醫(yī)療研究生開題報告培訓(xùn)課件

1、醫(yī)療研究生開題報告醫(yī)療研究生開題報告六、已具備條件七、可行性八、研究主要階段、進度和完成時間九、經(jīng)費預(yù)算十、實驗風(fēng)險及前景分析醫(yī)療研究生開題報告2六、已具備條件醫(yī)療研究生開題報告2一、課題名稱PVRL1基因SNPs與環(huán)境交互作用和非綜合征型唇腭裂的關(guān)聯(lián)性研究醫(yī)療研究生開題報告3一、課題名稱醫(yī)療研究生開題報告3二、研究目的及意義探討PVRL1的SNPs在NSCL/P的可能作用探討NSCL/P與環(huán)境因素的因果關(guān)系揭示基因-環(huán)境交互作用研究目的：醫(yī)療研究生開題報告4二、研究目的及意義探討PVRL1的SNPs在NSCL/P的可為NSCL/P基因診斷提供依據(jù)為NSCL/P家庭提供遺傳咨詢?yōu)閺V東人群基因數(shù)

2、據(jù)庫積累資料研究意義：醫(yī)療研究生開題報告5為NSCL/P基因診斷提供依據(jù)研究意義：醫(yī)療研究生開題報告5三、立論依據(jù)及研究現(xiàn)狀唇腭裂畸形是人類最常見的先天性發(fā)育缺陷之一，全世界發(fā)病率約為12。我國是世界上唇腭裂的高發(fā)國家之一，發(fā)病率約1.82 。醫(yī)療研究生開題報告6三、立論依據(jù)及研究現(xiàn)狀唇腭裂畸形是人類最常見的先天性發(fā)育缺陷非綜合征型唇腭裂（NSCL/P, MIM 119530 ）是指不伴發(fā)其他系統(tǒng)、器官畸形的，不在某些綜合征之列的唇裂、唇裂合并腭裂、及腭裂的總成，約占先天性唇腭裂70% 。醫(yī)療研究生開題報告7非綜合征型唇腭裂（NSCL/P, MIM 119530 ）是目前的研究認為NSCL/P

3、是一類多因素復(fù)雜疾病，其發(fā)生是遺傳和環(huán)境多種因素相互作用的結(jié)果，其遺傳易感性和基因-環(huán)境交互作用是病因?qū)W研究的熱點。醫(yī)療研究生開題報告8目前的研究認為NSCL/P是一類多因素復(fù)雜疾病，其發(fā)生是遺傳醫(yī)療研究生開題報告9醫(yī)療研究生開題報告9一、環(huán)境因素環(huán)境生物因素：孕早期微生物感染是導(dǎo)致NSCL/P的重要危險因素之一。Metneki J等2005年在匈牙利的一項大規(guī)模以人群為基礎(chǔ)的病例對照研究中表明，婦女在孕早期患普通感冒及流感顯著增加了子代唇腭裂患病的危險性（OR=2.3和2.8）。醫(yī)療研究生開題報告10一、環(huán)境因素環(huán)境生物因素：孕早期微生物感染是導(dǎo)致NSCL/P環(huán)境物理因素：環(huán)境物理因素主要包

4、括電磁輻射（X-RAY、微波、無線電波、電視、手機、電腦等），噪音等。Blaasaas KG等2002年的研究發(fā)現(xiàn)，孕婦每周接觸50HZ電磁輻射大于24小時時，唇裂的發(fā)病風(fēng)險增加（OR=1.78）。醫(yī)療研究生開題報告11環(huán)境物理因素：環(huán)境物理因素主要包括電磁輻射（X-RAY、微波環(huán)境化學(xué)因素：包括藥物、環(huán)境污染、煙酒嗜好、孕期營養(yǎng)等。Ericson等2001年在對1995-1998年出生的2557例嬰兒進行研究，發(fā)現(xiàn)母親妊娠期間服用NASID導(dǎo)致唇腭裂的風(fēng)險增加（OR=2.51）。Chuangsuwanich等1998年在泰國的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)52.74%的唇裂患者母親有孕期服藥史。醫(yī)療研究生

5、開題報告12環(huán)境化學(xué)因素：包括藥物、環(huán)境污染、煙酒嗜好、孕期營養(yǎng)等。醫(yī)療環(huán)境污染：Marco Vinceti等2001年在意大利北部鉛污染地區(qū)進行了以人群為基礎(chǔ)的病例對照研究，發(fā)現(xiàn)鉛污染使唇腭裂發(fā)病風(fēng)險增加（OR=2.28）。醫(yī)療研究生開題報告13環(huán)境污染：Marco Vinceti等2001年在意大利北部煙酒嗜好：Bailey LJ等在1995年的研究中證明孕早期吸煙，產(chǎn)生的CO降低了胎兒的O2供應(yīng)，從而促使唇腭裂的發(fā)生。Hartsfield JK等在2001年的研究中認為煙草的復(fù)合物可能影響遺傳物質(zhì)的合成及應(yīng)用。醫(yī)療研究生開題報告14煙酒嗜好：Bailey LJ等在1995年的研究中證明孕

6、早期孕期營養(yǎng)：Ingrid PC等2004年的研究中認為孕期增加植物蛋白、植物纖維、抗壞血酸等的攝入可降低唇腭裂發(fā)生。張思雷等2002年在對地塞米松誘導(dǎo)大鼠腭裂形成的研究中認為增加VitB6促進體內(nèi)氨基酸和脂肪代謝等多種生命代謝，有助于胚胎修復(fù)唇腭裂畸形，增強抵抗力，降低先天性畸形的易感性。醫(yī)療研究生開題報告15孕期營養(yǎng)：Ingrid PC等2004年的研究中認為孕期增加二、個體因素Shaw GM等1999年的研究中認為孕婦年齡、文化程度、劇烈妊娠反應(yīng)及妊娠并發(fā)癥與唇腭裂的發(fā)病相關(guān)；不同胎次唇腭裂的發(fā)生率有高度顯著性差異；體重輕的新生兒唇腭裂患病率高。醫(yī)療研究生開題報告16二、個體因素Shaw

7、 GM等1999年的研究中認為孕婦年齡、Spilson等2001年的研究中發(fā)現(xiàn)糖尿病孕婦生育唇腭裂患兒的危險性是非糖尿病孕婦的1.3倍。醫(yī)療研究生開題報告17Spilson等2001年的研究中發(fā)現(xiàn)糖尿病孕婦生育唇腭裂患三、遺傳因素早期的遺傳因素研究由于受研究方法、實驗手段不夠豐富所限制，學(xué)者們多通過已被證實的單基因致病的包含有唇腭裂的綜合征來反推NSCL/P的易感基因。醫(yī)療研究生開題報告18三、遺傳因素早期的遺傳因素研究由于受研究方法、實驗手段不夠豐 近年來，隨著人類基因組計劃(HGP)的實施以及基因芯片技術(shù)的發(fā)展，對易感基因的研究及新易感基因的尋找更傾向于全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS )，這是

8、發(fā)現(xiàn)影響復(fù)雜性疾病發(fā)生的遺傳特征的一種新策略 。醫(yī)療研究生開題報告19 近年來，隨著人類基因組計劃(HGP)的實施以及基因芯醫(yī)療研究生開題報告20醫(yī)療研究生開題報告20醫(yī)療研究生開題報告21醫(yī)療研究生開題報告21另外，國內(nèi)外現(xiàn)在多認為單純性腭裂（cleft palate only, CPO）和唇裂伴或者不伴有腭裂（cleft lip with or without cleft palate, CL/P）有不同的遺傳學(xué)背景。前者傾向于單一主要基因影響（X和2號染色體）；后者受多種基因影響（1、2、4、6、9、11、14、16、19號染色體均有相關(guān)基因或位點）醫(yī)療研究生開題報告22另外，國內(nèi)外現(xiàn)在

9、多認為單純性腭裂（cleft palate CLP易感基因定位及相關(guān)文獻研究CPO易感基因定位及相關(guān)文獻研究醫(yī)療研究生開題報告23CLP易感基因定位及相關(guān)文獻研究醫(yī)療研究生開題報告23PVRL1（Poliovirus Receptor Like-1）位于Chr11 q23.2區(qū)，編碼細胞-細胞粘附受體，協(xié)同鈣粘素調(diào)整上皮黏著連接形成的速度，并影響上皮細胞之間緊密連接的形成，對上皮粘附的發(fā)生和維持起重要作用。PVRL1基因(本課題研究基因)醫(yī)療研究生開題報告24PVRL1（Poliovirus Receptor Like目前有關(guān)脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)基因1（PVRL1）多態(tài)性與人群NSCL/P的

10、關(guān)系還不十分清楚，國內(nèi)外不同研究機構(gòu)對該基因研究結(jié)果報道不盡一致，甚至相互背離。這可能與基因存在種族和地區(qū)差異性、樣本量、研究方法、評定原則相關(guān)。 醫(yī)療研究生開題報告25目前有關(guān)脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關(guān)基因1（PVRL1）多態(tài)性與人較早的對PVRL1和NSCL/P的相關(guān)性研究是2000年美國學(xué)者Suzuki Kj等在加勒比海的Margarita Island對CLPED1（MIM 225000，MIM 225060)患者研究中發(fā)現(xiàn)了PVRL1編碼的185（TGGT-G）和323(GGTGGTT)位氨基酸突變，此后在北部委內(nèi)瑞拉的NSCL/P患者中同樣發(fā)現(xiàn)了PVRL1編碼的185(TGGT-G)位

11、氨基酸的突變；同時，他們的研究還證實了該無義突變導(dǎo)致PVRL1編碼的肽鏈的長度縮短，進而可能影響上皮粘附的發(fā)生。醫(yī)療研究生開題報告26較早的對PVRL1和NSCL/P的相關(guān)性研究是2000年美國然而Scapoli L等2005年在意大利人群中并沒有發(fā)現(xiàn)W185X的突變，但是他們發(fā)現(xiàn)了R199Q、R210H、R212H、D424D這些突變，正常人中這幾個氨基酸均為保守序列。醫(yī)療研究生開題報告27然而Scapoli L等2005年在意大利人群中并沒有發(fā)現(xiàn)WTseng等2006年在臺灣的NSCL/P患者和PVRL1的關(guān)聯(lián)研究中得出的結(jié)論是185 和323密碼子，特別是W185X的突變，也是并不參與臺

12、灣人群的NSCL/P形成。醫(yī)療研究生開題報告28Tseng等2006年在臺灣的NSCL/P患者和PVRL1的趙雄等2009年在對江浙地區(qū)漢族人群的PVRL1研究中，也沒有發(fā)現(xiàn)W185X突變或者其他可信的多態(tài)性位點，得出結(jié)論是PVRL1基因exon3可能不參與江浙人群NSCL/P發(fā)病醫(yī)療研究生開題報告29趙雄等2009年在對江浙地區(qū)漢族人群的PVRL1研究中，也沒另外，Avila等2006年在挪威、菲律賓、南美人群中對PVRL1的研究中總共發(fā)現(xiàn)了25個與NSCL/P相關(guān)的突變位點。其中比較有意義的S112T和T131A均出現(xiàn)在PVRL1 V區(qū)的關(guān)鍵氨基酸附近，該區(qū)域之前被認為是介導(dǎo)細胞-細胞粘附

13、和細胞-病毒粘附的區(qū)域；還有G361V出現(xiàn)在跨膜區(qū)，被認為可能影響PVRL1的結(jié)構(gòu)。醫(yī)療研究生開題報告30另外，Avila等2006年在挪威、菲律賓、南美人群中對PVTongkobpetch等2008年發(fā)現(xiàn)，泰國CL/P 患者的PVRL1 基因第6 外顯子的1183GA 具有雜合性，會導(dǎo)致395（V395M）位的纈氨酸被甲硫氨酸取代。醫(yī)療研究生開題報告31Tongkobpetch等2008年發(fā)現(xiàn)，泰國CL/P 患者然而舒申友等在2010年對PVRL1的病例對照研究中，并沒有發(fā)現(xiàn)證據(jù)表明S112T、T131A、G361V和V395M參與了廣東人群的NSCL/P形成。醫(yī)療研究生開題報告32然而舒申

14、友等在2010年對PVRL1的病例對照研究中，并沒有Turhani等在2005年歐洲人群的研究中發(fā)現(xiàn)CLMPT1基因的內(nèi)含子IVS7-10G/A，外顯子Gly331Gly,Ala88Ala,Pro309Pro的突變聯(lián)合PVRL1基因的Glu441-Gly442插入Glu突變同時發(fā)生的話，可能是NSCL/P的遺傳因素。醫(yī)療研究生開題報告33Turhani等在2005年歐洲人群的研究中發(fā)現(xiàn)CLMPT1綜上所述，國內(nèi)外的研究機構(gòu)對PVRL1基因的多態(tài)性與NSCL/P的發(fā)病關(guān)聯(lián)性研究中存在比較大的分歧，這樣的結(jié)果一方面可以理解為人群的遺傳背景不同，另一方面也與一些研究中的設(shè)計（例如樣本量，納入研究范圍

15、的樣本）不同有關(guān)系。這樣的原因?qū)е陆y(tǒng)計強度不夠，可能存在未被發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性位點或者有意義的已知突變位點被誤篩。醫(yī)療研究生開題報告34綜上所述，國內(nèi)外的研究機構(gòu)對PVRL1基因的多態(tài)性與NSCL四、實驗方法基于以上理論，采取可信公認的研究方法，在PVRL1基因90kbp的bases中篩查可疑的多態(tài)性位點，進而對陽性位點附近序列進行測序，而后進行病例-對照研究和家系分析兩種分析方法揭示PVRL1基因單個SNP位點或單倍型與NSCL/P的關(guān)系，最后揭示PVRL1基因的多態(tài)性與環(huán)境因素（流行病學(xué)調(diào)查）的交互作用與唇腭裂發(fā)病的關(guān)聯(lián)，是本研究的技術(shù)路線。醫(yī)療研究生開題報告35四、實驗方法基于以上理論，采取可

16、信公認的研究方法，在PVRL路線一1、病例篩選：選取2008-2010年在我中心住院手術(shù)的NSCL/P患者核心家庭200個（共600個個體），另外150例NSCL/P患者（單純患者，無父母參與）和350例健康志愿者對照組。提取外周靜脈血10ml備用。2、提取所有研究對象共1100份基因組DNA。醫(yī)療研究生開題報告36路線一1、病例篩選：選取2008-2010年在我中心住院手術(shù)3、從人類基因組單體型計劃(HapMap Project) 數(shù)據(jù)庫中已有的891個已知PVRL1基因的SNPs中使用軟件SNPbrowser4.0(ABI)挑選出26個Tag SNPs（每個可以代表4000bp堿基段），使

17、用引物單堿基延伸+基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF）的方法行SNP分型并LD檢驗行單體型分析。醫(yī)療研究生開題報告373、從人類基因組單體型計劃(HapMap Project) 單體型分析圖A six-nucleotide insertion-deletion polymorphism inthe CASP8 promoter is associated with susceptibilityto multiple cancers. NATURE GENETICS VOLUME 39 NUMBER 5 MAY 2007醫(yī)療研究生開題報告38單體型分析圖醫(yī)療研究生開題報告38醫(yī)

18、療研究生開題報告39醫(yī)療研究生開題報告39醫(yī)療研究生開題報告40醫(yī)療研究生開題報告40醫(yī)療研究生開題報告41醫(yī)療研究生開題報告41醫(yī)療研究生開題報告培訓(xùn)課件5、發(fā)現(xiàn)陽性位點之后，在陽性位點附近安排24輪DNA測序（Sanger法，每個反應(yīng)擴增500個bp左右，若4輪反應(yīng)則總共檢測2000個bp左右片段，共700個樣本），力求發(fā)現(xiàn)新的未被報道的突變位點。醫(yī)療研究生開題報告435、發(fā)現(xiàn)陽性位點之后，在陽性位點附近安排24輪DNA測序（6、同樣使用MALDI-TOF的方法行200個核心家系父母（共400個個體）SNP分型。而后結(jié)合前述所在家庭患兒的SNP分型進行傳遞不平衡檢驗，力求發(fā)現(xiàn)陽性（與NSC

19、L/P有關(guān)聯(lián)）的過傳遞位點。醫(yī)療研究生開題報告446、同樣使用MALDI-TOF的方法行200個核心家系父母（附：統(tǒng)計分析將使用軟件：HAPLOVIER3.32軟件行等位基因的HWE檢驗、等位基因和單倍型的關(guān)聯(lián)分析等。PLINK軟件行基因型和等位基因的關(guān)聯(lián)分析。UNPHRASED軟件行病例-對照研究。醫(yī)療研究生開題報告45附：統(tǒng)計分析將使用軟件：醫(yī)療研究生開題報告45路線二1、對研究對象（200個核心家庭）父母進行電話調(diào)查，具體調(diào)查項目包括兒童基本情況、父母基本情況、母親妊娠早期情況、母親既往史等。2、進行資料統(tǒng)一編碼，建立數(shù)據(jù)庫并錄入數(shù)據(jù)。3、分析暴露因素與NSCL/P發(fā)生的關(guān)系。醫(yī)療研究生

20、開題報告46路線二1、對研究對象（200個核心家庭）父母進行電話調(diào)查，具技術(shù)路線圖醫(yī)療研究生開題報告47技術(shù)路線圖醫(yī)療研究生開題報告47五、預(yù)期目標1、揭示PVRL1基因在廣東人群中的單體型。并與NSCL/P建立關(guān)聯(lián)。2、發(fā)現(xiàn)新的SNP位點或者突變的DNA片段。并與NSCL/P建立關(guān)聯(lián)。3、揭示廣東人群唇腭裂的環(huán)境危險因素。4、探討環(huán)境因素和遺傳因素在NSCL/P發(fā)病中的交互作用。醫(yī)療研究生開題報告48五、預(yù)期目標1、揭示PVRL1基因在廣東人群中的單體型。并與六、已具備條件1、本研究前期標本（血樣）收集已經(jīng)完成。2、2010年在本中心的一個廣東省自然基金課題中已經(jīng)對PVRL1基因作了初步研究

21、，但是樣本量只選取了71患者和100個對照，樣本量不夠降低了統(tǒng)計檢驗的強度。3、本中心對NSCL/P易感基因的研究已經(jīng)積累充分經(jīng)驗，可提供寶貴的理論和實踐指導(dǎo)。醫(yī)療研究生開題報告49六、已具備條件1、本研究前期標本（血樣）收集已經(jīng)完成。醫(yī)療七、可行性1、本研究樣本量較大，結(jié)果真實性和可靠性較有保證。2、MALDI-TOF檢測方法被眾多SCI雜志推薦為SNP檢測方法。盡管TAQMAN探針法的特異性更高，但是相對于質(zhì)譜法其成本貴，通量也不如質(zhì)譜。醫(yī)療研究生開題報告50七、可行性1、本研究樣本量較大，結(jié)果真實性和可靠性較有保證八、工作主要階段、進度和完成時間1、實驗所需血樣基因組DNA已大部分提取完畢。2、TAG