Western blot、蛋白質(zhì)雙向電泳的原理、方法及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 (最終版)

1、Western blot 、蛋白質(zhì)雙向電泳的原理、方法及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用湘雅醫(yī)學(xué)院精神醫(yī)學(xué)1301班2CONTENTS蛋白質(zhì)雙向電泳的原理應(yīng)用蛋白質(zhì)雙向電泳的方法234Western blot原理及方法13Western blot原理及方法蛋白質(zhì)印跡法14Western blotting19751979同年最終Edward M. Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜 （NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段的方法McMaster和Carmichael對RNA進行印跡分析，發(fā)明 Northern印跡技術(shù) George Stark對電泳后的蛋白質(zhì)分子進行印跡分析從而發(fā)明w

2、estern印跡技術(shù) Western blotting！5 什么是蛋白質(zhì)印跡法 ？ Westernblot法 是凝膠電泳技術(shù)、固定化技術(shù)及分子親和技術(shù)三者融為一體的綜合性技術(shù)，其核心在于把凝膠已分離的區(qū)帶并印跡于固化紙上，可分為電泳、轉(zhuǎn)印、酶免疫測定3個階段。Westernblot法 結(jié)合了電泳的高分辨率和酶免疫測定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣本組分的免疫學(xué)測定的方法。6 為什么要作蛋白質(zhì)印跡實驗 ？2不同的樣品中檢查蛋白質(zhì)的表達情況，上調(diào)或下調(diào)表達，如疾病和正常的樣品之間的表達差異性1研究一些體外的蛋白質(zhì)分子，尋找目的蛋白是否存在樣品當(dāng)中 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至

3、一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。 Western Blot的基本原理 蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗孵育二抗孵育底物顯色 Western Blotting 操作流程9 第一步轉(zhuǎn) 膜 第三步一抗雜交 第五步底物顯色 第四步二抗雜交 第二步封 閉 Western Blotting 操作流程優(yōu)點：1.快速（一種抗體）2.沒有二抗交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶缺點：1.免疫反應(yīng)性降低2.無信號二級放大3.抗體標(biāo)記費時昂貴,使用不方便 Western Blotting 方法一: 直接法優(yōu)點：1. 免疫特異性不受標(biāo)記影響2. 信號放大靈敏度高（多個二抗結(jié)合位點）3. 多種標(biāo)

4、記的二抗可供選擇4. 可選擇不同的Marker缺點：1. 交叉反應(yīng)引起的非特異性條帶2. 額外的二抗孵育以及條件優(yōu)化 Western Blotting 方法二: 間接法直接法與用二抗的間接法相比有諸多不足，標(biāo)記可用于很多種不同特異性的一抗，避免了標(biāo)記很多一抗的需要，同時因為一抗結(jié)合不知一個二抗分子，所以二抗可以增強信號，所以一般情況下都采用間接法進行檢測 為什么一般情況下都采用間接法進行檢測？ Western Blotting間接法操作流程分子量標(biāo)準(zhǔn)顯色結(jié)果抗體膜的選擇 Western Blotting 設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)15 不可小看“蛋白標(biāo)準(zhǔn)”-分子量標(biāo)準(zhǔn)的選擇分子量標(biāo)準(zhǔn)預(yù)混分子量標(biāo)準(zhǔn)修飾分子量標(biāo)準(zhǔn)

5、預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)預(yù)混分子量標(biāo)準(zhǔn)高分子量標(biāo)準(zhǔn)低分子量標(biāo)準(zhǔn)寬分子量標(biāo)準(zhǔn)預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)單色預(yù)染多色預(yù)染修飾分子量標(biāo)準(zhǔn) 糖基化 磷酸化 熒光標(biāo)記 不可小看“蛋白標(biāo)準(zhǔn)”-分子量標(biāo)準(zhǔn)的選擇高分子量標(biāo)準(zhǔn)低分子量標(biāo)準(zhǔn)寬分子量標(biāo)準(zhǔn) 預(yù)混分子量標(biāo)準(zhǔn)單色預(yù)染多色預(yù)染 預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)糖基化磷酸化熒光標(biāo)記 修飾分子量標(biāo)準(zhǔn)價格便宜，簡單快速封閉與非特異性抗體結(jié)1.硝酸纖維素膜（NC膜）靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，對蛋白的吸附能力要遠遠大于NC膜2.PVDF膜對核酸和蛋白質(zhì)具有很強的結(jié)合能力，能代替NC膜用于分子印跡和雜交實驗。3.尼龍膜 膜三種選擇 選擇標(biāo)準(zhǔn)1.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能

6、結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?.不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）3.后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜 選擇膜的標(biāo)準(zhǔn) 膜的特點作為western來講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價格偏高，所以一般來說多抗足夠了。用于western的抗體和用于ELISA的抗體，一般來說用于western的抗體識別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。做免疫印跡時選擇抗體主要應(yīng)考慮兩個問

7、題，一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一個是所選抗體是否會引起交叉反應(yīng)條帶。 抗體的選擇方便、便宜、靈敏度較低、費抗體、反應(yīng)慢、線性窄、不易保存、不能重新剝離檢測化學(xué)顯色法靈敏度高、不安全、環(huán)境污染、不方便和半衰期短同位素法靈敏、快速、節(jié)省抗體、反應(yīng)快、線性寬、無害、特異性高、可重新剝離檢測化學(xué)發(fā)光法Krypton 熒光底物熒光底物法顯色的方法玩轉(zhuǎn)大學(xué)PPT素材 更多好素材請訪問 25蛋白質(zhì)雙向電泳的原理Enter your subtitle here226 雙向電泳的實驗原理第一向：等電聚焦第二向：SDSPAGE電泳第一向：等電聚焦聚丙烯酰胺是由單體丙烯酰胺(Arc)和

8、交聯(lián)劑N,N-甲叉丙烯酰胺(Bis)在加速劑N,N,N四甲基乙二胺（TEMED）和催化劑硫酸銨（AP）或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為PAGE。 第二向：SDSPAGE電泳3031蛋白質(zhì)雙向電泳的方法Enter your subtitle here332技術(shù)流程雙向電泳(2DE/DIGE)實驗組和對照組樣品制備提出生物學(xué)問題凝膠圖像分析差異蛋白點選取蛋白酶解及質(zhì)譜分析差異蛋白點的成功鑒定生物學(xué)問題的解釋目前進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的最常規(guī)實驗技術(shù)能實現(xiàn)多達10000種不同蛋白質(zhì)進行分離分析 雙向電泳(2DE/DIGE)等電聚焦，實現(xiàn)蛋白質(zhì)按等電點進行分離分子量大小

9、通過雙向電泳使得不同等電點和分子量的蛋白質(zhì)根據(jù)其自身特性分布到凝膠的不同位置從而實現(xiàn)蛋白質(zhì)的雙向分離SDS分離，使得蛋白質(zhì)按分子量大小排序 雙向電泳（2DE）示意圖硝酸銀染色圖譜考馬斯亮藍染色圖譜 2DE圖譜將標(biāo)記的樣品混合雙向電泳分離熒光掃描儀掃描圖像重疊分析樣品1：Cy3標(biāo)記 雙向電泳（DIGE）示意圖 DIGE圖譜雙向電泳的最關(guān)鍵步驟之一制備原則：盡可能多地提取出總蛋白質(zhì)，盡可能簡單的操作步驟，注意防止樣品提取過程中的各種化學(xué)修飾，去除樣品中核酸、鹽離子等干擾物質(zhì) 樣品制備變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和

10、硫尿。表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑Triton X-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進行還原。 增加樣品溶解性的手段起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點時會發(fā)生

11、沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2（w/v)。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實驗的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。通過10000V高壓使得蛋白質(zhì)按照其等電點特性進行聚焦步驟：膠條水化、低壓除鹽、高壓聚焦、低壓維持聚焦時間：聚焦時間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋，過長會造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時間的確定需要根據(jù)蛋白樣品類型、蛋白載樣量、PH范圍和膠條長度來確定。 等電聚焦理想顯色劑的7S安全（safety）

12、靈敏（sensitivity）簡單（simplicity）特異性（specificity）快速（speed）穩(wěn)定（stability）兼容性（synergy） 蛋白檢測硝酸銀染色 優(yōu)點：靈敏度高， 缺點：重復(fù)性差，質(zhì)譜兼容性低考馬斯亮蘭染色： 優(yōu)點：重復(fù)性好，質(zhì)譜兼容性高 缺點：靈敏度低熒光染色： 優(yōu)點：重復(fù)性好，質(zhì)譜兼容性高、靈敏度高 缺點：價格貴其它染色方法： 胺基黑染色、印度墨水染色、金屬鹽負(fù)染等 蛋白檢測常用軟件： Image-Master (GE Healthcare) PDquest (Bio-Rad)分析步驟：膠點檢測和定量、凝膠匹配、比較分析 圖像分析凝膠圖像的掃描：圖像加工：

13、 斑點檢測和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋：2-DE數(shù)據(jù)庫的建立： 凝膠的圖像處理分析和典型流程47 應(yīng)用Western blot及蛋白質(zhì)雙向電泳4aboutWestern Blot的醫(yī)學(xué)應(yīng)用Western blot法診斷囊蟲病應(yīng)用熒光定量PCR 和Western- blot 檢測RNA干擾肺腺癌A549 細胞STAT3基因表達水平 Western-blot法測定風(fēng)疹病毒特異性抗原 Western Blot的三大醫(yī)學(xué)應(yīng)用1、Western blot法診斷囊蟲病囊蟲病是由豬帶絳蟲幼蟲即囊尾蚴寄生于人體引起的人獸共患寄生蟲病。免疫學(xué)試驗對本病診斷有重要作用，但目前用各種方法純化的抗原其敏

14、感性、特異性均不理想。運用DN A重組技術(shù),構(gòu)建來源于豬囊尾蚴的cDNA表達文庫,以囊蟲病患者血清及病豬血清為抗體,從中篩選出4個特異性抗原（cC1、cC2、cP1、cH1）,這些抗原克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo),形成-半乳糖苷酶-豬囊尾蚴特異性抗原的融合蛋白( fusion protein, FP)。采用簡化Western blot法,以等比混和的四種融合蛋白為抗原檢測囊蟲病、華支睪吸蟲病、包蟲病患者血清中的相應(yīng)抗體2、應(yīng)用熒光定量PCR 和Western- blot 檢測RNA干擾肺腺癌A549 細胞STAT3基因表達水平 Western印跡分析檢測STAT3表達熒光定量PCR 檢測STAT3mRN

15、A 的表達凋亡相關(guān)蛋白的表達 Western Blot 檢測發(fā)現(xiàn)Western Blot 檢測 SZL 作用 48 h 后凋亡相關(guān)蛋白表達的變化Bandleader 軟件分析凋亡相關(guān)蛋白的相對表達率 Western Blot 檢測結(jié)果的密度分析掃描直方圖 (凋亡相關(guān)蛋 白相對表達率 = 條帶灰度值 /actin 灰度值)3、Western-blot法測定風(fēng)疹病毒特異性抗原風(fēng)疹病毒() 能夠引起先天感染。通過孕婦傳播,致使胎兒先天畸形或?qū)е孪忍煨燥L(fēng)疹綜合征如先天性心臟病、智力低下等。因此能夠早期快速診斷對于優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì) 、預(yù)防后天及再感染具有重要意義。目前臨床上所用的ELISA 檢測試

16、劑盒所包被抗原為全細胞粗制抗原 , 特異度低、靈敏度差,缺乏統(tǒng)一的抗原標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)可采用Western-blot的方法,測定風(fēng)疹病毒的主要抗原性蛋白, 以指導(dǎo)臨床應(yīng)用 。 雙向電泳技術(shù)的應(yīng)用04part030201計算機圖像分析與大規(guī)模數(shù)據(jù)處理技術(shù)雙向電泳技術(shù)(2-DE)質(zhì)譜技術(shù) 研究蛋白質(zhì)組的三大核心技術(shù):雙向電泳技術(shù)(2-DE)在蛋白質(zhì)組學(xué)中發(fā)揮著重要的作用,可用于研究樣品總蛋白、不同樣品蛋白質(zhì)表達差異、蛋白質(zhì)間相互作用、蛋白質(zhì)修飾等。作用1雙向電泳技術(shù)在病原微生物蛋白質(zhì)組研究中的進展雙向電泳技術(shù)在病原微生物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用，可用于研究樣品總蛋白、不同樣品蛋白質(zhì)表達差異、蛋白質(zhì)問

17、相互作用、蛋白質(zhì)修飾等。病原微生物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，可以了解其毒性因子、致病機理以及藥物抗性等方面，對疾病的診斷、治療和預(yù)防非常重要。0102通過雙向電泳技術(shù)分析對培養(yǎng)基和細胞內(nèi)生長的細菌進行比較，發(fā)現(xiàn)感染巨噬細胞的軍團菌、布魯氏菌、沙門氏菌中分別有一些特殊蛋白被誘導(dǎo)或被阻遏。蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)可作為致病微生物臨床隔離群區(qū)分的可靠參數(shù)之一。在對流感嗜血桿菌研究中發(fā)現(xiàn)，實驗室培養(yǎng)的和臨床分離的遺傳背景相同的菌株出現(xiàn)了新的ORF，對臨床分離株NCTC8143進行雙向電泳，發(fā)現(xiàn)色氨酸酶的含量較高，而實驗室培養(yǎng)的菌株中則沒有色氨酸酶。 雙向電泳技術(shù)在病原微生物致病機理研究中的應(yīng)用雙向電泳技術(shù)在病原

18、微生物藥物抗性基因功能研究中的應(yīng)用雙向電泳技術(shù)可以進行微生物抗性機理的研究。Diffes等對Divercin V4l抗性和野生型的產(chǎn)單核細胞 李斯特氏菌進行2-DE分析，發(fā)現(xiàn)至少在17個蛋白質(zhì)存在差異，抗性菌株中缺乏野生型菌株中的9個蛋白質(zhì)，而新增8個蛋白質(zhì)，其中只有1個Rl是存在于已知該菌的數(shù)據(jù)庫中，為鞭毛蛋白；機會致病真菌如念珠菌屬產(chǎn)生了許多的耐藥菌株。伊曲康唑類化合物通過抑制真菌細胞壁的d-葡萄糖的合成而起作用，而且對耐真菌藥物的菌株起作用。Bruneau等對比mulundocandin、氟康唑和伊曲康唑3種殺真菌藥處理所產(chǎn)生的白色念珠菌雙向電泳差異蛋白質(zhì)圖譜后認(rèn)為，氟康唑和伊曲康唑在蛋白質(zhì)組水平具有共同的作用機制。因此，病原微生物的耐藥菌株和敏感菌株的雙向電泳研究，對闡明耐藥相關(guān)機制、鑒定新的藥物靶位和耐藥診斷標(biāo)志有非常重要的價值。人們通過雙向電泳技術(shù)分離正常組織細胞與腫瘤之間的差異蛋白質(zhì)組分，在尋找腫瘤的特異標(biāo)志物、揭示腫瘤的發(fā)病機制以及開發(fā)新的腫瘤治療方式和治療藥物提供理論依據(jù)等方面都取得了一些重要的進展。腫瘤發(fā)生的早期常常無任何癥