噬菌體展示的技術(shù)

1、關(guān)于噬菌體展示技術(shù)第1頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四什么是噬菌體展示 是一項(xiàng)篩選技術(shù)，將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表達(dá)，融合蛋白展示在病毒顆粒的表面，而編碼該融合子的DNA則位于病毒粒子內(nèi)。表型基因型展示肽編碼基因使大量多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子（抗體、酶、細(xì)胞表面受體等）的多肽配體通過淘選得以快速鑒定簡(jiǎn)介第2頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四Landmarks of phage display 1985 第一次發(fā)表噬菌體展示技術(shù)；展示多肽Smith GP. Science.1985; 228:1315-71

2、988 噬菌質(zhì)粒系統(tǒng)1990 抗體片段的展示1993 展示cDNA文庫(kù)1994/1995 研發(fā)了phage two-hybrid技術(shù)1996 首次體內(nèi)in vivo 淘選試驗(yàn)1998 噬菌體展示載體作為基因?qū)胼d體1999 Combination of phage display with high-density arrays2001 Automated phage display selectionKilling cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines Published: 3 April 2008 BMC Bi

3、otechnology 2008, 8:37 doi:10.1186/1472-6750-8-37第3頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四展示系統(tǒng)Display SystemCell Based1、Phage Display2、Cell Surface DisplayCell Free 1、Ribosome Display2、mRNA Display第4頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四噬菌體展示系統(tǒng)的分類 根據(jù)噬菌體不同Phage M13, f1, fdT7, T4, lamda根據(jù)載體不同Vector True Phage Phagemid根據(jù)文庫(kù)

4、不同Library 隨機(jī)肽庫(kù)、cDNA文庫(kù)、抗體文庫(kù)、蛋白質(zhì)文庫(kù)第5頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu)絲狀噬菌體：M13、f1和fd。單鏈DNA病毒,6407 bp。基因組編碼11種蛋白質(zhì)，其中5種為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。與展示密切相關(guān)的有兩種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。DNA在細(xì)菌內(nèi)滾環(huán)復(fù)制，細(xì)菌不被裂解，但生長(zhǎng)速度減慢，并且分泌大量噬菌體顆粒第6頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四Life Cycle of M13 pIII蛋白結(jié)合于E.Coli 的F纖毛;病毒ssDNA進(jìn)入細(xì)菌的胞漿合成dsDNA；以dsDNA為模版合成所有的病毒蛋白，且通過滾環(huán)復(fù)

5、制合成組裝病毒所需的ssDNA。第一代噬菌體在感染10分鐘后出現(xiàn)在培養(yǎng)液中（37）。感染后1小時(shí)內(nèi)平均每個(gè)細(xì)胞分泌1000個(gè)噬菌體。第7頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四次要衣殼蛋白pIII406 aa 組成，5個(gè)拷貝，位于噬菌體的尾部。由三個(gè)功能區(qū)組成：N1 穿膜區(qū)：作用于E.coli細(xì)胞膜上的TolA蛋白；與噬菌體的入侵有關(guān)。N2 受體結(jié)合區(qū)：負(fù)責(zé)結(jié)合F菌毛。CT 疏水區(qū)：組裝前黏附在細(xì)菌內(nèi)膜上；與噬菌體組裝終止有關(guān)。G1、G2:甘氨酸片段，在感染過程中，增加各個(gè)功能域之間的靈活性。第8頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四主要衣殼蛋白pVIII每個(gè)

6、病毒子含約2700個(gè)拷貝，約10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表達(dá)的多肽是低價(jià)的，而以pVIII融合子方式表達(dá)的多肽則是高價(jià)的（每個(gè)病毒子200個(gè)拷貝）。這種高價(jià)pVIII展示所增加的親和力有利于篩選到親和力非常低的配體，而低價(jià)pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。所有Ph.D.文庫(kù)都是pIII融合方式（每個(gè)病毒子展示5個(gè)拷貝的外源多肽）。第9頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同? pVIII 展示的多肽比較小，如果太大會(huì)影響噬菌體殼蛋白的組裝。pIII只要不影響感染，可以展示300 aa的多肽。

7、噬菌質(zhì)粒能展示的蛋白已經(jīng)達(dá)到86 kDa。絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每個(gè)病毒子含個(gè)拷貝的pIII蛋白，這五個(gè)蛋白都可以融合短肽而不影響噬菌體的感染力。拷貝數(shù)不同。第10頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四噬菌體質(zhì)粒方便克隆、增強(qiáng)遺傳穩(wěn)定性噬菌體質(zhì)粒特征： 攜帶有欲在噬菌體上融合展示的蛋白基因，沒有其他噬菌體基因。有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(322 ori)和噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori用于合成ssDNA)。有包裝序列信號(hào)（packing signal）。有供篩選的抗生素標(biāo)記基因。Helper phage：提供噬菌體質(zhì)粒復(fù)制、合成ssDNA

8、和病毒包裝所需要的所有蛋白和酶（f1 oridefect)。第11頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四噬菌體展示技術(shù)流程 淘選的方法親和淘選 直接包被法淘選法：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單直接。缺點(diǎn)：偶爾會(huì)導(dǎo)致配體結(jié)合位點(diǎn)難以進(jìn)入 可能是由于分子的立體封阻 或者是靶分子表面的部分變性而引起液相法：先將噬菌體庫(kù)在液相中與靶分子進(jìn)行預(yù)結(jié)合，然后將噬菌體-靶分子復(fù)合物親和捕獲于親和介質(zhì)上，如：鏈霉親和素包被的表面。建庫(kù)：例子含編碼12肽DNA序列為5CATTCTCACTCGGCCGACGGGGC T(NNK)12GGGGCCGCTGGGGCCCAAACTGTTGAA 3，其中N代表A、T、C、G四

9、種堿基，K代表G、T兩種堿基，(NNK)12為編碼隨機(jī)12肽部分，劃線部分含有Bgl識(shí)別序列。擴(kuò)增-嵌合-噬菌體擴(kuò)增第12頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四親和淘選噬菌體肽庫(kù)與靶分子相互作用洗滌去未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的噬菌體將特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來三輪淘選后，克隆測(cè)序第13頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四噬菌體展示的應(yīng)用 抗原表位分析制備特異性抗體制備疫苗、多價(jià)疫苗構(gòu)建新型的生物催化劑如Renet al (1997)將T4 DNA連接酶展示于T4噬菌體，所表達(dá)的融合蛋白能夠高效連接黏性或者平末端。有可能把催化某一代謝途徑的多種酶展示到噬菌體上

10、，制造人工的多酶復(fù)合體?；蛘甙殉砂偕锨€(gè)酶分子的活性位點(diǎn)展示到同一個(gè)噬菌體顆粒上，制造superenzyme。篩選酶抑制劑是尋找抑制酶活性肽段的理想工具。Dennis從肽庫(kù)中篩選到非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制F VIIa 活性的肽段。第14頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四噬菌體展示的應(yīng)用 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用噬菌體cDNA文庫(kù)與芯片相結(jié)合(a)合成噬菌體cDNA文庫(kù)。(b)生物淘選。(c)鋪板，挑克隆入微孔板，為制備芯片做準(zhǔn)備。第15頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四噬菌體展示的應(yīng)用應(yīng)用舉例用病人IgE血清對(duì)6種不同的cDNA文庫(kù)淘選，5輪后，挑出38,000個(gè)

11、克隆，鑒別了233種蛋白，其中47種為已知，186種是新的過敏源。煙曲霉(Aspergillus fumigatus)已成為臨床上僅次于白色念珠菌的一種重要的條件致病真菌。草本枝孢(小麥黑霉病菌) Cladosporium herbarum 雞腿蘑（Coprinus comatus）皮屑牙胞菌(Malassezia furfur)花生和人肺組織Crameri, R. et al. (2001) Tapping allergen repertoires by advanced cloning technologies. Int. Arch. Allergy Immunol.124, 4347第16頁(yè)，共19頁(yè)，2022年，5月20日，4點(diǎn)49分，星期四噬菌體表面展示肽庫(kù)優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：M13無需體外包裝電轉(zhuǎn)化效率高, 庫(kù)容量大2.8 109 M13噬菌體純化步驟簡(jiǎn)單，可加速淘選進(jìn)程可避免細(xì)胞蛋白的污染Any ligand(natural or synthetic) 隨機(jī)肽庫(kù)體內(nèi)篩選器官特異性多肽缺點(diǎn)：僅適合展示小的多肽(=20