氨肽酶抑制劑對全反式維甲酸誘導(dǎo)人急性早幼粒白血病細胞株NB4細

1、氨肽酶抑制劑對全反式維甲酸誘導(dǎo)人急性早幼粒白血病細胞株NB4細【摘要】為了研究氨肽酶抑制劑烏苯美司bestatin對全反式維甲酸ATRA誘導(dǎo)人APL細胞株NB4細胞分化作用的影響及其可能機制，NB4細胞經(jīng)bestatin和ATRA單用或結(jié)合應(yīng)用途理一定時間后，用光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測D11b表達，四氮唑藍NBT復(fù)原實驗檢測分化細胞功能，RT-PR法檢測-y和-EBPRNA表達，esternblt檢測-y蛋白表達。結(jié)果顯示：NB4細胞經(jīng)100g/lbestatin和10nl/LATRA結(jié)合處理72小時后，其分化的形態(tài)更明顯；100g/lbestatin與不同濃度ATRA結(jié)合處理7

2、2小時，能增強NB4細胞的NBT復(fù)原才能，與單用相應(yīng)濃度ATRA組相比，差異顯著P0.01；從48-96小時，100g/lbestatin能增強10nl/LATRA誘導(dǎo)NB4細胞的NBT復(fù)原才能，且呈時間依賴性，與相應(yīng)時間點ATRA組相比，差異明顯P0.01；與單用10nl/LATRA組相比，ATRA10l/L)和bestatin100g/l聯(lián)用途理72小時，NB4細胞D11b陽性表達率明顯增加P0.01；與單用10nl/LATRA組相比，聯(lián)用100g/lbestatin處理4小時后，NB4細胞-yRNA表達的降低更明顯P0.05；50、75、100g/lbestatin與10nl/LATRA

3、結(jié)合處理8小時后，NB4細胞-y蛋白表達程度明顯降低，與單用ATRA組相比差異顯著P0.05；藥物聯(lián)用各組NB4細胞-y蛋白表達程度與NBT復(fù)原才能之間呈負相關(guān)r=-0.940，p=0.017；與100g/lbestatin聯(lián)用不能增強10nl/LATRA上調(diào)-EBPRNA的表達；50、75、100g/lbestatin單獨處理對NB4細胞的分化無影響。結(jié)論：氨肽酶抑制劑bestatin可以增強ATRA對NB4細胞的誘導(dǎo)分化作用，這可能與bestatin協(xié)同ATRA下調(diào)-y的表達有關(guān)。【關(guān)鍵詞】細胞株EffetfAinpeptidaseInhibitrnDifferentiatinInduti

4、nAtivityfAll-transRetiniAidinHuanAutePryelytiLeukeiaNB4ellsandItsehanisAbstratThisstudyaspurpsedtinvestigatehetherainpeptidaseinhibitr，bestatin，anptentiateall-transretiniaid(ATRA)-induingdifferentiatininNB4ells，andtexplreitsehanis.TheNB4ellsereexpsedtEitherbestatinandATRAalnerinbinatin，therphlgialha

5、ngesfNB4ellserebservedbyptialirspy，theD11bexpressinaseasuredbyflytetry，thefuntinfdefferentiatinellsasanalyzedbynitrblue-tetrazliu(NBT)redutinassay，theRNAexpressinsf-yand-EBPinNB4ellseredetetedbyRT-PR，the-yprteinexpressinasdeterinedbyesternblt.Theresultsshedthattreatentithbestatinalneinduednsignifian

6、thangesinrphlgy，NBTredutinativityandD11bexpressininNB4ells.NB4ellsinubatedith10nl/LATRAplus100g/lbestatinshedrerphlgifeaturefetayelyteandbandneutrphilthanATRAalnetreatedells.100g/lbestatinenhanedtheNBTredutinativityinNB4ellsinduedbyvariusnentratinsfATRA(10，20，40nl/L).TheeffetsfvariusnentratinsfATRAi

7、nbinatinith100g/lbestatinerestatistiallydifferentfrtheeffetfATRAalne(P0.01).Fr48t96hurs，100g/lbestatintie-dependentlyinreasedNBTredutininNB4ellsinduedby10nl/LATRA(P0.01).10nl/LATRAplus100g/lbestatinfr72hursprinentlyelevatedD11bexpressininNB4ellsasparedithATRAalnetreatedNB4ells(P0.01).Thereasasubstan

8、tialdereasein-yRNAlevelshen100g/lbestatinasaddedt10nl/LATRA(P0.05).Variusnentratins(50，75，100g/l)fbestatinbinedith10nl/LATRAdn-regulatedtheexpressinf-yprtein，hihasnegativelyrrelatediththeNBTredutinativityfNB4ellsinduedby10nl/LATRAalnerplusbestatinatvariusnentratins(r=-0.940，P=0.017).Hever，100g/lbest

9、atinplus10nl/LATRAuldntindueanysignifianthangesinthelevelsf-EBPRNAasparedithATRAalnetreatedNB4ells.ItisnludedthatanainpeptidaseinhibitrbestatinanptentiateATRA-induingdifferentiatinfNB4ells，pssiblybydn-regulating-yexpressininsynergyithATRA.Keyrdsbestatin;ATRA;ellline，NB4;differentiatin氨肽酶抑制劑烏苯美司besta

10、tin能抑制氨肽酶N/D13和亮氨酸氨基肽酶活性，通過增強宿主免疫功能及誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡等發(fā)揮抗腫瘤作用1，2。有研究提示，bestatin可以誘導(dǎo)U937細胞的分化1，國內(nèi)未見報道。我們以NB4細胞為研究對象，通過形態(tài)、功能和外表分化抗原等多層次實驗研究，理解bestatin是否能誘導(dǎo)NB4細胞分化及或?qū)TRA的誘導(dǎo)分化作用的增強效應(yīng)，并初步討論其可能的機理。材料和方法主要試劑Bestatin、ATRA均購于Siga公司。bestatin以無菌去離子水溶解為1g/l，分裝之后-20保存；ATRA以無水乙醇溶解成10-5l/L的儲存液，4避光保存，使用時用RPI1640細胞培養(yǎng)液將其稀釋為相

11、應(yīng)工作濃度。NBT為BBI公司產(chǎn)品，以PBS配成0.1%溶液，過濾除菌后4避光保存，使用前1周內(nèi)配制。RPI1640為Gib公司產(chǎn)品。胎牛血清為JRH公司產(chǎn)品。D11b-FIT標(biāo)記單克隆抗體為Teteh公司產(chǎn)品。D13-PE標(biāo)記單克隆抗體為BetnDikinsn公司產(chǎn)品。TRIzL試劑為Gib公司產(chǎn)品，-LV逆轉(zhuǎn)錄酶和TaqDNA合成酶為Prega公司產(chǎn)品。鼠抗人-y單克隆抗體-33及羊抗人-Atin多克隆抗體I-19均為Santaruz公司產(chǎn)品，使用時以TBST液分別按1500和11000稀釋。EL顯色液為Santaruz公司產(chǎn)品。細胞培養(yǎng)及藥物處理人APL細胞株NB4細胞浙江大學(xué)腫瘤研究所

12、惠贈及人髓細胞白血病細胞株HL-60細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPI1640細胞培養(yǎng)液中，置37、5%2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天傳代1次。實驗時取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整細胞密度為7104/l，以不同濃度ATRA和bestatin單獨或結(jié)合處理，于不同時間搜集細胞進展實驗。細胞形態(tài)學(xué)觀察取空白對照組及藥物處理各組細胞懸液，離心，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，用光學(xué)顯微鏡Leia，4010觀察細胞形態(tài)。四氮唑藍nitrblue-tetrazliu，NBT復(fù)原實驗按文獻3報道的方法進展?？瞻讓φ战M及藥物處理各組細胞與NBT共孵育后，制備涂片，瑞氏-姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下10010觀察，胞漿內(nèi)含有藍黑

13、色顆粒者為陽性細胞，隨機計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞百分率。細胞外表分化抗原D11b和D13的檢測取對數(shù)生長期HL-60細胞和NB4細胞或藥物處理后各組NB4細胞離心，用PBSpH7.4洗滌，調(diào)整細胞數(shù)為2105/50l，加D13-PE標(biāo)記單克隆抗體8l或D11b-FIT標(biāo)記單克隆抗體5l，避光孵育30分鐘，用PBS洗滌，上流式細胞儀檢測。以ellquest1.2軟件進展分析。細胞總RNA提取和RT-PR反響總RNA提取用TRIzL一步法抽提細胞總RNA，按試劑說明書操作。甲醛變性凝膠電泳證實為完好RNA，紫外分光光度儀定量，A260n/280n比值均在1.8-2.0之間。逆轉(zhuǎn)錄反響樣品總R

14、NA4g及隨機引物0.5g，705分鐘，立即冰浴，離心。依次加5逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液5l、10l/LdNTP1.25l、-LV200U，RNase抑制劑0.6l，DEP水補至反響體積為25l，于2710分鐘，3760分鐘，7210分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，冰浴1分鐘，完畢反響。PR反響PR引物為上海Sangn公司合成。引物序列、反響條件及產(chǎn)物大小見表1。反響體系包括逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2l、10PR緩沖液2.5l、25l/Lgl21.5l、10l/LdNTP0.5l、25l/L(-y與-EBP)或2.5l/L(-atin)上游及下游引物各0.5l、TaqDNA聚合酶1U，用滅菌去離子水補至終體積為25l。預(yù)實驗確定產(chǎn)

15、物與循環(huán)之間呈線性關(guān)系范圍。取5l反響產(chǎn)物在15g/L瓊脂糖凝膠含0.5g/l溴化乙錠電泳，電場強度5V/，紫外燈下觀察電泳結(jié)果，用凝膠成像系統(tǒng)BI-RAD公司掃描分析條帶灰度，以目的基因與-atin的灰度比做半定量分析。Table1.Sequenesfpriers，nditinfPRandsizesfPRprduts略esternblt搜集藥物處理各組細胞細胞數(shù)為2106/l，預(yù)冷的PBS漂洗2次，重懸于100lLaiulis上樣緩沖液0.125l/LTris-Hl，pH6.8，4%SDS，5%甘油中，超聲波裂解，于4離心13000g15分鐘，搜集上清，蛋白樣品保存于-80。按蛋白定量試劑盒

16、Bi-Rad公司操作說明書進展蛋白定量，在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜以5%脫脂奶粉封閉1小時，分別與抗人-y和抗人-atin抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗孵育。EL顯色，顯影于膠片。圖像分析處理系統(tǒng)IageStatin2000R掃描，測定條帶的面積和灰度，以二者之乘積進展半定量比較分析。統(tǒng)計學(xué)分析處理各項實驗重復(fù)3次以上，以XD表示，多組間比較F檢驗后采用方差分析及Tukey檢驗。相關(guān)分析采用Pearsn相關(guān)。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進展統(tǒng)計分析。結(jié)果NB4細胞外表有D13的表達NB4細胞D13陽性表達率為94.79%平均熒光強度為1739.59，對照組HL-60細

17、胞D13陽性表達率為95.49%平均熒光強度為3107.49。兩者的D13平均熒光強度有一定的差異，但陽性百分率差異不明顯。Bestatin與ATRA結(jié)合處理后NB4細胞形態(tài)改變明顯100g/lbestatin單獨作用72小時后，NB4細胞形態(tài)無明顯改變。10nl/LATRA單獨作用72小時后，NB4細胞呈現(xiàn)局部分化的形態(tài)，細胞核/漿比例減小，核變小有凹陷。100g/lbestatin與10nl/LATRA結(jié)合處理72小時后，NB4細胞形態(tài)分化更加明顯，細胞漿內(nèi)空泡增多，核凹陷、扭曲更加明顯，形態(tài)似晚幼粒及桿狀核粒細胞的細胞增多圖1。Bestatin與ATRA結(jié)合應(yīng)用后NB4細胞NBT復(fù)原才能

18、明顯增加以一定濃度50、75和100g/lbestatin單獨處理72小時后，NB4細胞的NBT復(fù)原才能無明顯改變與空白對照組相比較，P0.05；不同濃度10、20和40nl/LATRA作用72小時后，NB4細胞的NBT復(fù)原才能呈濃度依賴性增加，與空白對照組相比，差異明顯。100g/lbestatin與不同濃度ATRA結(jié)合處理72小時后，NB4細胞的NBT陽性率明顯地進步，與單用相應(yīng)濃度ATRA組相比，差異顯著表2。Table2.EffetfbestatinntheNBTredutinativityfNB4ellsinduedbyATRA.(略)100g/lbestatin單獨處理細胞不同時間

19、48小時-96小時，NB4細胞的NBT復(fù)原才能改變不明顯與相應(yīng)時間點空白對照組相比，P0.05；10nl/LATRA處理細胞至72小時，開場出現(xiàn)NB4細胞NBT復(fù)原才能的增強，并呈時間依賴性，與相應(yīng)時間點對照組相比，有明顯差異；而10nl/LATRA與100g/lbestatin結(jié)合處理48小時，就出現(xiàn)NB4細胞NBT復(fù)原才能的明顯增強，且此作用隨時間延長而明顯增強，與相應(yīng)時間點單用10nl/LATRA組相比，差異顯著圖2。Bestatin與ATRA結(jié)合處理后NB4細胞D11b表達明顯增強100g/lbestatin單獨處理72小時后，NB4細胞D11b陽性表達率FI為13.40.6稍有增加，

20、但與對照組FI為12.30.9相比，差異不顯著P0.05。10nl/LATRA單獨處理72小時之后，NB4細胞D11b陽性表達率FI為19.24.2明顯進步，與對照組相比，差異顯著P0.01；100g/lbestatin與10nl/LATRA結(jié)合處理72小時后，NB4細胞D11b陽性表達率FI為31.08.4的進步更加明顯，與單用10nl/LATRA組相比，差異明顯P0.01圖3。Bestatin和ATRA單獨及結(jié)合處理后NB4細胞-EBPRNA表達的變化NB4細胞低表達-EBPRNA。10nl/LATRA處理12小時之后，NB4細胞-EBPRNA表達程度明顯進步，與對照組相比較，差異顯著(P

21、0.01)；100g/lbestatin處理12小時之后，NB4細胞-EBPRNA的表達程度無明顯變化；其與10nl/LATRA結(jié)合處理也未能增強ATRA上調(diào)-EBPRNA表達的作用表3。Table3.EffetsfbestatinandATRAnexpressinf-yRNAand-EBPRNAfNB4ells(略)Bestatin和ATRA單獨及結(jié)合處理后NB4細胞-y表達的變化NB4細胞-yRNA呈高程度表達。10nl/LATRA單獨處理4小時后，NB4細胞-yRNA表達下降，與空白對照組相比較，差異明顯P0.05。100g/lbestatin單獨處理4小時后，NB4細胞-yRNA表達程

22、度改變不明顯；但100g/lbestatin與10nl/LATRA結(jié)合處理4小時后，NB4細胞-yRNA表達程度降低更明顯，與單用ATRA組相比，差異顯著P0.05圖4，表3。Figure4.EffetfbestatinandATRAntheexpressinf-yRNAfNB4ellsaftertreatentfr4hurs.:arker;Lane1:ntrl.Lane2:bestatin(100g/l).Lane3:ATRA(10nl/L).Lane4:bestatin(100g/l)+ATRA(10nl/L).NB4細胞-y蛋白呈高表達。10nl/LATRA單獨處理8小時后，NB4細胞-

23、y蛋白表達程度明顯下降P0.01。50、75、100g/lbestatin分別單獨處理8小時后，NB4細胞-y蛋白表達程度無明顯改變；但50、75、100g/lbestatin均能與10nl/LATRA協(xié)同下調(diào)NB4細胞-y蛋白的表達程度，與單用ATRA組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P0.05圖5。不同濃度0、50、75、100g/lbestatin與10nl/LATRA結(jié)合處理的各組NB4細胞-y蛋白表達程度與NBT復(fù)原才能之間呈負相關(guān)r=-0.940，P=0.017圖6。討論ATRA對APL的有效治療是白血病誘導(dǎo)分化治療的成功典范。但單用ATRA治療易復(fù)發(fā)及產(chǎn)生耐藥，與其他化療藥物聯(lián)用時療效有一

24、定的進步，但毒副反響增加。因此，尋找可以增強ATRA誘導(dǎo)分化作用而毒副反響輕的藥物，成為臨床治療中的關(guān)注問題之一7，8。最近，Hiran等7根據(jù)NBT復(fù)原實驗結(jié)果提出，bestatin可能增強ATRA對NB4細胞的誘導(dǎo)分化作用，但未做進一步的研究。本研究通過對細胞形態(tài)、功能和外表分化抗原等多層次的檢測及分析比照，說明一定濃度范圍的bestatin本身不能誘導(dǎo)NB4細胞分化，但確能增強ATRA對NB4細胞的誘導(dǎo)分化作用。Hiran等7認為，bestatin增強ATRA誘導(dǎo)分化作用可能與其抑制細胞外表D13活性有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與HL-60細胞相似，NB4細胞外表D13陽性表達率高達94.79%，該藥是否通過抑制D13表達從而增強ATRA誘導(dǎo)NB4細胞分化的作用，尚待進一步研究證實