醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用培訓(xùn)課件

1、醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用基因重組：不同的DNA分子間發(fā)生共價連接形成重組DNA 分子。重組DNA質(zhì)粒DNA基因片段2醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用基因重組：不同的DNA分子間發(fā)生共價連接形成重組DNA 分子重組DNA技術(shù)發(fā)展史3醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用重組DNA技術(shù)發(fā)展史3醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用pSC101EcoRIBoyer 和Cohen的實(shí)驗(yàn)Boyer 和Cohen的實(shí)驗(yàn)pR6-5大腸桿菌4醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用pSC101EcoRIBoyer 和Cohen的實(shí)驗(yàn)BoyepSC101pR6-5抗四環(huán)素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素基因DNA連接酶重組DNA分子5醫(yī)學(xué)基

2、因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用pSC101pR6-5抗四環(huán)素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素培養(yǎng)平皿四環(huán)素平板卡那霉素基因四環(huán)素卡那霉素基因大腸桿菌6醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用培養(yǎng)平皿四環(huán)素平板卡那霉素基因四環(huán)素卡那霉素基因大腸桿菌6第一節(jié) 基因工程概念7醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用第一節(jié) 基因工程概念7醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用克隆 來自同一始祖的相同拷貝的集合。（一）DNA克隆分子克隆細(xì)胞克隆動物克隆8醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用克隆 來自同一始祖的相同拷貝的集合。（一）DNA克隆分子DNA克隆 應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將某些遺傳物質(zhì)的DNA與載體DNA結(jié)合，形成一種具有自我復(fù)制能力的DNA分子，轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，進(jìn)行

3、擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子。9醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用DNA克隆9醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用DNA克隆目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子10醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用DNA克隆目的基因載體復(fù)制子宿主細(xì)胞擴(kuò)增擴(kuò)增提取DNA分子1生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目的 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程(genetic engineering) 實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。（二）基因工程11醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等目 SS基

4、因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表SS12醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用 SS基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表SS12醫(yī)學(xué)基因工程和其 按照人的愿望設(shè)計和建造非天然的基因表達(dá)體系。某功能蛋白宿主細(xì)胞基因工程產(chǎn)品重組體目的基因13醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用 按照人的愿望設(shè)計和建造非天然的基因表達(dá)體系。某功能蛋白宿第 二 節(jié)自然界的基因重組 DNA Recombination14醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用第 二 節(jié)自然界的基因重組 DNA Reco一、接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用(conjugation)。15醫(yī)學(xué)基因工程

5、和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用一、接合作用當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DN可接合質(zhì)粒如 F 因子(F factor) 質(zhì)粒 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子16醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用可接合質(zhì)粒如 F 因子(F factor) 質(zhì)粒 細(xì)菌二、轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用 (transformation)。 17醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用二、轉(zhuǎn)化作用通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。18醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。18醫(yī)學(xué)基因工程1

6、9醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用19醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用三、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另一（供體）細(xì)胞時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(transduction)。20醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用三、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用當(dāng)病毒從被感染的（供體）細(xì)胞釋放出來、再次感染另噬菌體的生活史溶菌生長途徑(lysis pathway)溶源菌生長途徑(lysogenic pathway)例目 錄21醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用噬菌體的生活史溶菌生長途徑例目 錄21醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)目 錄22醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用目 錄22醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用發(fā)生在同源序列間的

7、重組稱為同源重組(homologous recombination)，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。 （一）同源重組四、基因重組23醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologous r（二）位點(diǎn)特異重組位點(diǎn)特異重組(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點(diǎn)間發(fā)生的整合。24醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用（二）位點(diǎn)特異重組24醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用例 噬菌體DNA的整合噬菌體的整合酶識別噬菌體和宿主染色體的特異靶位點(diǎn)發(fā)生選擇性

8、整合；反轉(zhuǎn)錄病毒整合酶可特異地識別、整合反轉(zhuǎn)錄病毒cDNA的長末端重復(fù)序列(long terminal repeat, LTR)。 25醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用例 噬菌體DNA的整合25醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用（三）轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座(transposition)。26醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用（三）轉(zhuǎn)座重組由插入序列和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因移位或重排稱為轉(zhuǎn)座第 三 節(jié) 基因工程的核心技術(shù)27醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用第 三 節(jié) 基因工程的核心技術(shù)27醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)一、重要的技術(shù)工具 限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)

9、移酶 Taq DNA聚合酶28醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用一、重要的技術(shù)工具 限制性核酸內(nèi)切酶28醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行

10、填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基29醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工 具 酶功 限制性核酸內(nèi)切酶定義限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識別DNA的特異序列, 并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H30醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用限制性核酸內(nèi)切酶定義GGATCCGGATCC+Bam H3作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自

11、身DNA。分類、（基因工程技術(shù)中常用型）31醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用作用分類31醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶32醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；命名Hin d 類酶識別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG33醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用類酶識別序列特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)(palindro

12、me) Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口34醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用Bam HGTCGGATCC+GGATCCHindGTC同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst35醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用同功異源酶GGATCCGGATCC+Bam HGGATCC同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。

13、這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A36醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用同尾酶Bam HBg l GGATCC AGATCTG （二）基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA37醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用（二）基因載體定義常用載體37醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用克隆載體(cloning vector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達(dá)

14、載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。38醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用克隆載體(cloning vector)38醫(yī)學(xué)基因工程和其載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)（外源DNA插入點(diǎn)），常具有多個單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA。39醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；39醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用1. 質(zhì)粒 (plasmid)特點(diǎn) 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。 40醫(yī)學(xué)基因工程和

15、其醫(yī)學(xué)應(yīng)用1. 質(zhì)粒 (plasmid)特點(diǎn)40醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)目 錄41醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用目 錄41醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用42醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用42醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克隆）EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）2. 噬菌體(phage) M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列43醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用噬菌體DNA改造系統(tǒng) 2. 噬菌體(phage) M13噬3. 粘性質(zhì)粒(cosmid)44醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用3. 粘性質(zhì)粒(cosmid)44醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用酵母人工染色

16、體 (yeast artificial chromosome, YAC)細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他45醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用酵母人工染色體其他45醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用（一）核酸探針與分子雜交二、常用技術(shù)的原理和用途核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA復(fù)性過程中，如果把不同DNA單鏈分子放在同一溶液中，或把DNA與RNA放在一起，只要在DNA或RNA的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜

17、化雙鏈(heteroduplex) 。46醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用（一）核酸探針與分子雜交二、常用技術(shù)的原理和用途核酸分子雜交復(fù)性RNADNA47醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用復(fù)性RNADNA47醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用探針技術(shù) 探針 (probe) 一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 48醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用探針技術(shù) 探針 (probe) 48醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng) DNA印跡技術(shù) (Southern blotting) 用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。 RNA印跡技術(shù) (Northe

18、rn blotting) 用于RNA的定性定量分析。 蛋白質(zhì)的印跡分析 (Western blotting) 用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。 49醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用 DNA印跡技術(shù) (Southern blotting) 其他斑點(diǎn)印跡 (dot blotting) 原位雜交 (in situ hybridization)DNA點(diǎn)陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù) (DNA chip)50醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用 其他50醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用三種印跡技術(shù)的比較51醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用三種印跡技術(shù)的比較51醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用DNA點(diǎn)陣52醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用DN

19、A點(diǎn)陣52醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 55（二）聚 合 酶 鏈 反 應(yīng)53醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用5Primer 15Primer 2Cycle 2CycCycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。54醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用Cycle 355 555 5 555 5模板DNA 特異性引物耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR體系基本組成成分55醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用模板DNAPCR體系基本

20、組成成分55醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用PCR的基本反應(yīng)步驟變性95C延伸72C退火Tm-5C56醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用PCR的基本反應(yīng)步驟變性延伸退火56醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用1 目的基因的克隆2 基因的體外突變3 DNA和RNA的微量分析4 DNA序列測定5 基因突變分析PCR的主要用途57醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用1 目的基因的克隆PCR的主要用途57醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)三、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá) 58醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用三、重組DNA技術(shù)基本原理基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受

21、 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過 程59醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用 以59醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用（一）目的基因的獲取1. 化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。2.基因組DNA文庫(genomic DNA library)3. cDNA文庫(cDNA library)4. 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) （見第22章） 60醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用（一）目的基因的獲取1. 化學(xué)合成法60醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)* 化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列61醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用* 化學(xué)合成法

22、獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合* 從基因組DNA文庫獲取目的基因62醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制* 從cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 T T T T63醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用mRNA cDNA 雙鏈c

23、DNA 重組DNA分子 （三）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建64醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用（三）外源基因與載體的連接1. 粘性末端連接（二）克隆載體的Bam H切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接65醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用Bam H切割反應(yīng) GGATCCT4 DNA連接酶GATC2. 平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端

24、補(bǔ)齊或切平形成的平端66醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用2. 平端連接66醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自連67醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶重組體3. 同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。68醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用3. 同聚物加尾連接68醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用5335載體DNA5335目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 3

25、5 5 3 35 5 3 A(A)nA A(A)nA 35-核酸外切酶-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+ dATP末端轉(zhuǎn)移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA連接酶15C重組體69醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用53載體DNA53目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶 4. 人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。 70醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用4. 人工接頭(linker)連接70醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R71醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)

26、學(xué)應(yīng)用人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCG 5-Eco REco受體菌條件安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent) 導(dǎo)入方式轉(zhuǎn)化 (transformation)轉(zhuǎn)染 (transfection)感染 (infection)（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌72醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用受體菌條件導(dǎo)入方式（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌72醫(yī)學(xué)基因工程（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法(1) 抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue)(3) 分子雜交法原位雜交Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等73醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用（五）重組體的篩

27、選73醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用培訓(xùn)課件原位雜交75醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用原位雜交75醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用Southern印跡目 錄76醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用Southern印跡目 錄76醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為 小 結(jié)分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體菌 篩篩選重組體 77醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為 小 結(jié)分分離目的基重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)

28、化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交78醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源表達(dá)體系的建立表達(dá)載體的構(gòu)建受體細(xì)胞的建立表達(dá)產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達(dá)79醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用表達(dá)體系的建立（六）克隆基因的表達(dá)79醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)1. 原核表達(dá)體系 （E.coli表達(dá)體系最為常用）標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志強(qiáng)啟動子 翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點(diǎn)E.coli表達(dá)體系的不足 不宜表達(dá)真核基因組DNA不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白80醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用1. 原核表達(dá)體系 （E.coli表達(dá)體系最為常用）80醫(yī)學(xué)優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時、經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 2. 真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞81醫(yī)學(xué)基因工程和其醫(yī)學(xué)