免疫磁珠分離陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的可行性

1、免疫磁珠分離陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的可行性1、免疫磁珠的性質(zhì)免疫磁珠由三部分組成，核心是金屬小顆粒（Fe2O3、Fe3O4）,核心的外層 包裹一層高分子材料（如聚苯乙烯、聚氯乙烯等） ,最外層是功能基層, 如氨基 （-NH4）、竣基（-COOH）、羥基（-0H）。磁珠是均勻、球形、具有超順磁 性及保護(hù)性殼的粒子。大小和形狀的均一性，可使靶物質(zhì)迅速和有效地結(jié)合到磁 珠上，它的球形結(jié)構(gòu)可消除與不規(guī)則形狀粒子有關(guān)的非特異性結(jié)合超順磁性可使 磁珠置于磁場(chǎng)時(shí)，顯示其磁性，從磁場(chǎng)移出時(shí)，磁性消除、磁珠分散保護(hù)性殼可 防止金屬微粒漏出1。根據(jù)磁珠功能基結(jié)合的免疫配基不同分為：包被一抗的磁 珠、包被二抗的磁珠、未包

2、被的磁珠和包被抗生物素的磁珠。2、免疫磁珠分離技術(shù)的原理免疫磁珠的功能基團(tuán)可結(jié)合活性蛋白質(zhì)（如抗體、抗原），利用磁珠上的抗 體或抗原與相應(yīng)的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成免疫磁珠-抗體-抗原的復(fù)合 物，這種復(fù)合物在磁場(chǎng)的作用下，發(fā)生力學(xué)移動(dòng)，使復(fù)合物與其它物質(zhì)分離，達(dá) 到分離純化的目的2。3、免疫磁珠的應(yīng)用3.1 免疫檢測(cè)在免疫檢測(cè)中，免疫磁珠作為固相載體，磁珠上的抗體與抗原特異性結(jié)合， 形成抗原-抗體-磁珠復(fù)合物，在磁場(chǎng)的作用下，使特異性抗原與其它物質(zhì)分離， 起到了提純與富集的作用，克服了放射免疫和酶聯(lián)免疫檢測(cè)的缺點(diǎn)。這種分離檢 測(cè)方法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。磁珠標(biāo)記的氯霉素直接競(jìng)爭(zhēng)E

3、LISA方法 比常規(guī)直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)靈敏度提高50倍，達(dá)到0.002ng/mL3。此外，免疫磁 珠在病原微生物的檢測(cè)方面也起了重要的作用，例如，能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)水中 弓形蟲(chóng)4的情況。3.2 細(xì)胞分離早在20世紀(jì)80年代初期,Ugelstad就提出用磁性微粒分離細(xì)胞，后由挪威 Dynal公司制成免疫磁珠出售，可用于各種細(xì)胞的分離。使用IMB進(jìn)行分離細(xì)胞 有兩種方式:直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞的方法, 稱為陽(yáng)性分離；用免疫磁 珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞, 使靶細(xì)胞得以純化的方法, 稱為陰性分離。免疫磁珠技術(shù)可用來(lái) 分離人類各種細(xì)胞, 如紅細(xì)胞5 、外周血嗜酸/ 堿性粒細(xì)胞, 神經(jīng)干細(xì)胞, 造血細(xì)

4、胞6 ,7 、T淋巴細(xì)胞&9、丫。T淋巴細(xì)胞，人類關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞a ,ii ，樹(shù)突狀細(xì) 胞, 內(nèi)皮細(xì)胞12 、及多種腫瘤細(xì)胞等。此外，根據(jù)磁珠與細(xì)胞結(jié)合的方式分為： 直接法和間接法分離，如下圖：A宜接法對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行分類B間接法對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行分離3.3 生物大分子純化 免疫磁珠的基質(zhì)上固相化抗體或抗原后，形成特異性吸附后，利用磁性分離， 可分離和純化相應(yīng)的生物大分子。為蛋白質(zhì)、 DNA、 RNA、 DNA 結(jié)合蛋白及 mRNA 等的分離提供載體13，14。4、免疫磁珠分離陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的原理免疫磁珠偶聯(lián)特異性抗原，與雜交瘤細(xì)胞混合孵育，利用抗原-抗體特異性 結(jié)合這一特性，陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞與免疫磁珠結(jié)

5、合，在其周圍形成“玫瑰花型”結(jié) 構(gòu)，經(jīng)過(guò)磁性分離，洗滌，得到陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞15，16，17。5、免疫磁珠分離陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的路線圖免疫磁珠篩選常規(guī)ELISA免疫磁珠篩選常規(guī)ELISA篩選5.1 細(xì)胞融合按照目前常規(guī)方法，脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞在PEG的作用下融合。5.2 HAT 培養(yǎng)篩選細(xì)胞融合后，利用HAT培養(yǎng)基在75cm2的細(xì)胞瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后，利用 包被特異性抗原的免疫磁珠進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞株分離。5.3 免疫磁珠篩選陽(yáng)性細(xì)胞株（1）免疫磁珠與抗原偶聯(lián)具體方法參考免疫磁珠試劑盒。（2）雜交瘤細(xì)胞的洗滌收集雜交瘤細(xì)胞，1500rpm離心3min,利用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌2次，最后 利用無(wú)血清培

6、養(yǎng)基重懸計(jì)數(shù)。（3）免疫磁珠篩選免疫磁珠與雜交瘤細(xì)胞的比例控制在10:1,放在4C共同孵育2h（或者37C 共同孵育30min），此過(guò)程需要不斷的輕輕搖動(dòng)。磁性分離，用DEME洗滌2次。（4）細(xì)胞克隆分離出的雜交瘤細(xì)胞在顯微鏡下計(jì)數(shù)，利用有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞克隆，稀釋 到0.5-1 個(gè)細(xì)胞/孔，轉(zhuǎn)移到 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。（5）ELISA 檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng) 7 天后，利用 ELISA 進(jìn)行檢測(cè)，挑取親和力高的單克隆陽(yáng)性細(xì)胞 株，轉(zhuǎn)移到24孔中培養(yǎng)。（6）細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng) 細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，方法同常規(guī)方法，最終制備腹水。6、免疫磁珠篩選法的優(yōu)點(diǎn)（1）節(jié)約時(shí)間：比常規(guī)ELISA篩選節(jié)約10-20天。（2）

7、得到更多的陽(yáng)性細(xì)胞株：Horton利用對(duì)比試驗(yàn)證明，利用免疫磁珠篩選 法建立的陽(yáng)性細(xì)胞株比常規(guī)ELISA篩選法更多。（3）陽(yáng)性細(xì)胞株分泌抗體的親和力更高：Horton16利用對(duì)比試驗(yàn)證明，利用免 疫磁珠篩選法建立陽(yáng)性細(xì)胞株分泌抗體的親和力比常規(guī)ELISA篩選法的更3）節(jié)約成本：不經(jīng)過(guò)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，直接免疫磁珠篩選陽(yáng)性細(xì)胞株。4）實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加簡(jiǎn)單。7、免疫磁珠篩選法所需要儀器全自動(dòng)磁性分選儀器磁性處理過(guò)程原理就棒廝性顆粒懸海龍性顆粒聚集磁世顆粒I轆附在晦性顆粒倔放制備好的懸液套菅貴的表面磁性處理過(guò)程原理就棒廝性顆粒懸海龍性顆粒聚集磁世顆粒I轆附在晦性顆粒倔放制備好的懸液套菅貴的表面7.1 磁棒工作原理（需要改造）（1）磁珠聚集在磁珠聚集的過(guò)程中，磁棒被套管頭完全包著。磁棒和套管的在試管里緩慢 上下移動(dòng)，磁珠就會(huì)被吸附在套管頭的壁上。然后磁頭和收集到磁珠的套管從試 管移出并轉(zhuǎn)移到下一個(gè)試管。（2）磁珠的釋放收集到磁珠之后，磁棒和套管從試管中移出，放入到下一個(gè)裝有試劑的試管 中。套管以一定的速度上下移動(dòng)幾次后，磁珠就會(huì)從套管壁上落下，和試管中