實驗紫外吸收法測定蛋白質含量

1、關于實驗紫外吸收法測定蛋白質含量第1頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三一、 實驗目的：學習紫外分光光度法測定蛋白質含量的原理；熟練掌握紫外分光光度計測定原理及使用方法。第2頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三二、 實驗原理：由于蛋白質中存在著酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸殘基，它們的結構中具有共軛雙鍵，對紫外光有吸收作用，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內吸收峰的光密度值OD280nm與其濃度（范圍是0.11.0mg/ml）成正比關系，280nm的吸光度故可作為蛋白質定量測定的依據(jù)。第3頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三第

2、4頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三本法操作簡便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，低濃度的鹽類不干擾測定，在蛋白質和酶的生化制備及其它研究中應用廣泛，多用于純化之蛋白質的微量測定，尤其是適合于柱層析分離中蛋白質洗脫情況的檢測。核酸在280nm波長下也有一定吸收能力，可能發(fā)生干擾?；煊泻怂釙r必須分別測定280nm和260nm兩處的OD值，然后根據(jù)兩種波長的吸收度的比值，通過經驗公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質的真實含量，再按公式推算蛋白質含量。第5頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三三、 實驗材料、主要儀器和試劑1試驗材料：待測的蛋白質溶液。2

3、 主要儀器：（1）紫外分光光度計（2）試管與試管架（3）移液管3試劑：濃度為1mg/mL標準酪蛋白溶液第6頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三四、操作步驟1標準曲線制作按表1分別向每支試管內加入各種試劑，混勻。以光程為1cm的石英比色杯，在280nm波長處測定各管溶液的光密度值OD280nm。以蛋白質濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪出標準曲線。第7頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三2樣品測定： 取待測蛋白質溶液1mL，加入蒸餾水9mL，混勻，按上述方法測定280nm的光密度，并從標準工作曲線上查出待測蛋白質溶液的濃度。第8頁，共16頁，2022年

4、，5月20日，22點18分，星期三第9頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三分光光度計的使用第10頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三分光光度計的分類分光光度計的分類紅外分光光度計:可見光分光光度計:紫外分光光度計:測定波長范圍為大于760 nm的紅外光區(qū) 測定波長范圍為400760 nm的可見光區(qū)測定波長范圍為200400 nm的紫外光區(qū)第11頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三分光光度計的基本結構 無論哪一類分光光度計都包括 ：光源、單色器、吸收池、檢測器和測量儀表。分光光度計各部件的次序如圖所示: 5個基本部件第12頁，共1

5、6頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三紫外分光光度計 1光源：鎢燈或鹵鎢燈可見光源 400760nm氫燈或氘燈紫外光源 200400nm 2單色器：把混合光波分解為單波長光的裝置3吸收池（比色皿） ：玻璃能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)石英不能吸收紫外光，適用于紫外和可見光區(qū)4檢測器：將光信號轉變?yōu)殡娦盘柕难b置5記錄裝置：訊號處理和顯示系統(tǒng)第13頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三紫外可見分光光度計使用方法（1）（1） 測試準備 儀器預熱30min后方可進行測試。 將盛有“空白”或“對照”溶液的比色皿處于試樣室光路位置； 選擇波長 確定光源 （2）測試過程 數(shù)字

6、顯示透光度“100.0”(或吸光度“0.00”)23s后，將盛有標準溶液的比色皿移至光路 將盛有樣品溶液的比色皿移至光路，記錄該樣品的數(shù)據(jù)。待第一個樣品數(shù)據(jù)記錄完畢后，將第二個樣品置于試樣室光路，若有多個樣品，操作以此類推。第14頁，共16頁，2022年，5月20日，22點18分，星期三分光光度計使用注意事項 （1） 預熱是保證實驗結果準確可靠的必要步驟，不可忽略。 （2） 在波長320nm以下的實驗范圍一定要選用石英比色皿，絕不可以玻璃比色皿替代。 （3）比色皿的清潔程度，直接影響實驗結果。因此，特別要將比色皿清洗干凈。先用自來水將用過的比色皿反復沖洗，然后用蒸餾水淋洗，倒立于濾紙片上，待干后再收回比色皿盒中。必要時，還要對比色皿進行更精細的處理，如用濃硝酸或鉻酸洗液浸泡、沖洗。 （4）比色