實(shí)驗(yàn)三蛋白質(zhì)的鹽析分離和凝膠層析

1、 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)Biochemical Experiment1實(shí)驗(yàn)成績(jī)?cè)u(píng)分方法實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)情況（10%）實(shí)驗(yàn)操作情況（30%）實(shí)驗(yàn)報(bào)告情況（30%）實(shí)驗(yàn)考試成績(jī)（20%）實(shí)驗(yàn)素質(zhì)（遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)則和道德行為）（10%）2本學(xué)期實(shí)驗(yàn)課安排9月11日生化實(shí)驗(yàn)常規(guī)儀器的使用 4學(xué)時(shí)9月18日蛋白質(zhì)的鹽析分級(jí)分離及凝膠層析脫鹽 6學(xué)時(shí)9月25日醋酸纖維膜電泳鑒定蛋白質(zhì) 6學(xué)時(shí)10月9日蛋白質(zhì)含量的測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)法和Fulin酚法） 8學(xué)時(shí) 10月16日蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定-等電聚焦 8學(xué)時(shí)10月23日丹磺?；治龅鞍踪|(zhì)N-末端氨基酸 I 6學(xué)時(shí)10月30日丹磺酰化分析蛋白質(zhì)N-末端氨基酸 II 6學(xué)時(shí)11月6

2、日豬肝DNA的制備 6學(xué)時(shí)311月13日DNA定量和純度測(cè)定 6學(xué)時(shí)11月20日DNA變形和復(fù)性以及Tm值得測(cè)定 6學(xué)時(shí)11月27日蔗糖酶的制備及各步比活力的測(cè)定 8學(xué)時(shí)12月4日底物濃度對(duì)酶活性的影響及km值測(cè)定 8學(xué)時(shí)12月11日正交法尋找蔗糖酶的最適反應(yīng)條件 8學(xué)時(shí)12月18日氨基轉(zhuǎn)換反應(yīng)的定性鑒定 6學(xué)時(shí)12月25日LDH在不同組織中的表達(dá)分析-非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 10學(xué)時(shí)2007年1月綜合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)（考試） 6學(xué)時(shí)4有關(guān)網(wǎng)址和參考書(shū)目趙永芳. 生物化學(xué)技術(shù)原理及應(yīng)用.北京. 科學(xué)出版社.2002沈同 王鏡巖.生物化學(xué).高等教育出版社.20025、蛋白質(zhì)的鹽析分離和凝膠層析脫鹽蛋白

3、質(zhì)的鹽析分級(jí)分離SephadexG-25脫鹽鹽離子的跟蹤檢測(cè)檢測(cè)蛋白質(zhì)6蛋白質(zhì)提取、分離、純化及鑒定技術(shù)材料（取材一定要新鮮，在低溫下操作） 破細(xì)胞（勻漿器，研缽，超聲波，反復(fù)凍融，化學(xué)方法，酶解等） 蛋白質(zhì)提?。ǜ鶕?jù)物質(zhì)的性質(zhì)，水、鹽溶液、稀酸、稀堿、有機(jī)溶劑）蛋白質(zhì)分級(jí)分離（鹽析分級(jí)分離、有機(jī)溶劑分級(jí)分離、等電點(diǎn)分離） 進(jìn)一步純化（透析、柱層析：分子篩、離子交換、親和層析、HPLC） 鑒定（電泳：薄層電泳（紙，NC膜）、凝膠電泳（PAG，瓊脂，淀粉）；結(jié)構(gòu)分析；活性分析；呈色反應(yīng)） 含量測(cè)定（fonlin酚法、考馬斯亮藍(lán)G250法）7蛋白質(zhì)的分級(jí)分離（粗分級(jí)）一、鹽析沉淀分離1、鹽溶和鹽析

4、現(xiàn)象：低鹽濃度下蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的增加而增加；鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的增加而減小析出。2、鹽的選擇：通常采用中性鹽，硫酸銨、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸鈉等。 3、硫酸銨濃度的計(jì)算與調(diào)整：（1）加硫酸銨飽和液：V=V0（S2S1）/（1S2）；（2）加固體硫酸銨：t=G（S2S1）/（1AS2）V為所加飽和硫酸銨體積； V0 為原溶液體積； S2 為需達(dá)到的硫酸銨飽和度； S1 為原溶液硫酸銨飽和度；G和A為常數(shù)，0 時(shí)G為507，A為0.27；20 時(shí)，G為533，A為0.27。t為每升加入的克數(shù)。8二、有機(jī)溶劑沉淀分離 有機(jī)溶劑沉淀出的蛋白質(zhì)沉淀比鹽析沉淀出的蛋白質(zhì)沉

5、淀易于過(guò)濾或離心分離，分辨率好，但容易使蛋白質(zhì)變性，通常在低溫下進(jìn)行。三、選擇性沉淀法（等電點(diǎn)、熱變性、酸堿變性等）四、吸附法五、重金屬鹽沉淀法9蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化（細(xì)分級(jí)）一、透析和超過(guò)濾二、層析（色譜）分離1、氣相色譜（色譜儀）2、液相色譜：紙層析和薄層層析（分配層析）、柱層析（分子排阻、離子交換、親和層析、吸附層析等）3、高效液相色譜（色譜儀）兩位英國(guó)科學(xué)家Martin和Synge發(fā)明了分配色譜（層析），他們獲得了1952年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。10一些常用的蛋白質(zhì)純化中的儀器機(jī)械細(xì)胞破碎儀超聲波細(xì)胞破碎儀11色譜工作站 WINDOWS 98 作為色譜分析的數(shù)據(jù)采集和處理，后端采用數(shù)據(jù)庫(kù)工具

6、MS-SQL 在網(wǎng)絡(luò)上進(jìn)行分析結(jié)果的存檔、檢索及打印等。12高效液相色譜儀13 氣相色譜儀14蛋白質(zhì)的鹽析分離原理用大量中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出的過(guò)程稱為蛋白質(zhì)的鹽析作用。蛋白質(zhì)是親水膠體，在高濃度的中性鹽影響下脫去水化層，同時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶的電荷被中和，結(jié)果蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性遭到破壞而沉淀析出。經(jīng)透析或用水稀釋時(shí)又可溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過(guò)程。分子量大的蛋白質(zhì)（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白）易于析出。改變鹽濃度，使不同分子量的蛋白質(zhì)分別析出。15凝膠層析原理凝膠層析又稱排阻層析，凝膠過(guò)濾，滲透層析或分子篩層析等 。對(duì)于某種型號(hào)的凝膠，一些大分子不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而完全被排阻

7、在外，只能沿著顆粒間的縫隙流出柱外（所用洗脫液的體積為外水體積）；而一些小分子不被排阻，可自由擴(kuò)散，滲透進(jìn)入凝膠內(nèi)部的篩孔，爾后又被流出的洗脫液帶走（所用洗脫液的體積為內(nèi)水體積）。分子越小，進(jìn)入凝膠內(nèi)部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先從柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子與小分子之間，只能進(jìn)入一部分凝膠較大的孔隙，亦即部分排阻，因此這些分子從柱中流出的順序也介于大、小分子之間。這樣樣品經(jīng)過(guò)凝膠層析后，分子便按照從大到小的順序依次流出，達(dá)到分離的目的。16凝膠層析載體用作凝膠的載體物質(zhì)有交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺和瓊脂糖等。使用最多的是交聯(lián)葡聚糖。交聯(lián)葡聚糖的商品名為Seph

8、adex,是由鏈狀葡聚糖通過(guò)交聯(lián)劑1氯代2，3環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成。交聯(lián)劑添加越多，孔徑越小，吸水量也越小；反之越大。以G-x表示型號(hào)，后面的數(shù)字可以看出交聯(lián)度，數(shù)字越小，膠聯(lián)度越大。SephadexG-25粗：吸水量2.5ml/g，干粒子直徑100-300m，篩孔40-60。大部分蛋白質(zhì)分子從外水體積流出，鹽等小分子從內(nèi)水體積流出。17實(shí)驗(yàn)步驟（一）卵球蛋白的沉淀18實(shí)驗(yàn)步驟（二）卵球蛋白的脫鹽19注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)完畢后，將凝膠全部回收處理，以備下次實(shí)驗(yàn)使用，嚴(yán)禁將凝膠丟棄或倒入水池中。樣品溶液的濃度大一些好，但粘度不宜大，加樣體積通常為凝膠柱床體積的1%-10%。洗脫用的液體與凝膠溶漲和凝膠平衡時(shí)所用的一樣。 洗脫速度要恒定。凝膠暫時(shí)不用時(shí)，要加防腐劑（如0.02%疊氮化鈉溶液） 再次使用凝膠時(shí)可再生后使用20蛋白質(zhì)洗脫曲線記錄方式21鹽離子檢測(cè)方法用醋酸鋇檢測(cè)溶液中的硫酸根離子。靈敏度高，與溶液中的硫酸根離子可以形成白色的沉淀。同時(shí)不能同蛋白質(zhì)形成沉淀。實(shí)驗(yàn)中要設(shè)對(duì)照，即加入雙蒸水