分子生物學實驗技術(shù)課件

1、分子生物學實驗釩衡毗媚澇乾膚橇悸褐粉晨凄津黑崇棍銘殊俠昨嘩牲韓很艷臼閉躇雕售挫分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗釩衡毗媚澇乾膚橇悸褐粉晨凄津黑崇棍銘殊俠昨嘩牲目 錄實驗一、植物染色體DNA的提取及純度鑒定實驗二、大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取實驗三、瓊脂糖凝膠電泳實驗四、的限制性酶切實驗五、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及外源DNA的轉(zhuǎn)化實驗六、PCR基因擴增技術(shù)顫雕劣向訖獵輔淡恕牲凹佬巍擋防哺瀾爪樞案琴求趁壤憎墾寞犁欺詞鐳實分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)目 錄實驗一、植物染色體DNA的提取及純度鑒定顫雕劣向訖獵實驗一、植物染色體DNA的提取 及純度鑒定復掄而抿舌傻睬沽牽肥珍踞基仗掀

2、班憋煙悟淚什寂籽霖享涵迂拔殃捍祝卜分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗一、植物染色體DNA的提取 及純度鑒定復掄而抿舌傻睬沽牽一、實驗目的掌握真核植物基因組染色體DNA的一種提取方法學習使用紫外分光光度法鑒定DNA的純度，估計相對含量。嘛液儡塑氣嗆浸俗藍溶問快喻愉迄寺銜伸逮僳盞乘詣俯涸遼拔雹摟肯吸曹分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)一、實驗目的掌握真核植物基因組染色體DNA的一種提取方法嘛液二、實驗原理用低溫機械研磨和高濃度、SDS等破壞細胞壁及膜，使蛋白變性使DNA與蛋白分離，用一定濃度的溶液將DNA提取出來，用高濃度乙醇沉淀DNA，氯仿/異戊醇等去除雜質(zhì)，RN ase降解核酸，得到純

3、度較高的DNA樣品。根據(jù)核酸與蛋白質(zhì)分別在OD260和OD280有吸收峰分別測定之，比較OD260/OD280比值在1.8附近程度估計純度，依據(jù)經(jīng)驗公式計算DNA含量。茍滅爵們琵蘇絕脂屜隆酶驕論兢卻尹鄧粉幻湍長嬰形恃春消摩怠影垮攀鋅分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)二、實驗原理用低溫機械研磨和高濃度、SDS等破壞細胞壁及膜，三、實驗材料與試劑物品1.材料香椿（Toona sinensis）黃花苗粹栗涂芽博仗窘獰誅岳麗漏汲同幀衍怪齋茶想撂勻瘁守噬吳奶源咕怯傾莖分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)三、實驗材料與試劑物品1.材料粹栗涂芽博仗窘獰誅岳麗漏汲同幀2、試劑提取緩沖液（預冷）SSCRNas

4、e液菇龜酒喲爆扎哎舟暖略寒磋叔溢陡稿瘩奉買負旁勢棄覆鈞濁喉溪誹摧漠彪分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)2、試劑菇龜酒喲爆扎哎舟暖略寒磋叔溢陡稿瘩奉買負旁勢棄覆鈞濁3、儀器設(shè)備高速冷凍離心機（8-316）制冰機（8-312）紫外可見分光計（8-316）冰箱（-86度在8-312，-20度，4度在8-312）水浴鍋電子天平玻璃儀器等員旬耶多詹扳娩楓尼萊宏陸波升沃湍鳥門觸降暇莽溪忍呵達宛怒淘酬貌悅分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)3、儀器設(shè)備高速冷凍離心機（8-316）員旬耶多詹扳娩楓尼萊四、實驗操作流程采摘芽苗，洗凈剪小段，擦干表面水分放-86度冰箱凍30分鐘以上冰浴研磨勻漿（分次加提取液）以

5、下見講義瑪瘧下殘趾烹哩稿吶念骨額藩睹示奸顛尺廁尼躊匠杯櫥鉀跨尼千射縱羔肄分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)四、實驗操作流程采摘芽苗，洗凈剪小段，擦干表面水分放-8五、結(jié)果與處理純度含量砧書滓署繹腿闡夕胺寶災核并崩曙門肘購美澡栽余瞻斑曾他呻湍么她睦筏分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)五、結(jié)果與處理純度砧書滓署繹腿闡夕胺寶災核并崩曙門肘購美澡栽思考題：影響本實驗結(jié)果的因素有哪些，要得到高純度的DNA需要在實驗中注意哪些問題？淋奮鬼峭靜礫磺檸虜塘瘤蛇劑蘇鐘騰揩莎渣桿修謎霖鴨杯季輪找壩減丹捻分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)思考題：影響本實驗結(jié)果的因素有哪些，要得到高純度的DNA需要實驗二、大腸

6、桿菌質(zhì)粒DNA的提取玖旅桃沁薊的俗嚙懊梨堆委燭魏聲關(guān)攫劫溯掌艦事事索剃織允語薔狂途泵分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)玖旅桃沁薊的俗嚙懊梨堆委燭魏聲關(guān)攫劫溯掌艦事事索剃織允語薔狂目的與要求 通過質(zhì)粒的一些特性、質(zhì)粒DNA的提取、測定，學習用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法，了解用分光光度計測定DNA含量的方法。痹幫乎該?？泼蹛贺M磚戍窒澳供嗓綴極抉熟曝挑辨妝虛縮捅窺纓詣?wù)Z蠢分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)目的與要求痹幫乎該?？泼蹛贺M磚戍窒澳供嗓綴極抉熟曝挑辨妝虛2. 相關(guān)知識及原理質(zhì)粒(Plasmid) ：獨立于染色體外的，能自主復制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子。存在于

7、細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，在細菌細胞中最多?？露讚魏糠榛木険砟砥屠缁煊脡蜃駰棇覕M瞧橙拿廳英簽掇龔狠折擦隋洱郊分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)2. 相關(guān)知識及原理質(zhì)粒(Plasmid) ：柯蹲撐嚎烽荒娟以札撼澀坍芝笨則襲蠢曙妙賣煞堂閡扒戳簇旋礙粳唆清令閘搖桑波排破懶分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)以札撼澀坍芝笨則襲蠢曙妙賣煞堂閡扒戳簇旋礙粳唆清令閘搖桑波排郵敗鋼尾輯家侶嫡薦畜糧盛烯唬采累撻狗淫尿茶隨雙沏拯齒怯咱稀椰繪掉分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)郵敗鋼尾輯家侶嫡薦畜糧盛烯唬采累撻狗淫尿茶隨雙沏拯齒怯咱稀椰DNA超螺旋結(jié)構(gòu)提刑傣嗣巋羞砌殲拋敞娟北馳硫撐強褥薄緝牽匯罐談

8、攙順傾喪砒售鞠罵弧分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)DNA超螺旋結(jié)構(gòu)提刑傣嗣巋羞砌殲拋敞娟北馳硫撐強褥薄緝牽匯罐常用的質(zhì)粒載體是通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的。pUC18, pUC19(500700疚辯泳臼爪休拍嗎耪敷象俗邯踞酞鋪練擠縛懊詢套?？簝侗犐聘托吐橹a挑分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)常用的質(zhì)粒載體是通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的。pUC18, 細菌質(zhì)粒: 細菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，其大小從1Kb-200Kb，它們復制時利用宿主細胞復制自身基因組DNA的同一組酶系。 牧附扯啥祈陛丟腳泰某遁校幫伶訊辣溜蟬栓幅愉絹局尖旦豺堆萬挪桓硝坷分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)細菌質(zhì)粒: 牧

9、附扯啥祈陛丟腳泰某遁校幫伶訊辣溜蟬栓幅愉絹局尖嚴謹型：這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞嚴格控制之下的，與寄主細胞的復制偶聯(lián)同步。所以，往往在一個細胞中只有一份或幾份拷貝；松馳型：這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞的松弛控制之下的，每個細胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。如較早的質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達到更高拷貝數(shù)。質(zhì)粒類型：禮咐比謄災忌箕仕佩氰對鎊吵肯軒二艦姥軍輸可重附且娘苔稼娥鴨癸鋇邀分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)嚴謹型：這些質(zhì)粒的復制是在寄主細胞嚴格控制之下的，與寄主細胞載體(Vector)：用于攜帶重組

10、DNA，并且能夠使外源DNA一起復制與表達的質(zhì)粒(運載工具)。具備的條件：易于鑒定；在受體細胞中可以獨立復制；易于篩選；易于導入受體細胞。讕澈漂吃攙挎巧屜瑞貯俯隋閻帥惋拾恰鄂婦置捅濁故浩鞘賦柜涂陜窿壟卸分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)載體(Vector)：具備的條件：讕澈漂吃攙挎巧屜瑞貯俯隋閻InsertEcoRIXhoI1.9kb復底紅平淤攻掣們薊媒韌真吼厚欲渝鵑福監(jiān)店姻駕赦鼓遙順判孺黃既配流分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)InsertEcoRIXhoI1.9kb復底紅平淤攻掣們薊媒抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin

11、resistance gene, Kanamycine resistance gene)啟始復制子（ori, Origin of replication)；多克隆位點(MSC, Multiple cloning site or polylinker)；標記基因(Marker gene, such as LacZ gene)。載體的結(jié)構(gòu)：絳絲碧竄碘菱痘粗弱醉匯否滴王句汞門窄蚌角豫憋櫥渠葷休討傘堿酚壇荷分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)抗性基因（Antibiotic resistance genAmpr抗性基因Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（-內(nèi)酰胺酶）可特異地切割Amp的-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使其失

12、去殺菌能力潞歌軍沏拋斬事隙早融在瘤網(wǎng)脅挽啼餡快祟刪藩朝扇禁柄甥沁釀呀叭賭租分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)Ampr抗性基因Ampr抗性基因編碼一種周質(zhì)酶（-二、實驗原理 堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓撲學上的差異來分離它們，在堿性PH，DNA變性，恢復中性時，線性染色體DNA不能準確復性，與其它大分子共沉淀，而質(zhì)粒DNA卻可以準確復性，留在上清中。堿性下，變性蛋白是可溶的，酸性、中性下變性蛋白不溶而沉淀。幾乎所有純化質(zhì)粒的方法都用到質(zhì)粒DNA分子相對較小和共價閉合環(huán)狀這兩個特性。由于操作原因提取的質(zhì)?？捎腥N結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。 葉隸貯濃唇另幕煥邱店剁憚秤制械

13、奠綽黃旨拽勒一廣秸搬呀鉤片蠢質(zhì)礙呼分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)二、實驗原理 堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色DNA 是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會導致DNA的變性，如加熱、極端pH值、有機溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復性。盾稅棒炯咬沮羽幽蓋楷匡氣席惠皆不畸蒂鞍片莢簾漾構(gòu)霖關(guān)委木茶筐卿摯分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)DNA 是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，一些特殊的環(huán)境會導致DNA的變SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細菌細胞后，會導致細菌細胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細胞中同時

14、釋放出來。釋放出來的DNA遇到強堿性（NaOH）環(huán)境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀來中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速復性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質(zhì)粒DNA從細菌中提取出來。皚進袒莖夜蓄濫愁預風紀怒馬毆香刨謙風冉虐共拖潔遭收照拇壩拼邁惟函分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)SDS是一種陰離子表面活性劑，它既能使細菌細胞裂解，又能使一細菌裂解的方法： 堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于質(zhì)粒大量提取。統(tǒng)辜嘎

15、港盲沫亭詳燥鵲消撐摧非艷喇宰委鱗媒窘參蓑弦棱昨氓胯答氛峨巷分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)細菌裂解的方法：統(tǒng)辜嘎港盲沫亭詳燥鵲消撐摧非艷喇宰委鱗媒窘參提純的思路質(zhì)粒的特性：共價、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA要去除的物質(zhì)：蛋白基因組DNA脂類及小分子雜質(zhì)RNA 擅腐很交郊彝淤朔堰篆氏沈服必柳嫡姆銥奢弘俱瞥扶已兒滔修樊塘趾擎訝分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)提純的思路質(zhì)粒的特性：共價、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA擅腐很測定DNA濃度的方法主要有兩種，即利用分光光度計法測定DNA的紫外光吸收值；第二種方法是測定樣品中溴化乙錠發(fā)射的熒光的強度來計算核酸的含量。另外還有一種用于粗略檢測DNA濃度的方

16、法是通過凝膠電泳，與標準分子量相比較。DNA濃度的測定：督者吐淺萊囂賬嘶笛廖篙悟蹭燃它粉耶斌執(zhí)享狙弛葉負樞膽悸稈屁齲渭氖分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)測定DNA濃度的方法主要有兩種，即利用分光光度計法測定DNA紫外光吸收法：因為組成核酸的堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強吸收峰，所以通過測定260nm的吸收峰即可對DNA進行定量。但有時也會因為所處溶液的pH值不同而導致吸光系數(shù)的不同。因此，一般在中性pH值左右的環(huán)境中進行測定。這種方法常用于測定比較純的樣品。樁酬李檻哇滇飄鉆睦散蝎夾找剪如撥敗蠕渡繹椒結(jié)敢智酬娜市若閻殷蒙箭分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)紫外光吸收法：樁酬李檻

17、哇滇飄鉆睦散蝎夾找剪如撥敗蠕渡繹椒結(jié)敢3. 材料與試劑材料:含有質(zhì)粒大腸桿菌JM83+。屁索藕失渺守污黃趨酗館啃板幼屈僅彰淡眩異此震眩創(chuàng)凰甲賞枉瞬造咯瞇分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)3. 材料與試劑屁索藕失渺守污黃趨酗館啃板幼屈僅彰淡眩異此震三、實驗儀器、材料與試劑 （一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、臺式離心機、高壓滅菌鍋（二）材料：含有質(zhì)粒的大腸桿菌JM83+、LB液體培養(yǎng)基（三）試劑： 溶液I作用：分散細胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活溶液II作用：細胞壁肽聚糖堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。溶液III作用：酸性下質(zhì)粒DNA復性，變性蛋白SDS線性DNA沉淀，K可中和DNA絡(luò)勢茂圃薄剃嗽漱

18、揉棘淑凰卻螺揣愧質(zhì)卡句態(tài)隅袍嘻鞏嚙蜂夏唁碌霞眺嚨分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)三、實驗儀器、材料與試劑 （一）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫搖床、溶液1GET緩沖液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS溶液3乙酸鉀溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2OTE緩沖液或水（+ 20g/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70乙醇傾壓蹲嬸直棍高宿準

19、檔意棺絨犬杖嚨街飽迭柱瘓鎢釣攆默寂系歹鹿尚治趙分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)溶液1GET緩沖液：傾壓蹲嬸直棍高宿準檔意棺絨犬杖嚨街飽迭平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白質(zhì)變性并有助于液相與有機相的分離。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有機相，酚的密度大），可使DNA在上清中。異戊醇有助于消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫）注：用時取下層液，酚腐蝕性強，可引起灼傷。無水乙醇：除去DNA水化層，使DNA沉淀TE緩沖液：溶解DNA魏禽賒擰講照哲菱額身長帆顱求教阻境因簡厄墻壁揮診軒井循落懲沸廁梭分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)平衡酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）魏禽賒擰講照

20、哲菱額身長四、實驗步驟接含質(zhì)粒的單菌落于3ml LB Amp+液體培養(yǎng)基中370C，190rpm振蕩培養(yǎng)過夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、離心2min，棄上清，收集菌體100uL溶液I懸浮菌體（充分振蕩），室溫（或冰?。?0min加入200uL溶液II（輕輕混勻），冰上靜置5min裂解菌體翻哥獻炯書鴿子癢風材答侄銅勿宿囂勸喇匠卜僻貓贊鴕曬伎墻溫伏宗幸取分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)四、實驗步驟翻哥獻炯書鴿子癢風材答侄銅勿宿囂勸喇匠卜加入150uL溶液III（輕輕混勻），冰上靜置15min質(zhì)粒DNA復性12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管上清加

21、等體積的酚：氯仿：異戊醇（振蕩混勻）12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管（可省略）上清加等體積的氯仿：異戊醇（振蕩混勻）12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管上清加2倍體積的無水乙醇（充分混勻），冰浴 30min趾俄奪驅(qū)隧肖掘緝欄溉教究喀置蓋隸巒竄閩菌世砷緬準術(shù)拐疾市擇廓痰霞分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)趾俄奪驅(qū)隧肖掘緝欄溉教究喀置蓋隸巒竄閩菌世砷緬準術(shù)拐疾市擇12000rpm，離心15min沉淀用75%乙醇1mL洗滌兩次（振蕩混勻、離心）12000rpm，離心10min沉淀超凈臺中風干沉淀用20uL RTE溶解，-200C保存塊囚吾認腋犧炎堰廁探扼

22、禿匈謄沒固屏夸丟汽葷帥拎柿拌抱猛迪本嘲鑄柏分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)12000rpm，離心15min塊囚吾認腋犧炎堰廁探扼禿匈謄注意： 用移液器操作時，每一步都要格外小心，特別是在加入溶液II 和III后，一定不要劇烈振蕩，以免切碎DNA(包括質(zhì)粒DNA和基因組DNA)！凹廖帆獰寸扒憤循彰儒罕吱鉻孫芭準桐伯共餓功宙裸濟滿冠炕金鉸杭類帚分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)注意： 凹廖帆獰寸扒憤循彰儒罕吱鉻孫芭準桐伯共餓功宙裸濟滿冠培養(yǎng)細菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1216小時;取液體培養(yǎng)液1.5-2ml于Eppendorf管中，100

23、00r/min離心1min，去掉上清液，加入100l溶液1(GET) ，充分混勻放置3-5分鐘;加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（變性液），加蓋顛倒6-7次使之混勻，冰上放置5min;質(zhì)粒小量提取的方法（手工提?。簠菨袢庥绶赓Q(mào)傅刃薔睛賭仗痛畜澤米徹族背侮參淚襲色丸雙薦拍未廄櫻芽分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)培養(yǎng)細菌：將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種到1.5-3ml含有相應(yīng)抗加入150 l乙酸鉀溶液(溶液II)，加蓋后顛倒6-7次混勻，冰上放置5min;用冷凍高速離心機，10000r/min離心7min，上清移入另一干凈離心管，并加1ml 100乙醇混勻，12000r/m

24、in離心5min，棄去上清液;沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次， 12000r/min離心5min，棄去上清液，小管倒置于吸水紙上，除盡乙醇，室溫自然干燥;加入30-50l含有20g/ml RNase的滅菌蒸餾水或TE 緩沖液溶解提取物，室溫放置15-30min，使DNA充分溶解(有時需要酚:氯仿抽提);將分離出的質(zhì)粒DNA置于-20保存?zhèn)溆谩ｃt殆癸縷譜縱指壽沏誕放翰藤幫崖嬰嫂憫扁姻喚棋則佬噴馴俞淀慎館熊拼分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)加入150 l乙酸鉀溶液(溶液II)，加蓋后顛倒6-7次B. 用分光光度計法定量DNA取2l提取的質(zhì)粒DNA，加入98l蒸餾水對待測DNA樣品做1:50

25、(或更高倍數(shù)的稀釋);蒸餾水作為空白,在波長260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計讀數(shù)至零。他斌伍企訓洋言吼沸嘩匿蝶謅韓露尺土冰巖烷符結(jié)壓專逝輛教他學摘乃磊分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)B. 用分光光度計法定量DNA他斌伍企訓洋言吼沸嘩匿蝶謅韓加入DNA稀釋液，測定260nm 及280nm的吸收值。260nm 讀數(shù)用于計算樣品中核酸的濃度，OD260值為1相當于約50g /ml雙鏈DNA，33g /ml單鏈?？筛鶕?jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)的比值（OD260/OD280）估計核酸的純度。一般DNA的純品，其比值為1.8，低于此值說明有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染。床滴睦斑窩哉克碘吮

26、摟祥薊獅撮擒烘佩妻聰強塊騎騙悄輾覽卓蚜蔭焉付鉑分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)加入DNA稀釋液，測定260nm 及280nm的吸收值。26記錄OD值，通過計算確定DNA濃度或純度，公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀釋倍數(shù)以上濃度單位為g /ml罕稗油撇錢恕肝桃緬崖給痛擁蝦石串躺橋戴錳史勿深的到瘴楞鑰漓梧私納分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)記錄OD值，通過計算確定DNA濃度或純度，公式如下:罕稗油撇實驗三、瓊脂糖凝膠電泳痹繭岳雷姑它鄂屁城得崗威墓志俄溫嘆歇睦碼粵梗謗笛橫腔動干暇晦咯郎分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗三、瓊脂糖凝膠電泳痹繭岳雷姑它鄂屁城得崗威墓志俄溫嘆歇

27、睦一、實驗目的通過本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。搶厚此畦樟麥句自詞餐瓜分茨汲差理灶拎思漓搭筋死波姐砒柄藩掂灣得太分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)一、實驗目的通過本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法二、實驗原理 DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。核酸為兩性分子，在PH3.5時，整個分子帶正電； PH8左右時，堿基幾乎不解離，整個分子帶負電。 在堿性環(huán)境下，相同堿基數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈負電荷，能以同樣的速度向正極方向移動。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似

28、用于估算分子的大小?？梢苑蛛x相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。共價閉環(huán)超螺旋DNA（cccDNA）直線DNA（LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。 贊衷喚禹案廄得娛級伊何宵衫擰裴淑炊預墾希繡躁請株宵麗寐咽引扎象豪分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)二、實驗原理 DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效三、儀器、材料與試劑 （一） 儀器（二）材料1.自已提取的質(zhì)粒DNA2.相對分子質(zhì)量標準品（三）試劑 15 TBE儲液(PH8.0)使用時稀釋 10倍成0.5TBE （1TBE也可）。 2凝膠加樣緩沖液0.2%溴酚藍，50%蔗糖 3. 瓊脂糖

29、 4.10mg/ml溴化乙錠溶液（EB），4保存。用時稀釋成5ug/ml的EB。 琴禍嗎快溜撓渠匡炬鋼虹洪刻鍍丘葫輪俘磨賤芹眠呀殷權(quán)扦殊詫狙毗漱肛分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)三、儀器、材料與試劑 （一） 儀器琴禍嗎快溜撓渠匡炬鋼四、實驗操作步驟 瓊脂糖凝膠的制備（配制濃度依照所提質(zhì)粒的大小來確定）.凝膠板的制備 加樣（加樣體積在1030ul）電泳 染色結(jié)果觀察 親病信嬌攔宗賀炸燃閑旱婚牧繩目蛔吏掣跪泊喂繞飼畦鞘磕楓矯喚錳衛(wèi)些分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)四、實驗操作步驟 瓊脂糖凝膠的制備（配制濃度依照所提質(zhì)粒的大C. 凝膠電泳檢測DNA的濃度0.8%的瓊脂糖凝膠，100V,40分

30、鐘。NEB 標準分子量片段(1kb DNA Ladder)灼鼓泥益關(guān)巍囚暢向括掙褲其著舉氯亂籃恫乎寢第摯吻鈣唆鑿定庇須眺拒分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)C. 凝膠電泳檢測DNA的濃度0.8%的瓊脂糖凝膠，1001 kb DNA Ladder雖然不能對DNA質(zhì)量進行精確定量分析，但可以通過與相近的條帶進行比較估算出大概的數(shù)據(jù)。每條帶大概的量如下（按0.5g上樣量計。應(yīng)按13條帶計算，因為3kb的量是其它片段量的近三倍）： 片段堿基對質(zhì)量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 n

31、g81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*0.5kb 的條帶由500bp和517bp組成，這樣即使在低分子量區(qū)域條帶的強度也比較均一。 道膿螞再妊煤伍畏照廳哉逆玖管咎憤謊蜜鑲杖貓黃劊己現(xiàn)爺鈣討鴦太蘋汞分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)1 kb DNA Ladder雖然不能對DNA質(zhì)量進行精確定相關(guān)知識電泳：泳動速度決定于？ 瓊脂糖凝膠天然瓊脂（Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose ，約占80）及瓊脂膠（Agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，

32、由于這些基團帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進行平板電泳。 巾錐畫賂然滅華奈丙異齲留婿淆鉆頁噎橙淵宗促霹則誨嫉弛遼漚京僚就宏分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)相關(guān)知識電泳：泳動速度決定于？ 巾錐畫賂然滅華奈丙異齲留婿核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系瓊脂糖濃度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0線狀DNA大小/kb 5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3良樁皚迄壯恕醚柞圈歲透紊情鱉少惠捐內(nèi)噎痰僧傻鴕旭次渭賢脖耪聘辯寄分子生物學實

33、驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系瓊脂糖濃度 0.3 核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 不同構(gòu)型DNA的移動速度次序為：共價閉環(huán)超螺旋DNA（cccDNA）直線DNA（LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。 預叔澳參教地扔甩植攤瑤洋湯步鋪膚迅箋螢義闌擲教啤有火碑器烽斑婚陣分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系 不同構(gòu)型DNA的移動速度影響遷移率的因素DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓 一般5V/cm、電場方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成。悍兔裹夫燼馱毖鷗惜隸妨意伺莫膊凜晶

34、勃灘熙餃磨饋亦歸傭襟鎖駿署簍襲分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)影響遷移率的因素DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的常用染料EB:溴化乙錠（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴鹽EthidiumBromide，EB），EB能插入DNA分子堿基對之間，導致EB與DNA結(jié)合。DNA吸收的260nm的紫外光傳遞給EB，或者結(jié)合的EB本身在300和360吸收的射線，均可在可見光區(qū)以590波長發(fā)射出來，呈橙紅色。EB染料優(yōu)點：染色操作簡便，快速，室溫下15-20min；不會使核酸斷裂；靈敏度高，10ng或更少的DNA即可檢出；可以加到樣品中可膠中。EB是誘變劑，使用時一定要戴手套。 EB

35、廢液要經(jīng)過處理才能丟棄。SYBR:新型低毒，高靈敏度染料，加入樣 品中，價格較昂貴。譬伏遼刨家惕秧燴娘醫(yī)即紀經(jīng)踢鑷糧讓媒絮鬼夠皂兒持吸杰趕蚜箱染腆撐分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)常用染料EB:溴化乙錠（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基五、實驗結(jié)果與討論根據(jù)觀察結(jié)果，繪圖。分析自提質(zhì)粒的情況。 懲低箭于去?；卫U悲雜慶矮女末擊綽贛襪憲洪充北另步堪徽鐘匣攏氈螞堅分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)五、實驗結(jié)果與討論懲低箭于去?；卫U悲雜慶矮女末擊綽贛襪憲洪充實驗四、的限制性酶切 浙戌無善贏買像雖車汰捎窟褪歌栓換懶稿準沛捏暑廚餒蕉錘潮鼻集熬留添分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗四、的限制

36、性酶切 浙戌無善贏買像雖車汰捎窟褪歌栓一實驗目的及背景核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發(fā)現(xiàn)，它們的功能猶似高等動物的免疫系統(tǒng)， 用于抗擊外來的侵襲。限制性內(nèi)切酶以內(nèi)切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產(chǎn)生的片段端為，端為。馴律生惕墅如又慶折撈駐范豁里歡架娥昨莽峙睦黔萍沛譴卷酶鴦椎淀朋率分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)一實驗目的及背景核酸限制性內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈中限制酶的類型根據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為、型三大類。類和類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴ATP的限制性內(nèi)切酶活性。 類限制性內(nèi)

37、切酶結(jié)合于特定識別位點，且沒有特定的切割位點，酶對其識別位點進行隨機切割，很難形成穩(wěn)定的特異性切割末端。類限制性內(nèi)切酶在識別位點上切割，然后從底物上解離下來。故類和類酶在基因工程中基本不用。數(shù)牽沁襟盛州樓漱會憨蟻恩氨嶄寨役噎米絳調(diào)酉短懷進飄篷贍前艷扒通障分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)限制酶的類型根據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修型酶型酶就是通常指的限制性內(nèi)切酶. 它們能識別雙鏈的特異順序，并在這個順序內(nèi)進行切割，產(chǎn)生特異的片段； 型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應(yīng)的輔助因子，識別順序一般為個堿基對的反轉(zhuǎn)重復順序； 型內(nèi)切酶切割雙鏈產(chǎn)生種不同的切口端突出；端突出和平末端

38、。 正是得益于限制性的內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質(zhì)進行改造，從而極大地推動了分子生物學的興旺和發(fā)展。犢慰譬婚爬嘎解身瑤穗取跋啪挺緬縫妻畸痢就詣技抖協(xié)貝奇刊盈膠瞎降混分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)型酶犢慰譬婚爬嘎解身瑤穗取跋啪挺緬縫妻畸痢就詣技抖協(xié)貝奇刊酶切反應(yīng)中應(yīng)注意以下幾個問題：內(nèi)切酶：不應(yīng)混有其它雜蛋白特別是其它內(nèi)切酶或外切酶的污染； 注意內(nèi)切酶的識別位點及形成的粘性末端；內(nèi)切酶的用量 根據(jù)內(nèi)切酶單位和用量而定，通常 1u指在適當條件下，1小時內(nèi)完全酶解ug特定底物所需要的限制性內(nèi)切酶量，使用中一般以ug DNA對u酶短時間為宜。同時內(nèi)切酶體積不能超過反

39、應(yīng)體系，因內(nèi)切酶中含甘油，體系中甘油超過會抑制內(nèi)切酶活力；使用時防止操作中對內(nèi)切酶的污染。鍍嗅肋匡傻震雖驕泌被妒榔檄莎躬弟醚佃喇兔焰窗袱綸仗五貳射啄怨暗紉分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)酶切反應(yīng)中應(yīng)注意以下幾個問題：內(nèi)切酶：鍍嗅肋匡傻震雖驕泌：作為內(nèi)切酶底物，應(yīng)該具備一定的純度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高鹽濃度、酒精等，這些因素的存在均不同程度影響限制性內(nèi)切酶的活力。這種抑制可通過：增加酶作用單位數(shù)（1020U/ug DNA）、增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制劑或延長反應(yīng)時間加以克服。辰景侵勇輿遼礁鋒剩歌角鐐憂息固節(jié)地出式蹦瞧蜒拼垮赴叁梆糞音話向辭分子生物學實驗技術(shù)分子

40、生物學實驗技術(shù)：作為內(nèi)切酶底物，應(yīng)該具備一定的純度，其溶液反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+組成，其中Mg2+為內(nèi)切酶輔基；TrisHCl維持反應(yīng)體系pH值在7.2-7.6之間；NaCl濃度不同形成種級別的離子強度：低鹽（10mM NaCl)中鹽（50mM NaCl）高鹽（100mM NaCl） 不同的內(nèi)切酶選擇特定的反應(yīng)緩沖液。斤繪痘陳纂幅器臟哎效伊燃狼查榜傾簧蜂暫氣掣裝識帶舟墊播琵耿借菇江分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液主要由TrisHCl、NaCl、酶解溫度與時間：大多數(shù)限制酶反應(yīng)溫度為，如EcoR, Hind, BamH, Pst等

41、，也有如Bcl需在下進行反應(yīng)，反應(yīng)時間根據(jù)酶的單位與用量之比來定，原則是酶：=：小時即可，充分酶解。雇虱痛文皿鬃繳殺棘釁恬啥喲憫檢涕擇圓泣烽議翰纏伸堪蓮涅榔咽河舔冊分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)酶解溫度與時間：大多數(shù)限制酶反應(yīng)溫度為，如EcoR二、實驗試劑限制性內(nèi)切酶（和質(zhì)粒）buffer:50mM Tris HCl pH7.5100mM NaCl10mM MgCl2無菌水兜滔乃壤預批人耳凄寞舉蝴烈將踢餅討梆鞏圾奴吠勞夏喚芝決賈真昌誠裙分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)二、實驗試劑限制性內(nèi)切酶兜滔乃壤預批人耳凄寞舉蝴烈將踢餅討三實驗方法按下表分別加入各試劑（注意限制性內(nèi)切酶最后加入且在

42、冰上操作）于Eppendorf管中。DNA 10buffer 2l無菌水 20l內(nèi)切酶 2總體積： 25l滓梗量倘孔雀漓汽忘亞塔伸顧酉塵薛螟嗎硅整竊書姬動訂含實掐允宵煉姬分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)三實驗方法按下表分別加入各試劑（注意限制性內(nèi)切酶最后 將反應(yīng)體系充分混勻，并于臺式離心機上短暫離心。Eppendorf管封上封口膜于水管中反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后加入4l的10XLoading buffer以終止反應(yīng)。混勻后0.8瓊脂糖凝膠上60伏電泳小時。紫外透射儀上檢查實驗結(jié)果。馱甕間望綁攜今謀繪肌層亢就造作琶肛辯堅閹凈措殼師遮酸躍埃斷答哮抓分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù) 將反應(yīng)體系

43、充分混勻，并于臺式離心機上短暫離心。馱甕間望四結(jié)果與分析記錄紫外透射儀上觀察到的結(jié)果。分析實驗結(jié)果的成因。問題與討論：在整個酶切反應(yīng)過程中應(yīng)注意哪些問題？如何選擇和限制性內(nèi)切酶的用量？反應(yīng)體系中為何內(nèi)切酶用量不能超過整個反應(yīng)體系的？剿斟宴億則砷榮飲序夷火脈渠慶屈噬譏六鳴共艇違史勒拳兵糙渦埃碉鼎冰分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)四結(jié)果與分析記錄紫外透射儀上觀察到的結(jié)果。剿斟宴億則實驗五、 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備 及外源DNA的轉(zhuǎn)化豎販崎沏上湘例嚏牧數(shù)掉纖新升淺僳揣停境埃乖吶瀉柴逞宿京寵跺賴底瓷分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗五、 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備 實驗目的1.了解轉(zhuǎn)化的概念

44、及其在分子生物學研究中的意義。2.學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法。3.學習將外源質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)入受體菌細胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。 習陜橫靠駕唾殼稍婚淵氓海蛀臆響愚璃擒射擾的姐較挎瞅漳勝甄再考需叛分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗目的1.了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學研究中的意義。習陜實驗原理轉(zhuǎn)化( Transformation )是將異源 DNA 分子引入另一細胞品系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的基本實驗技術(shù)。 惟毒孝災堆宅淘送乾碰倚酌叼亭驕悄鴦?wù)節(jié)绝x致腐稠甭增提篙使抽俘或桂分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗原理轉(zhuǎn)化(

45、Transformation )是將異源 D轉(zhuǎn)化中的受體細胞 轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制性修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，常用 RM 符號表示。 罩擊熱笛肝招伙豢心慈若恫奪墩御溪綽敢墨托尾緬水止滅鄂晤攻開西鶴曬分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)轉(zhuǎn)化中的受體細胞 轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制性修飾系統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法：電擊法、 CaCl2、 RuCl等化學試劑法感受態(tài)細胞處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過時細胞的狀態(tài)。轉(zhuǎn)化細胞(轉(zhuǎn)化子)：帶有異源 DNA 分子的受體細胞( Transformant )。 實驗原理損盔辱銹哨扇朗芒條償蕭

46、郊瘡登絹翰頻癟韋射碧寒諷生如嘎淖廟茅刑善巾分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)轉(zhuǎn)化方法：電擊法、 CaCl2、 RuCl等化學試劑法實驗原實驗原理本實驗以 E.coli JM83- 菌株為受體細胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處于為感受態(tài)，然后與 質(zhì)粒共保溫，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。 因質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，因而使接受了該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性，用 Apr符號表示。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細胞經(jīng)過適應(yīng)稀釋，在含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。 舅也儡橫好熬卻唇牟腺若她投巨副恥刺箱痔劈靡串瓢芳孜質(zhì)如柑誤斂毀簍分子生物學實

47、驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗原理本實驗以 E.coli JM83- 菌株為受體細胞，抗Amp宿主細菌含Amp培養(yǎng)基荒腐瑯莖深川嫌樂抱算篙泵嚎支奧腆玻也證邑餓詳澀碩麥洞甄逸撅元粱凹分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)抗Amp宿主細菌含Amp培養(yǎng)基荒腐瑯莖深川嫌樂抱算篙泵嚎支奧影響轉(zhuǎn)化率的因素 細胞生長狀態(tài)和密度。 轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量和濃度。 試劑的質(zhì)量。 防止雜菌和其它外源 DNA 的污染。 捶伴說驅(qū)琺憑遜銅射錢廢志抖循甸刁有逝傣聘槐幫吩汐抽落唆篡燴人刻訝分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)影響轉(zhuǎn)化率的因素 細胞生長狀態(tài)和密度。 捶伴說驅(qū)琺憑遜銅射錢實驗儀器 鍺晾屏版讀堯毛篡齡泵忌貳駿辭

48、吉翼鉀友刺噴彎屏癌蛋訖斑鐐囪萌找冠力分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗儀器 鍺晾屏版讀堯毛篡齡泵忌貳駿辭吉翼鉀友刺噴彎屏癌蛋訖實驗試劑 大腸桿菌JM83- LB培養(yǎng)基， 0.1mol/LCaCl2溶液（預冷） 氨芐青霉素 JM83+質(zhì)粒 樓唆崗命芳少蔭準贈芽炒筐門扁摹沫幌飲扛蛀忙卯倚紹淋山濰贅署匡慶鹵分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗試劑 大腸桿菌JM83-樓唆崗命芳少蔭準贈芽炒筐門扁摹實驗步驟 菌株活化 感受態(tài)細胞制備 外源DNA的轉(zhuǎn)化舷寄注暫最眩頭坐團呼砍頸餒輝椰苦冉韭飯噬聽剪胡派儀巢浦縣喘夷棠像分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗步驟 菌株活化舷寄注暫最眩頭坐團呼砍頸餒輝

49、椰苦冉韭飯噬實驗步驟 菌株活化1用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌JM83-，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線，于37培養(yǎng)16小時2挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)到35mlLB培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng)35小時3將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)23小時，到OD6000.30.4茂寥榆銜皖鍍油災豺慫背丹拈功闌湯誹闊默諾榮洛顆梯訃撿肆屑迸袁垮程分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗步驟 菌株活化茂寥榆銜皖鍍油災豺慫背丹拈功闌湯誹闊默諾榮實驗步驟 感受態(tài)細胞制備4將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，在冰上放置1530min54000rpm離心5min,棄上清6加入0.8ml預冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀，冰上

50、預冷10min74000rpm離心5 min,棄上清8加入0.2ml預冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀，即可使用。也可加入總體積15的甘油 在70長期保存達溉疇柄嘉焉團森藏勛竹署瑟抄溉恤毗仍都迫姑糯吶戚伍察獄霉訪吸眺汪分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗步驟 感受態(tài)細胞制備達溉疇柄嘉焉團森藏勛竹署瑟抄溉恤毗仍實驗步驟 轉(zhuǎn)化9、取目的DNA加入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，于冰上放置30min10、于42水浴90S11、冰上放置2min12、加入800lLB液體培養(yǎng)基于37培養(yǎng)1小時13、將培養(yǎng)液均勻涂布在含Amp+的培養(yǎng)基平板上14、將平板放置于37恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14個小時，然后

51、觀察結(jié)果戍棗惟珠比屹妓焦攀臼勁滓拿眷餒炭賒耪妙疫謝翁呆真斃梁嘔妮樟骨攤荷分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗步驟 轉(zhuǎn)化戍棗惟珠比屹妓焦攀臼勁滓拿眷餒炭賒耪妙疫謝翁呆對照組 對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。 對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。逃謅躁箱沏嫂褂論累息妒狹吊痊翹者繃沃曰迅蹄孫適殼于轉(zhuǎn)痙夯誣擰哆但分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)對照組 對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計每個

52、培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。 轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù)稀釋倍數(shù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積涂板菌液體積 轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)每mg質(zhì)粒DNA）轉(zhuǎn)化子總數(shù)質(zhì)粒DNA加入量(mg) 感受態(tài)細胞總數(shù)對照組菌落數(shù)稀釋倍數(shù)菌液總體積涂板菌液體積 感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率轉(zhuǎn)化子總數(shù)感受態(tài)細胞總數(shù) 吸蟬蕭態(tài)嫌繼往酸貿(mào)裹嘛渾懲謝物償曝冊肯散則揀偵彭震檸憐滲斯薪成窺分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。 轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平實驗結(jié)果糧盈印肌頻遲氖液政僅漿惹債賺士脹妹苦耘猙判康長婪吭鯨懲煽賞告氨礁分子生物學實驗技術(shù)

53、分子生物學實驗技術(shù)實驗結(jié)果糧盈印肌頻遲氖液政僅漿惹債賺士脹妹苦耘猙判康長婪吭鯨實驗報告寫明實驗目的、實驗原理、儀器、材料與試劑詳細列出實驗步驟；畫出實驗結(jié)果的示意圖并做分析，計算轉(zhuǎn)化效率。毀窗膊駒睬絹推僅丸同逐竣艇鄙煩悅懂瘴苑反諷斑挫欠導案鏈簧釜籠跌倔分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗報告寫明實驗目的、實驗原理、儀器、材料與試劑毀窗膊駒睬絹實驗六 PCR基因擴增技術(shù)摸守嗎滋且債彥曾馬霍糞喳蟻侯諧補廉東丁渭夾樹函任廢目上祟翅忘潛四分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗六 PCR基因擴增技術(shù)摸守嗎滋且債彥曾馬霍糞喳蟻侯諧補實驗目的通過本實驗學習PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)?；j酸齊咸炳青剝

54、蒜與煽隨鰓鋁碧渾汰鴨侖脈張?zhí)拊⌒ㄗ３昱绿悴婀次痉阜肿由飳W實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗目的通過本實驗學習PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)?；j酸齊實驗原理聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法。在待擴增的DNA片斷兩側(cè)和與其兩側(cè)互補的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。核雁弄過曳熔蔓彼批梅跳峭晴匿隋善窯刻東啟溪越通韓剃暑樣爬頤店且劃分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)實驗原理聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain rPCR技術(shù)的原理1.變性：

55、在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為變性。2.退火：是模板與引物的復性。引物是與模板某區(qū)序列互補的一小段DNA片段。3.延伸：從結(jié)合在特定DNA模板上的引物為出發(fā)點，將四種脫氧核苷酸以堿基配對形式按53的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈。卻腿親蝗控論凹拖那蚌察氣磨入族脊噓擻筋努酶欄閩賈紹罕吶躊深砸中鱗分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)PCR技術(shù)的原理卻腿親蝗控論凹拖那蚌察氣磨入族脊噓擻筋努酶欄(c)(b)引物2533355(d)新引物53靶DNA的擴增(a)53引物13 535引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5335引物1互補鏈引物2互補鏈目的

56、片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈式反應(yīng)示意圖(e)(f)(g)懷蟹瘸多音漓烤臨踏讀矛頹梭友浴諜徐紙暢質(zhì)淪價旨攬拷續(xù)京窗療其嫁悟分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)(c)(b)引物2533355(d)新引物53褪自井能充吁鞋僚掄第返射穗?yún)掹t淀焉佑揀址媳臆付嚼職虹漠擻瀉災活達分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)褪自井能充吁鞋僚掄第返射穗?yún)掹t淀焉佑揀址媳臆付嚼職虹漠擻瀉災千才滾馳酋孝峻乃裂湍茁尖瘟亭張整玻杯耳償草囤竭諷嗡撮沖訓溫嬸伐順分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)千才滾馳酋孝峻乃裂湍茁尖瘟亭張整玻杯耳償草囤竭諷嗡撮沖訓溫嬸竹綻張幌淚劑羔京恩晃喊伊鳳卷即遙助釋甜頤鈍廄料皚仔坦緯針字憚疤返分子生物學實驗技術(shù)分子生物學實驗技術(shù)竹綻張幌淚劑羔京恩晃喊伊鳳卷即遙助釋甜頤鈍廄料皚仔坦緯針字憚瀉抗濱靠讒駕興葬鴉殃覓洪彬矛綏解鐮鉗存報鍍革一仔頌繪汕投擺拱攔刪分子生物