細胞生物學研究方法之細胞組分研究課件

1、第二節(jié) 細胞組分的分析方法離心分離技術細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法特異蛋白抗原的定位與定性細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性放射自顯影技術 定量細胞化學分析技術第二節(jié) 細胞組分的分析方法 一. 細胞組分的分離方法差速離心和密度梯度離心離心技術用途： 離心是研究如細胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體等細胞器，以及各種大分子基本手段。一般認為，轉(zhuǎn)速為10000-25000r/min的離心機稱為高速離心機；轉(zhuǎn)速超過25000r/min，離心力大于89K者稱為超速離心機。目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達80000r/min，離心力超過500Kg。是分離細胞器及各種大分子基本手段。（一）差速離心

2、Differential centrifugation沉降系數(shù)（sedimentation coefficient ）： 根據(jù)1924年Svedberg（離心法創(chuàng)始人-瑞典蛋白質(zhì)化學家）：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度大分子沉降速度的量度，等于每單位離心場的速度：s=v/2r。 s是沉降系數(shù)，是離心轉(zhuǎn)子的角速度（弧度/秒），r是到旋轉(zhuǎn)中心的距離，v是沉降速度。 沉降系數(shù)以每單位重力的沉降時間表示：120010-13秒，10-13這個因子叫做沉降單位S，即1S=10-13秒， 差速離心是指低速與高速離心交替進行，使各種沉降系數(shù)不同的顆粒先后沉淀下來，達到分離的目的。沉降系數(shù)差別在一個或幾個數(shù)

3、量級的顆粒，可以用此法分離。沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開。如血紅蛋白的沉降系數(shù)約為4S。大多數(shù)蛋白質(zhì)和核酸的沉降系數(shù)在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上。樣品離心時，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。特點：介質(zhì)密度均一；速度由低向高，逐級離心。用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)

4、網(wǎng)與高基體核蛋白體?？蓪⒓毎鞒醪椒蛛x，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。 Low speedHigh speedDifferential centrifugation離心圖像中表現(xiàn)幾個峰，說明樣品中有幾個組分，每一個峰代表相應組分的沉降界面，因此可以測定每一個組分的沉降系數(shù)值。根據(jù)峰的面積可以測量組分的濃度值 一個對稱的峰形，一般可以認為樣品是離心均一的 （二）密度梯度離心速率區(qū)帶離心,沉降系數(shù)較接近的物質(zhì)分離的方法； 原理：不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。 密度梯度液的制備用梯度混合器，形成由管口到管底逐步升

5、高的密度梯度；介質(zhì)（蔗糖、多聚蔗糖、氯化銫、甘油）介質(zhì)要求：1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高；2）PH中性或易調(diào)為中性；3）濃度大時滲透壓不大；4）對細胞無毒。操作：離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心形成區(qū)帶。離心后不同大小、不同形狀、有一定沉降系數(shù)差異的顆粒在密度梯度液中形成若干條界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶；(1) 密度梯度配制好后, 應十分小心放置, 任何搖動或 溫度驟變都可能破壞梯度的結構; (2) 應把握好加入樣品的體積, 不能超過梯度的分辨能力。直徑是2. 5cm 的離心管, 可加1. 03. 0ml 的樣品。 一般而言, 在較長的梯度柱上鋪較薄的樣品帶, 能獲得較高的分

6、辨率, 具體的加樣量, 還要根據(jù)梯度的斜率、樣品在離心過程中的丟失量及經(jīng)驗來判斷; (3) 加樣也是決定梯度離心效果的重要因素, 要盡量輕 巧, 避免樣品與梯度混合。2.等密度沉降 isopycnic sedimentation用途：分離密度不等的顆粒。特點：介質(zhì)密度高，斜率大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。力場比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速離心。原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentationDNA

7、特異性的顯示方法多糖的顯示方法脂類物質(zhì)的顯示細胞中各種酶的顯示蛋白質(zhì)顯色方法DNA特異性的顯示方法Feulgen反應： 利用酸水解去除細胞中的RNA，僅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脫氧核糖核酸的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基與希夫試劑反應呈紫紅色。多糖的顯示方法PAS（過碘酸希夫氏）反應 利用過碘酸的強氧化作用破壞糖分子的CC鍵，使糖分子氧化產(chǎn)生雙醛基，自由的醛基與希夫試劑作用形成紫紅色產(chǎn)物。脂類物質(zhì)的顯示方法 對脂類物質(zhì)的染色應用的是物理的擴散原理。蘇丹類染料是脂溶性染劑，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以當含有脂肪的標本與蘇丹染料接觸時，它會脫離酒精而溶于脂類結構中從而顯色（

8、深紅）。四氧化鋨:與不飽和脂肪酸反應成黑色， 脂肪滴細胞中各種酶的顯示方法 由于酶易受外界條件影響而變性失活。因此對酶的顯示一般采取間接的方法進行，對可以與酶發(fā)生特異性結合的底物進行染色從而達到顯示酶的目的。因此在實驗的過程中需在盡量保持酶的活性。細胞核紅色，酸性磷酸酶活性部位呈棕黃至棕黑色 蛋白質(zhì)顯色方法（1）茚三酮反應(ninhydrin reaction) 蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的氨基酸可發(fā)生茚三酮反應。除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應生成黃色物質(zhì)外，所有的氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應生成藍紫色物質(zhì)。 氨基酸與茚三酮在弱酸性溶液中共熱，反應后經(jīng)失水脫羧生成氨基茚三酮，再與水合茚三酮反應生成

9、紫紅色，最終為藍色物質(zhì)。脯氨酸等仲胺氨基酸與茚三酮反應生成黃色物質(zhì)。該反應可廣泛用于各種氨基酸的定性或定量測定。三、特異蛋白抗原的定位與定性： 免疫學是研究機體免疫系統(tǒng)組成、結構和功能的一門獨立的前沿學科。 細胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位法：免疫熒光技術和免疫電鏡技術 蛋白質(zhì)體外定性法：免疫印跡、放射免疫沉淀、蛋白質(zhì)芯片和質(zhì)譜分析基于免疫學中抗原抗體特異性反應的原理而設計的。將抗體分子上加上不同的可供識別的標記，從而顯示出某種蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的分布和定位?？乖乖贵w特異性結合免疫熒光標記免疫酶標記常用的熒光素有異硫氰酸熒光素（明亮的黃綠色熒光 ）、羅丹明（呈橘紅色熒光 ）等?？焖?、靈敏、有特異性，但其分辨率

10、有限酶標免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。免疫電鏡技術是免疫化學技術與電鏡技術結合的產(chǎn)物，是在超微結構水平研究和觀察抗原、抗體結合定位的一種方法學。提高分辨率 鐵蛋白免疫電鏡技術： 以鐵蛋白標記抗體，再以鐵蛋白抗體與待檢抗原作用。通過電鏡檢查，觀察到鐵蛋白抗體所在的位置，即抗原所在。免疫酶標技術免疫膠體金技術是以膠體金為標記物，利用特異性抗原抗體反應，在光鏡電鏡下對抗原或抗體物質(zhì)進行定位、定性乃至定量研究的標記技術。膠體金顆粒帶電情況 抗體和金顆粒的耦聯(lián)（圖出處：IV

11、D Technology） 細胞外蛋白質(zhì)的分析蛋白電泳(SDS) 免疫印跡反應(Western-Blot)蛋白質(zhì)芯片質(zhì)譜分析四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性 用核酸探針（放射性元素、熒光素標記）確立特殊核苷酸序列在染色體上或在特殊類型細胞中的位置的方法稱為原位雜交技術(in situ hybridization)。 把凝膠電泳分離開的DNA片段，通過擴散或電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，做成一個凝膠的復制品，這個過程叫做印跡。將硝酸纖維素膜與帶有放射性標記的探針雜交，通過放射自顯影就可以辨認出與探針互補的特殊的核苷酸序列。 利用標記的DNA探針檢測某一特定的DNA序列的方法稱為Southern blo

12、t，檢測特定RNA序列的方法稱為Northern blot。人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片 基因組原位雜交大小麥雜交后代中大麥遺傳物質(zhì)的鑒定以特異序列為探針鑒定rDNA在染色體上的分布 五、應用放射自顯影技術研究生物大分子在細胞內(nèi)的合成動態(tài)原理：將放射性同位素標記的化合物導入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位和半定量研究的一種細胞化學技術。利用同位素的放射自顯影，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究；實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物大分子進行動態(tài)和追蹤研究。一般用14C和3H標記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-

13、UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。14C半衰期為5730年，3H為12.5年。六、定量細胞化學分析技術： 顯微分光光度測定技術和流式細胞儀流式細胞儀原理：待測標本制備成單細胞懸液通過熒光染色后進入充滿鞘液的流動室，鞘液壓力與樣品流壓力是不同的，當二者的壓力差異達到一定程度時，鞘液裹挾著樣品流中細胞排成單列逐個經(jīng)過激光聚焦區(qū)。將細胞中感興趣的部分特異性的標上熒光染料，那麼這些染料將在細胞通過激光檢測區(qū)時受激光發(fā)出特定波長的熒光,通過一定波長選擇通透性的濾色片,我們可將不同波長的散射光、熒光信號區(qū)分開來，并送到不同的光電倍增管中，經(jīng)過一系列的信號轉(zhuǎn)換、放大

14、，數(shù)字化處理，我們就可以在計算機直觀的統(tǒng)計染上各種熒光染料的細胞各自的百分率。 正負不同的電荷，液滴流經(jīng)帶有幾千伏特的偏轉(zhuǎn)板在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，收集容器中從而實現(xiàn)細胞的分離。1、具有操作簡便，只要將染色的單個細胞推入儀器中，就會得出數(shù)據(jù)。2、具有較高的靈敏度及測定速度，而且每次可測出許多數(shù)據(jù)，一般情況下，每秒可測5000個細胞，能迅速分析和記數(shù)大量細胞，并能準確統(tǒng)計群體中熒光標記細胞的比例。3、應用廣泛，即可用于測定細胞活力、繁殖周期和細胞定型分析，也可區(qū)別死亡細胞、分裂細胞和靜止細胞群，既可測定DNA和RNA、測凋亡峰，又可測蛋白含量，特別是胞漿蛋白。G1、G2、S三期 右側(cè)數(shù)字含義：M

15、ean G1=195.4即G1期DNA含量平均值為195.4；%G1=73.6即G1期細胞數(shù)占總數(shù)的73.6%； 顯微分光光度測定技術 利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細胞內(nèi)的含量。 包括：紫外光顯微分光光度測定法 可見光顯微分光光度測定法第三節(jié) 細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術一、細胞的培養(yǎng)動物細胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)細胞（primary culture cell） 傳代培養(yǎng)細胞（sub-culture cell）細胞株（cell strain） 正常二倍體，接觸抑制細胞系（cell line） 亞二倍體，接觸抑制喪失組織培養(yǎng)的意義植物細胞 類型： 原生質(zhì)體培養(yǎng)

16、 （體細胞培養(yǎng)） 單倍體細胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)） Hela細胞（左）、CHO細胞（中國倉鼠卵巢細胞 右）的培養(yǎng)細胞培養(yǎng)： 將動、植物細胞或組織從機體內(nèi)取出分散成單細胞懸液，給予必要的生長條件，讓其在培養(yǎng)基上繼續(xù)生長繁殖的過程。動物細胞培養(yǎng)的基本過程：取材 分離細胞 選擇相同類型的細胞 貼壁培養(yǎng) 傳代（一）動物細胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)（primary culture cell）:培養(yǎng)來自動物機體的細胞群。傳代培養(yǎng)（subculture cell）:原代培養(yǎng)的細胞在生長一定時間以后，就會由于營養(yǎng)成分的消耗、代謝產(chǎn)物的積累以及接觸抑制等因素而停止生長，因此必需將細胞傳到新的培養(yǎng)瓶中去使其繼續(xù)生長。細胞系（cel

17、l line）：原代培養(yǎng)細胞成功傳代即為細胞系。細胞株：原代培養(yǎng)的細胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細胞生長出現(xiàn)停滯，但有極少數(shù)細胞可能渡過危機而傳下去，這些細胞一般又可順利傳代40-50代，并且保持染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制的行為。這種傳代細胞稱為細胞株。細胞系：由細胞株傳至50代后又出現(xiàn)危機不能再傳下去，但是如果有部分細胞發(fā)生了遺傳突變就有可能在體外培養(yǎng)的條件下無限制地傳下去。這些細胞具有癌細胞的特點，這種傳代細胞稱為細胞系。細胞系的特點是染色體發(fā)生明顯變化，失去接觸抑制的特性。實驗室中常用的幾種細胞系細胞系名稱細胞類型來源3T3成纖維細胞小鼠HeLa宮頸癌上皮細胞Henrietta

18、 Lacks BHK21成纖維細胞敘利亞倉鼠PtKl上皮細胞袋鼠L6成肌細胞大鼠PCI2嗜鉻細胞大鼠SP2漿細胞小鼠SP20骨髓瘤漿細胞小鼠CHO卵巢細胞中國地鼠Henrietta Lacks, American black ,died of cancer of uterine cervix in 1951 細胞培養(yǎng)的意義可以在離體條件下觀察研究細胞生命活動的規(guī)律；觀察細胞對于各種生物活性物質(zhì)的反應；通過細胞培養(yǎng)可以獲得大量性狀相同的細胞，是一種良好的實驗材料。（二）植物細胞培養(yǎng)外植體培養(yǎng)：誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織。用于研究植物的生長發(fā)育、分化和變異；進行無性繁殖；制取代謝產(chǎn)物。懸浮細胞培養(yǎng)：適合于進

19、行產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模細胞培養(yǎng)，制取植物代謝產(chǎn)物。原生質(zhì)體培養(yǎng)：培養(yǎng)脫壁后的細胞，特點：比較容易攝取外來的遺傳物質(zhì)，如DNA；便于進行細胞融合，形成雜交細胞；適宜條件下可產(chǎn)生細胞壁，經(jīng)誘導分化成完整植株。單倍體培養(yǎng)：通過花藥或花粉培養(yǎng)可獲得單倍體植株。Plant Cell CultureAnimal Cell Culture (三)、非細胞體系 來源于細胞，而不具有完整的細胞結構，但包含了進行正常生物學反應所需的物質(zhì)（如供能系統(tǒng)和酶反應體系等）組成的體系即為非細胞體系（cell-free system）。 用途：研究DNA復制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、高爾基體的膜泡運輸機制以及細胞核裝配等。 二、細胞

20、工程 細胞工程是一種在細胞水平上運用細胞生物學和分子生物學的方法改變生物遺傳性狀的生物工程。細胞融合(fusion)與細胞雜交(hybridization)技術單克隆抗體（monoclone antibody）技術 細胞拆合與顯微操作技術其它技術 遺傳分析（mutant, knock out, knock in） （一）細胞融合與細胞雜交技術 通過培養(yǎng)和介導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（cell fusion）或細胞雜交。同核體：相同基因型的細胞融合而成。異核體：不同基因型的細胞融合而成。自發(fā)融合：同種細胞在培養(yǎng)過程中自發(fā)合并的現(xiàn)象。誘發(fā)融合：異種間的細胞必須經(jīng)誘

21、導劑處理才能融合。 誘導細胞融合的方法：動物細胞融合： 生物方法（仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒 ）、化學方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（電擊和激光）。植物細胞融合：先用纖維素酶去掉顯微素壁（二）單克隆抗體技術克?。╟lone）：亦稱無性系。指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產(chǎn)生的遺傳性狀一致的細胞群。單克隆抗體技術B淋巴細胞能分泌特異抗體，但不能長期培養(yǎng)，瘤細胞可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌特異抗體。于是Kohler和Milstein 1975將兩種細胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術，獲1984年諾貝爾獎。將免疫淋巴與骨髓瘤細胞融合在一起，形成雜交瘤細胞。這種細胞既能夠像腫瘤細胞那樣長期進行無性繁殖，又能像淋巴細胞那樣分泌抗體。而且由于這種抗體可以是由單一的無性繁殖細胞系的細胞產(chǎn)生的，故又可以稱單克隆抗體。 單克隆抗體制備過程 注射抗原B淋巴細胞骨髓瘤細胞細胞融合、篩選雜交瘤細胞細胞培養(yǎng)篩選，繼續(xù)培養(yǎng)足夠