細(xì)胞生物學(xué)課件：第2章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法

1、1CHAPTER 2細(xì)胞生物學(xué)研究方法 Experimental Approaches for Studying Cells2OUTLINE2.1顯微成像技術(shù)（TECHNIQUES OF MICROSCOPY）2.2 細(xì)胞組分的分析方法（TECHNIQUES OF CYTOCHEMISTRY、 CELL SORTING、 ISOLATION OF CELL COMPONENT） 2.3 細(xì)胞工程技術(shù)（CELL ENGINEERING）2.4 組學(xué)研究技術(shù) (GENOME、TRANSCRIPTOMICS、PROTEOME)32.1 TECHNIQUES OF MICROSCOPY鏡像形成的三要素

2、:照明系統(tǒng) (illumination)樣品(sample)透鏡系統(tǒng) (optics)物鏡: 玻璃 vs 電磁透鏡目鏡： 玻璃 vs 熒光屏 可見(jiàn)光 vs 電子束 Light Electron 光學(xué)顯微鏡 電子顯微鏡(The Light Microscope) (Electron microscope)42.1.1 光學(xué)顯微鏡（The Light Microscope）2.1.1.1技術(shù)參數(shù)：放大率 (magnification, M) M=物鏡放大率 X 目鏡放大率分辨率（resolution, R）:分辨出相鄰兩個(gè)物點(diǎn)間的最小距離R=0.61/NA （:波長(zhǎng)，可見(jiàn)光0.40.7m）顯微鏡的

3、數(shù)值孔徑 (numerical aperture, NA)NA =n sina （n，介質(zhì)折射率; a，鏡口角）? ? ? 最大分辨率a:70n:1.5(油) :450nm(可見(jiàn)光) 200nm(紫外光)52.1.1.2 常用光學(xué)顯微鏡：普通雙筒顯微鏡 (binoular microscope)相差顯微鏡: (phase contrast microscope)微分干涉顯微鏡(differential interference microscope）暗視野顯微鏡(dark field microscope) 熒光顯微鏡(fluorescence microscope)激光共聚焦顯微鏡(lase

4、rconfocalscaning microscope)6倒置顯微鏡正置顯微鏡7相差顯微鏡： (phase contrast microscope)無(wú)色、透明、活細(xì)胞結(jié)構(gòu)環(huán)形光闌（annular diaphragm）相位板（annular phaseplate）標(biāo)本密度不同導(dǎo)致光程差 振幅差 8DIC微分干涉顯微鏡： (differential interference microscope）更強(qiáng)立體感 ，便于顯微操作9暗視野顯微鏡 (dark field microscope) ：物體輪廓，無(wú)微細(xì)結(jié)構(gòu) 丁達(dá)爾現(xiàn)象：光斜射到樣品上10熒光顯微鏡： (fluorescence microscop

5、e)紫外光源激發(fā)細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記染料Excitation Emission11激光共聚焦顯微鏡： (laserconfocalscaning microscope)激光掃描、分辨力提高、可立體三維重建122.1.2 電子顯微鏡 (Electron microscope)電子束波長(zhǎng)比光短100000倍亞顯微結(jié)構(gòu)（超微結(jié)構(gòu)）：R 1nm基本結(jié)構(gòu)電子光學(xué)系統(tǒng)由照明系統(tǒng)、標(biāo)本室、成像系統(tǒng)、觀察窗和記錄用的照相機(jī)等組成；真空系統(tǒng)是保持電鏡的真空度；電子學(xué)系統(tǒng)即供電系統(tǒng)，需要高壓穩(wěn)壓。13電子顯微鏡種類：透射電子顯微鏡：細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)觀察(transmission electron microscope)掃描

6、電子顯微鏡：樣品表面形貌特征觀察 (scanning electron microscope)掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope)微觀世界物質(zhì)表面特征，但樣品必須是導(dǎo)體原子力顯微鏡(atomic force microscope）微觀世界物質(zhì)表面特征，不要求導(dǎo)體，提供三維表面圖，不需樣品處理、常壓及液體環(huán)境中工作；但分辨率低于掃描電鏡142.2 細(xì)胞組分的分析方法2.2.1 細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（cytochemistry） 2.2.2 細(xì)胞分選(cell sorting) 2.2.3 細(xì)胞組分的分離 (isolation of cell component)

7、15酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（酶與底物） 酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)就是通過(guò)酶的特異細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)來(lái)顯示酶在細(xì)胞內(nèi)的定位。免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（抗原抗體）利用免疫反應(yīng)定位組織或細(xì)胞中的抗原成分分布 免疫熒光技術(shù) 免疫電鏡技術(shù)放射自顯影技術(shù) (radioautography)：利用放射性同位素標(biāo)記研究細(xì)胞內(nèi)大分子的合成動(dòng)態(tài)（分布、定位、排出、合成等）其他：DNA、RNA染色: 原位雜交技術(shù) (in situ hybridization)2.2.1 細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（cytochemistry）Cell morphology + cell component analysis162.2.2 細(xì)胞分選 (cell sorting)

8、 流式細(xì)胞術(shù) (Flow cytometry)干涉檢測(cè)器：發(fā)現(xiàn)細(xì)胞熒光檢測(cè)器：發(fā)現(xiàn)標(biāo)記染色體分選(chromosome sorting)172.2.2 細(xì)胞分選 (cell sorting) 流式細(xì)胞術(shù) (Flow cytometry)182.2.3 細(xì)胞組分的分離 (isolation of cell components) 超速離心技術(shù) (Ultra centrifugation)：分離細(xì)胞器與生物大分子及復(fù)合物 速度離心： 差速離心、移動(dòng)區(qū)帶離心等密度離心：density gradient層析分離技術(shù) (High performance liquid chromatography, HP

9、LC)：分離蛋白質(zhì) 凝膠過(guò)濾 (gel filtration)：親和層析 (affinity purification)：離子交換層析 (ion-exchange chromatography )19202.3 細(xì)胞工程技術(shù)（CELL ENGINEERING） 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) (Cell culture)體外細(xì)胞培養(yǎng)的條件營(yíng)養(yǎng) 環(huán)境因素 無(wú)菌環(huán)境、合適的溫度、一定的滲透 壓和氣體環(huán)境、O2和CO2。后者對(duì)于維 持細(xì)胞培養(yǎng)液的酸堿度十分重要。 代謝物和廢物排除原代細(xì)胞 (primary cells)：從機(jī)體分離取出，10 passages細(xì)胞系 (cell line)：原代培養(yǎng)物首次傳代成

10、功后細(xì)胞株 (cell clone) ：?jiǎn)渭?xì)胞克隆CHO細(xì)胞的培養(yǎng)22胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell）體細(xì)胞（somatic cell）和 干細(xì)胞 (stem cell)Yamanaka / Jaenisch四因子實(shí)驗(yàn)Oct4Sox2MycKlf4囊胚顯微注射嵌合體小鼠帶選擇標(biāo)記的成纖維細(xì)胞iPS細(xì)胞移植誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell ,iPSC）24基因敲除示意圖（1）25基因敲除示意圖（2）26 2.3.2 細(xì)胞融合與單克隆抗體272.3.3 基因轉(zhuǎn)染與敲除轉(zhuǎn)染 (transfection)：將具有生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運(yùn)送到細(xì)

11、胞內(nèi)并使核酸在細(xì)胞內(nèi)維持其生物功能敲除 (knockout）:顯微操作術(shù) (micro injection)動(dòng)物細(xì)胞核移植克隆 (Nuclear transfer)轉(zhuǎn)基因鼠及選擇性基因剔除 (transgenic mice and conditional knockout)28細(xì)胞核移植克隆29Knockout Mice The technique used to generate knockout mice was developed in the late 1980s by Marlo Capecchi at the University of Utah. 實(shí)驗(yàn)分三步 構(gòu)建重組載體； 轉(zhuǎn)基因敲除； 篩選。30基因敲除原理312.4 組學(xué)研究技術(shù) (GENOME、TRANSCRIPTOMICS、PROTEOME)GENOME：High throughput DNA sequencingTRANSCRIPTOMICS: Gene expressio