枸杞基因組DNA提取及指紋圖譜分析

1、枸杞基因組DNA提取及指紋圖譜分析【關鍵詞】枸杞；,基因組DNA；,RAPD；,指紋圖譜摘要：目的建立一種適于RAPD分析的快速提取枸杞葉片基因組DNA的方法，并利用RAPD技術研究枸杞屬植物基因組DNA指紋圖譜。方法采用改良的TAB法提取枸杞冷藏幼葉的基因組DNA，利用RAPD技術對其進展指紋圖譜分析。結果改良的TAB法提取的10份枸杞材料基因組DNA均適于RAPD分析；可提供明晰的RAPD指紋圖譜，利用挑選出的2個隨機引物對供試材料DNA進展隨機擴增，共得到56條帶，其中多態(tài)性條帶44條，多態(tài)性百分率為78.6%。結論說明改良的TAB法提取的枸杞基因組DNA不需經氯化銫梯度離心或柱層析純化

2、，可以直接用于RAPD分析；RAPD對枸杞屬植物進展指紋圖譜分析是可行的。關鍵詞：枸杞；基因組DNA；RAPD；指紋圖譜ExtratinfGeniDNAfrLyiubararuandItsFingerprintAnalysisAbstrat：bjetiveTdevelpvalidethdtextratDNAfrLyiubararufrRAPDanalysisandresearhitsDNAfingerprintbyusingRAPDtehnlgy.ethdsTheextratsfhighqualitygeniDNAasextratedfrthefrzenleavesfLyiubararubyd

3、ifiedTABethdanditsfingerprintasanalyzedbyRAPD.ResultsThelearfingerprintsftheextratsfgeniDNAuldbegtbyRAPD.TRAPDpriersereappliedtdrandaplifiatin.Attalf56DNAbandsasdeteted,44anghihereplyrphi,theaverageratefplyrphibandsas78.6%.nlusinThedifiedTABethdasvalid,quikanddidntneedphenlextratin.ThisislatedDNAuld

4、beuseddiretlyfrRAPDanalysisithutsedientatininesiuhlridegradientrlunhratgraphy.TheRAPDarkersanbeusedfrthestudiesffingerprintfLyiubararusensitively.Keyrds：Lyiubararu;GeniDNA；RAPD；FingerprintRAPD由illias和elsh兩個研究小組幾乎同時于1990年建立起來的一項分子標記技術1,2，是目前中藥研究者最常使用的DNA標記技術。RAPD標記所需樣品基因組DNA的量僅為10ng，且RAPD引物已商品化消費。因此，

5、它可以在不知道特異DNA序列的情況下檢測DNA的多態(tài)性，尤其在目前絕大多數(shù)動、植物中藥材DNA序列尚不清楚的情況下，在中藥品種研究方面RAPD標記比其它分子標記更具有廣闊的應用前景3。雖然DNA分子標記技術在枸杞屬植物鑒定等方面已有一些報道，張艷波等4搜集了6種枸杞屬植物，其中2個正品，4個混淆品種，運用RAPD技術進展分析，獲得了枸杞屬不同種的特異性DNA指紋圖譜，從而將它們準確區(qū)別。鄭可大等5搜集了20個臺北市場枸杞商品，運用RAPD技術進展分析，獲得了2個DNA指紋圖譜類型，推測其中15個是正品枸杞，5個混淆品。魏玉清等6對寧夏不同地區(qū)主栽枸杞品種利用RAPD技術進展了鑒別。但目前分子標

6、記用于枸杞屬植物研究的種類和數(shù)量都非常有限，本實驗所選的局部枸杞材料未見有RAPD研究報道。獲得高質量的DNA樣品是進展RAPD分析的首要步驟。目前，有許多植物基因組DNA提取方法79。要用于RAPD分析，DNA提取步驟越少越好，能減少對DNA的破壞；多步驟、多種試劑容易引起DNA的破壞和污染，從而影響PR反響及PR擴增產物的結果分析。關于從枸杞果實中提取基因組DNA有一些報道4,510,11，而有關從枸杞葉片中進展基因組DNA提取與PR分析的詳細研究尚未見報道。枸杞(Lyiubararu)葉內多糖等物質含量較高，這些次生物質與DNA形成復合物，這種DNA不能用于PR擴增。為理解決這個問題，最

7、理想的方法是用氯化銫梯度離心或柱層析純化DNA，但此法昂貴、費時，且需大量試材。本研究力圖通過實驗建立一種簡易的提取枸杞葉片基因組DNA的方法，并對其進展RAPD鑒定，從而在此根底上進展RAPD指紋圖譜分析。1材料與方法1.1材料實驗所用的10份材料及來源見表1野生枸杞為野外獲得的一棵外形不同于寧夏主栽品種的植株。表1材料名稱略1.2儀器與試劑PR儀PT200TPeltierTheralyler，JResearh，In，USA；電泳儀DYY10型；北京六一儀器廠；電泳槽DYp31型；北京六一儀器廠；SartSpeT3000核酸蛋白測定儀BIRADLab，In，USA；Eppendrf5415D

8、離心機；UVPGDS8000凝膠成像系統(tǒng)。Buffer，TaqDNA聚合酶，dNTPs，gl2，300bpDNAladder購自北京天為時代公司，10堿基隨機引物購自上海生工生物工程，AgarsePrega公司，EB瑞士Flukaheika公司。1.3方法1.3.1基因組DNA提取采用TAB法1215，并適當改良。詳細步驟為：枸杞幼葉在液氮中研磨至無可見組織塊后裝入1.5l的Eppendrf管中大約1/3體積，參加500l提取緩沖液含100l/LTrisHlpH8.0，20l/LEDTA,1.4l/LNal，2%TAB，0.2%巰基乙醇，混勻，65溫育30in，取出立即放入冰中冷凍10in。參

9、加500l的氯仿異戊醇241，混勻，于4冰箱中冷凍10in，12000r/in離心10in，轉移上清液于干凈的1.5l的Eppendrf管中，重復1次。參加300500l的異丙醇或1l的無水乙醇混合，于-20下靜置20in。12000r/in離心15in，棄上清液，先參加70%乙醇洗沉淀兩次去除有機溶劑、無機鹽等，然后參加無水乙醇脫水，室溫枯燥。將枯燥DNA溶解于200l的ddH2或TE緩沖液含10l/LTrisHl，1l/LEDTA，pH8.3做母液于-20儲存。將DNA母液取出10l稀釋40倍后，用SartSpeT3000核酸蛋白測定儀測波長260，280及320n處光吸收，直接從儀器主屏

10、上讀出被測樣品A260，A280，A260/A280和DNA含量。點6上樣緩沖液10l于玻璃板上，分別汲取各材料DNA母液2l與其混勻，然后在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳72v電壓下電泳30in，檢驗DNA片段大校最后將DNA母液稀釋為20ng/l的工作液分裝成小包裝于-20儲存或4保存?zhèn)溆谩?.3.2PR擴增及電泳檢測反響在PT200型PR儀上進展。采用本實驗室長期使用的20l反響體系，其成分為：10Buffer不含g2+加0.8l25lL-1g2+，1l2.5dNTPs，1UTaqDNA聚合酶，1l0.37510堿基隨機引物，50ng模板。反響程序：預變性942in；預擴增程序：9420s，3

11、630s，721in，5個循環(huán)；擴增程序：9420s，4030s，721in，40個循環(huán)；然后72延伸10in，最后4保存。擴增產物經含有0.5g/lEB的1.4%瓊脂糖凝膠電泳別離72v電壓下電泳45in，電泳完畢后在UVPGDS8000凝膠成像系統(tǒng)上觀察照相。1.3.3RAPD隨機引物挑選用一種材料做完20個引物后，去除只擴增出3條帶以下或沒有條帶的引物，再用另一種材料依次挑選下去。挑選出多態(tài)性較強、重現(xiàn)性好的引物2個S331：5TAGTGA3和S2063：5GAGGAA3。2結果2.1改良的TAB法成功提取了枸杞葉片基因組DNA本實驗在參考TAB法根底上適當改良，成功提取了枸杞基因組DN

12、A，該方法不需飽和酚抽提、氯化銫梯度離心和柱層析純化，可直接用于RAPD分析。2.2枸杞基因組DNA質量檢測采用改良的TAB法所提枸杞的DNA顏色為透明的白色、干后無色。點樣孔110分別對應110號供試材料圖1枸杞基因組DNA電泳圖略由圖1可看出，枸杞基因組DNA經電泳檢測在點樣孔附近呈一條亮且集中的條帶，說明DNA未降解；亮帶前面的條帶經RNase處理后不再存在，說明這些條帶為RNA。表2基因組DNA純度及含量檢測略由表2可看出，波長260n和280n光吸收比值在2.082.53之間，DNA含量在7122870g/l之間。2.3模板濃度對擴增結果的影響我們實驗室長期使用50ng/20l體系的

13、模板DNA濃度，RAPD標記所需樣品基因組DNA的量僅為10ng3，于是我們設計了10ng/20l體系、20ng/20l體系、50ng/20l體系3個模板濃度對擴增結果的影響。本實驗用了1個挑選過的隨機引物S1：5GTTTGT3S3：5對3種材種2號寧杞1號、4號血杞1號和5號精杞1號材料進展?jié)舛忍荻仍囼?。由圖2可知，反響體系中模板DNA濃度為1050ng/20l體系時擴增結果沒有明顯區(qū)別；由于實驗室習慣，我們選用了50ng/20l體系的模板DNA濃度。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.圖2不同模板DNA濃度擴增結果略2.4枸杞基因組DNA指紋圖譜分析2.4.1挑選的2個隨機引物對10份材料基因組DNA的

14、擴增由于RAPD隨機引物10個堿基太短，而且退火溫度較低3640，很容易造成錯誤配對，再加上各種試劑的質量和濃度差異，造成擴增出現(xiàn)假陽性帶型和結果的不穩(wěn)定。因此，在本實驗利用RAPD技術時，筆者首先對實驗室長期使用的反響體系進展了優(yōu)化，然后以10份供試材料的DNA為模板，運用挑選出的2個RAPD引物分別擴增，擴增結果如圖34所示，擴增出的DNA帶的分子大小在5002500bp之間；2個引物擴增的條帶數(shù)量以及區(qū)分10份供試材料6類，野生枸杞不計入的區(qū)分率均存在差異，2個引物擴增6類材料的條帶數(shù)量分別為23條和33條，平均每個引物擴增28條帶；擴增的具有多態(tài)性的條帶分別為17條和27條，平均每個引

15、物擴增22條具有多態(tài)性的帶，其統(tǒng)計分析結果如表3所示，從表3統(tǒng)計結果可知，區(qū)分6類供試材料的區(qū)分率分別83.3%S331不能區(qū)分2和3和66.7%S2063不能區(qū)分2和3及4和9，平均為75%。兩個引物共擴增出56條明晰條帶，其中44條具有多態(tài)性，多態(tài)性比率PPB達78.6%。2.4.2指紋圖譜解析由圖3、圖4和表3可知，運用挑選出的S331和S2063兩個引物僅不能區(qū)分2和3寧杞1號和寧杞2號。雖然引物S331擴增的條帶數(shù)量和具有多態(tài)性的條帶數(shù)量均比S2063的少，但引物S331擴增條帶的明晰度比S2063的要好，且區(qū)分6類供試材料的區(qū)分率比S2063的高，擴增出現(xiàn)假陽性帶型和結果不穩(wěn)定性的

16、機率大大減少，綜合各種結果可看出，引物S331比S2063的擴增效果要好。從圖34可知，2，6，7和8不同地方的寧杞1號指紋圖譜一致，2和3僅在S331擴增出的500bp處共有帶的亮度不同，不能有效地進展區(qū)分，其它種類可以有效地進展區(qū)分，說明RAPD技術用于不同品種枸杞的鑒別是有效的。：300bpDNAladder2500，2000，1500，1000，500，300K：陰性對照不加模板DNA點樣孔110分別對應110號供試材料圖3引物S331擴增10份DNA樣品的結果略：300bpDNAladder2500，2000，1500，1000，500，300K：陰性對照不加模板DNA點樣孔110分

17、別對應110號供試材料圖4引物S2063擴增10份DNA樣品的結果略表3擴增譜帶情況分析略3討論3.1植物藥中的小分子次生代謝產物如萜類、黃酮、香豆素、有機酸、鞣質等含有酚羥基的化合物，氧化后易與DNA結合，引起DNA降解或抑制酶的活性，而植物中存在的多糖類由于與DNA同屬大分子化合物，一般提取過程很難去除干凈，也可能影響DNA的進一步酶處理或PR擴增16。采用改良的TAB法對枸杞幼葉基因組DNA進展提取，經電泳檢測，紫外吸收檢測及RAPD分析發(fā)現(xiàn)，改良后的TAB法合適枸杞幼葉基因組DNA提齲采用該法提取的基因組DNA枯燥時呈透明的白色，溶于水或緩沖液中無色，說明TAB除色素及次生代謝物效果好

18、。TAB是一種去污劑，既能裂解細胞又能有效地沉淀次生代謝物，特別是多糖。由于提取過程未用RNase處理，10份材料基因組DNA的A260/A280均大于2.00，但對上述10份材料DNA樣品進展RAPD分析，能獲得好的結果圖24。由實驗結果可見，枸杞RAPD分析所用的DNA，無需復雜的純化過程，只需簡單的氯仿異戊醇241抽提，并且不需去除RNA，但研磨要充分?？梢姡捎酶牧糡AB法提取枸杞幼葉基因組DNA，步驟簡單，合適進展RAPD分析用，防止了使用苯酚這種有毒試劑。3.2RAPD技術本身存在多態(tài)性少和重現(xiàn)性的缺點17，對此缺點筆者在實驗設計的時候就已經考慮到了。挑選引物時筆者用了3種枸杞材料

19、，選出在3種枸杞材料中均有3條以上條帶、并且重復23次均能擴增出一樣結果的引物進展擴增。選出的引物在一定程度上可以作為枸杞屬植物的通用引物，本實驗根本上證實了這一點?？紤]到枸杞變異較大，中間類型很多，種的界限不清楚，對有些種和品種的形態(tài)學分類操作者存在著客觀和主觀的原因等因素，本實驗所用候選引物的數(shù)量還不夠多，可以再增加，這在一定程度上可以減少實驗結果分析的誤差，以及種和品種間遺傳多樣性所產生的影響。3.3隨著分子標記技術的開展，各種新的標記技術不斷產生，假如要科學、準確地對植物的基因組DNA進展指紋圖譜分析，進而對植物的遺傳多樣性和親緣關系進展研究還得運用多種分子標記技術，將每一種標記的結果

20、和傳統(tǒng)的分類結果進展全面的比擬和分析才能獲得令人信服的結果。但由于對枸杞屬植物的遺傳背景理解不多，運用RAPD技術對其基因組DNA進展指紋圖譜分析從而進展道地品種的鑒別、遺傳多樣性及親緣關系的研究是目前最有效的方法。3.41野生枸杞和2，6，7，8不同地方的寧杞1號指紋圖譜一致，說明野生枸杞可能是寧杞1號，其植株外形不同于寧夏栽培的寧杞1號可能是受環(huán)境的影響發(fā)生了形態(tài)變異。參考文獻：1illiasJG,KubelikAR,LivakKJ,etal.DNAplyrphissaplifiedbyarbitrarypriersareusefulasgenetiakersJ.NulEiAidsRes,

21、1990,25(18)：6531.2elshJ,lelland.FingerprintinggenesusingPRitharbitrarypriersJ.NulEIAidsRes,1990,25(18)：7213.3曹暉，劉玉萍.分子標記技術在中藥品種鑒別中的應用J.中國藥學雜志,1998，335：269.4ZhangKYB,LeungH,YeungH,etal.DifferentiatinfLyiubararufritsrelatedLyiuspeiesusingrandaplifiedplyrphiDNAJ.Plantaed,2001,67：379.5hengKT,hangH,HuangH,etal.RAPDanalysisfLyiubararuediineinTaianarketJ.BtBullAadSin,2000,41：11.6魏玉清，許興，王掌軍等.寧夏不同地區(qū)主要栽培枸杞的RAPD分析J.西北農林科技大學學報自然科學版，2022，181：60.7王培訓,周聯(lián),賴小平.分子生物學技術與中藥鑒別RAPD技術的研究與應用.廣州：廣東世界圖書出版，2002：94.8周延清.DNA分子標記技術在植物研究中的應用.北京：化學工業(yè)出版社，2022：1