越快； 5、電場強(qiáng)度：電場強(qiáng)度越小，電泳速度越

5、慢，反之越快；6、離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越大，電泳速度越慢，反之越快；7、電滲現(xiàn)象：電場中，液體相對于固體支持物的相對移動(dòng)；8、支持物篩孔大?。嚎讖叫?，電泳速度慢，反之則快。聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)1、聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)為丙烯酰胺單體構(gòu)成的長鏈，鏈與鏈之間通過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起；2、鏈的縱橫交錯(cuò)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具有分子篩的性質(zhì)；3、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，使凝膠具有抗對流的作用；4、長鏈富含酰胺基團(tuán)，使其成為穩(wěn)定的親水凝膠；5、該結(jié)構(gòu)不帶電荷，在電場中電滲現(xiàn)象極為微小。過氧化氫酶 過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有

6、關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。這是因?yàn)檫^氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度，而且發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過氧化物酶的活性增加，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標(biāo)。此外，過氧化物同工酶在遺傳育種中的重要作用也正在受到重視。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.通過實(shí)驗(yàn)掌握植物同工酶實(shí)驗(yàn)技術(shù)，了解植物同工酶分析在遺傳學(xué)研究中的意義2.著重掌握過氧化物酶的提取，電泳與染色技術(shù)和分析方法。 三、實(shí)驗(yàn)材料黃豆和蠶豆四、實(shí)驗(yàn)器具和藥品1、器具 電泳儀、垂直電泳槽、微量加樣 器、Tip頭、研缽、移液管、離心機(jī)。2、藥品 三羥甲基

7、氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr） 、甲叉雙丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、過硫酸銨、蔗糖、溴酚藍(lán)、聯(lián)苯胺、過氧化氫。3、電極緩沖液配制 Tris 3.0g,甘氨酸14.4g 加水至1000ml,pH8.8,使用時(shí)稀釋10倍。4、染色液配制（過氧化物酶染液） 醋酸聯(lián)苯胺溶液5毫升，3H2O2 2ml，H2O 93ml 5、加樣和電泳 向各加樣孔中滴加24l的樣品酶粗提液。加一小微滴1溴酚藍(lán)，在電壓120V下進(jìn)行電泳分離，根據(jù)指示劑位置確定電泳時(shí)間。電泳結(jié)束后，關(guān)掉電源，取出玻璃板，用刀片或薄板輕輕將玻璃夾層分開。 電泳緩沖液 加在槽中的樣品夾在兩塊玻璃板之間的凝膠 電泳緩沖液電泳示意圖分子量大分子量小電源6、染色 將完整的膠塊置于染色器皿中，加入染色液，浸泡整塊凝膠，室溫下染色2030min，呈現(xiàn)酶帶后取出膠塊，用水漂洗以終止染色。 7、對帶型清楚的膠應(yīng)做攝影記錄或做掃描測定，