試驗(yàn)一黃柏皮中小檗堿的提取

1、實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小樊堿的提取實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小篥堿的提取、別離與鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諒狞S柏皮中提取小篥堿的原理和方法。掌握柱層析的根本操作方法以及其在中藥有效成分提取別離過(guò)程中的應(yīng)用。掌握生物堿的鑒別方法。二、實(shí)驗(yàn)原理1、概述生物堿是植物中含氮的堿性有機(jī)化合物，大都有明顯的生理活性，是許多中草藥中的有效成分。它們是人類(lèi)對(duì)植物研究得最早最多的一類(lèi)有效成分，現(xiàn)已別離生有六千余種。這些生物堿在植物體內(nèi)一般均與有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸結(jié)合成鹽而存在,只有弱堿性生物堿往往呈游離狀態(tài)，還有一些是與糖結(jié)合成昔而存在。小篥堿又名黃連素，是最先由毛葭科黃連CoptischinensisFran 和蕓香科黃柏（Phellode

2、ndronamurenseRup.）等植物中提由的一種黃色生物堿。黃連屬植物的根莖、須根、葉中等都含有小篥堿、黃連堿、藥根堿、巴馬亭等生物堿，我國(guó)黃連藥材產(chǎn)量占世界第一位?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，唐松草屬 Thalictrum 、小篥科的小篥屬（BerberisL.）、十大功績(jī)屬（MahomiaNuff）及防己科的天仙藤屬Fibraurea等都可作為提取小篥堿的資源植物本實(shí)驗(yàn)是從黃柏皮中提取小篥堿。黃柏皮是豆科植物黃皮樹(shù)PhellodendronchinenseSchneid 或黃篥P.amurenseRupr.的樹(shù)皮，其主要有效成分為小篥堿，小篥堿及其鹽類(lèi)有較好的抗菌作用，臨床用以治療菌痢和一般炎癥。小篥

3、堿是一種季鏤堿，其游離堿為黃色針晶C （乙醍，微溶于水，能溶于熱水和乙醇中，難溶于苯、丙酮、氯仿，幾乎不溶于石油醍。小篥堿與氯仿、丙酮、苯在堿性條件下均能形成加成物。不同小篥堿鹽類(lèi)在水中的溶解度均有較大差異。小篥堿鹽酸鹽難溶于冷水，易溶于熱水；硫酸鹽易溶于水。溶解度分別為：小篥堿,1 ： 2 0冷水，1 ： 100（冷乙醇 ）;鹽酸鹽,1 ： 500（冷水）;硫酸鹽,1 ：30（冷水），利用這些特性提取鹽酸小篥堿。小篥堿加熱至110c變?yōu)辄S棕色，于160c分解。鹽酸小篥堿加熱至220c分解，生成紅棕色的小篥紅堿，因此枯燥時(shí)溫度不宜太高一般不超過(guò)80COONOONOCHOCH3OONClOCHO

4、CH31 / 11小篥堿實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小樊堿的提取小篥堿實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小樊堿的提取2、 提取別離原理小篥堿屬于季鏤堿，其游離型在水中的溶解度最大。而其鹽類(lèi)以含氧酸鹽在水中溶解度較大，不含氧酸鹽難溶于水，其鹽酸鹽在水中溶解度那么更小。利用此性質(zhì)結(jié)合鹽析法，可從黃柏皮中提取小篥堿。由于黃柏中含有大量的粘液質(zhì)，故采用石灰乳法，使藥材的粘液質(zhì)與石灰乳生成難溶于水的鈣鹽，同時(shí)堿性條件下小篥堿游離由溶于水層，加鹽酸使其轉(zhuǎn)變?yōu)辂}酸鹽，降低其在水中的溶解度，再結(jié)合鹽析法，使小篥堿以沉淀析生。三、儀器與試劑儀器：滲漉柱、層析柱、燒杯、布氏漏斗、抽濾瓶、蒸發(fā)皿、濾紙、錐形瓶、螺旋夾等試劑與樣品：黃柏皮粉、石灰乳、

5、蒸儲(chǔ)水、食鹽、 10溢酸、濃鹽酸、95充醇、中性氧化鋁100-200目、脫脂棉、漂白粉水溶液、碘化例鉀試劑、碘化汞鉀試劑、碘化碘鉀試劑、硅烏酸試劑。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及流程一小篥堿的提取稱(chēng)取黃柏皮粗粉 200g,參加150ml石灰乳拌濕，溶脹 30min后參加8倍量水浸漬90min后滲漉。滲漉液參加總體積20%勺食鹽緩慢參加，局部未溶解 NaCl用玻棒緩緩攪拌，靜置 30min,抽濾，得小篥堿粗品。二小篥堿的精制將所有粗品濕品稱(chēng)重，放入燒杯中，加20倍量蒸儲(chǔ)水，加熱至沸，趁熱抽濾，略放冷后向?yàn)V液中滴加濃鹽酸，調(diào) pH到2,放置2h,過(guò)濾，濾生的沉淀用少量蒸儲(chǔ)水洗至pH值為5,抽干，80c以下枯燥，稱(chēng)

6、重，得精制鹽酸小篥堿。三柱層析演示實(shí)驗(yàn)四檢識(shí)1.生物堿的一般鑒定反響去少量精制鹽酸小篥堿，用酸水溶解，分成四份，分別滴加試劑1碘化例鉀試劑，觀察產(chǎn)生沉淀顏色；2碘化碘鉀試劑，觀察產(chǎn)生沉淀顏色；3硅烏酸試劑，觀察產(chǎn)生沉淀顏色或溶液渾濁情況。記錄觀察到的現(xiàn)象和反響結(jié)果以及得由結(jié)論。3滴，即產(chǎn)生櫻紅色23滴，即產(chǎn)生櫻紅色取鹽酸小篥堿少許，加稀鹽酸2ml溶解后，加漂白粉液2 / 11實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小樊堿的提取實(shí)訓(xùn)思考.從黃柏皮中提取小篥堿是利用了它的什么性質(zhì)？.提取別離過(guò)程中加NaCl起什么作用？黃柏皮粗粉200g參加150ml石灰乳拌濕，溶脹30min后再參加8倍量水浸漬80min后滲漉滲漉液 參加

7、總體積 靜置抽濾藥渣棄去滲漉液 參加總體積 靜置抽濾藥渣棄去20%勺食鹽濾液_沉淀小篥堿粗品溶于濾液_沉淀小篥堿粗品溶于20倍量沸水，趁熱 抽濾不溶物加濃鹽酸調(diào)pH2左右，放置，抽濾濾液中淀用蒸儲(chǔ)水洗至中性, 下烘干不溶物加濃鹽酸調(diào)pH2左右，放置，抽濾濾液中淀用蒸儲(chǔ)水洗至中性, 下烘干80C鹽酸小篥堿3 / 11實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小樊堿的提取實(shí)驗(yàn)二虎杖中蔥醍類(lèi)成分的提取別離與鑒定【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 了解昔和昔元的提取別離方法.掌握pH梯度萃取法在別離重要有效成分中的應(yīng)用，并能通過(guò)被別離化合 物的結(jié)構(gòu)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果.掌握蔥醍類(lèi)化合物的鑒定方法【實(shí)驗(yàn)原理】1、概述虎杖為蓼科植物虎杖Polygonumcus

8、pidatumZucc.的枯燥根莖和根。具有祛風(fēng)利濕，散瘀定痛，止咳化痰的成效?；⒄戎械某煞种饕[醍的大黃素、大黃酚、大黃素甲醍等游離蔥醍，大黃素-6-甲醍-8-O-D-葡萄糖昔、大黃素-8-O-D-葡萄糖昔等。尚含非蔥醍成分，主要是白藜蘆醇葡萄糖昔，又稱(chēng)虎杖昔、云杉新昔，用于防止細(xì)胞癌變和惡性腫瘤的擴(kuò)散，對(duì)艾氏腹水瘤有抑制作用。白藜蘆醇還具有擴(kuò)張血管降壓、抗血栓形成、降血脂等方面的作用。此外還有糅質(zhì)等成分。1.大黃素emodin本品系橙黃色長(zhǎng)針晶乙醇，溶點(diǎn)256257C,幾乎不溶于水，易溶于乙醇及堿液(NH4OH Na2CO3NaOHK溶液)o2.大黃酚chrysophanol本品為六角形

9、片狀結(jié)晶，或針狀結(jié)晶，熔點(diǎn) 196C,能升華，不溶于水，溶于苯、三氯甲烷、乙醍、冰醋酸，難溶于石油醍，可溶于NaOHK溶液及熱的Na2CO如溶液。3.大黃素-6-甲醍phyclone4 / 11實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小樊堿的提取本品為黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)207 C ,能升華不溶于水，溶于苯、三氯甲烷、乙醍、乙醇、冰醋酸，難溶于石油醍，易溶于NaOH容液。4.白藜蘆醇resveratrol 本品又稱(chēng)危三酚，為無(wú)色片狀結(jié)晶或針晶，熔點(diǎn)256257C,能升華，易溶于乙醍、三氯甲烷、丙酮、乙醇、甲醇等。C1H5.白藜蘆醇昔polydatinpeceid 又稱(chēng)危三酚昔，為無(wú)色針狀底就、!廣而過(guò)!韭者在138140

10、c熔融，繼續(xù)加熱又固化，至2252260飛融。/溶濕見(jiàn)醍，可溶于醋酸乙酯，易溶于丙酮、乙醇、甲醇、熱水和 Na2CO3 NaOHK溶液。OH“口JI白藜蘆醇葡萄糖昔、 polydatin J17J% I*12、提取別離原理由段） 產(chǎn)/=H依據(jù)鬲涉游離蔥慚口昔類(lèi)土%溶于修醇而提取，因昔和昔元在水和乙醇中的溶解度不同采取萃取方法，以石油融別屬由極性小的昔元游離蔥醍，以水別離由極性大的昔類(lèi)成分，再進(jìn)一步用pH梯度萃取法使酸性強(qiáng)弱不同的游離蔥醍得以別離。【實(shí)驗(yàn)材料】燒杯、滲漉柱、水浴鍋、鐵架臺(tái)、分液漏斗、錐形瓶、外表皿、試管、層析缸、量筒、抽濾瓶、布氏漏斗、pH試紙、橡皮管、螺旋夾、載玻片、顯微鏡、石

11、棉網(wǎng)、酒精燈、銀子、棉花、濾紙5 / 11實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小樊堿的提取虎杖粗粉、95叱醇、石油醍、5%NaHCO3液、20溢酸、5%Na2CO溶液、2%NaOlB液、30%HQ溶液、氨水、薄層硅膠G CMC-Na蒸播水、甲醇、三氯甲烷、石油醍、乙酸乙酯、環(huán)己烷、0.5%醋酸鎂乙醇溶液【實(shí)驗(yàn)步驟】一、提取別離工藝流程一蔥醍的提取與別離虎杖根莖粗粉(200g)195叱醇拌濕，裝柱295叱醇200ml浸泡過(guò)夜3滲漉滲漉液減壓回收乙醇至 70ml左右T乙醇總提物抽濾沉淀局部T濾液石油醍100ml+50ml*2)萃取水層留用|石油醍層昔5%NaHCO50ml*3)丫下層NOHcob石油醍上層層T 1)20

12、%HCl,調(diào) pH1-22抽濾5%NaCO40ml*3的T-母.液沉淀水洗至中性，枯燥 稱(chēng)重上層石油醴層NaCO層下層1)20%HCl,調(diào) pH122%NaOH強(qiáng)酸性成分2抽濾、水洗、(50ml*3枯燥6 / 11實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小樊堿的提取395%醇重結(jié) 晶石油醍層NaOK下層大黃素1NaOK下層上層1)20%HCl,調(diào) pH1-21)20%HCl,調(diào) pH1-22抽濾、水洗、枯燥大黃酚十大黃素甲醍混合物2水層含白藜蘆 醇昔1揮去乙醍 加熱煮沸， 攪拌2傾去上清 液上清液 冷卻、過(guò)濾7 / 11實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小樊堿的提取二白藜蘆醇葡萄糖百鑒定1、游離蔥醍類(lèi)化合物的一般鑒別反響將上述別離得到12

13、各少許，加95%&醇使溶解，分別做以下試驗(yàn), 觀察顏色變化。1Borntr?ger s 反響取上述樣品溶液分別加數(shù)滴2-3滴2%NaO冰溶液，觀察顏色變化，再加少量30%HQ液，加熱后觀察顏色，然后加酸至酸性時(shí)，再堿化，觀察反響過(guò)程中顏色變化凡具有鄰位或?qū)ξ涣u基的蔥醍類(lèi)化合物加堿液后呈紫蘭色；其他羥基蔥醍呈紅色 2醋酸鎂試驗(yàn)上述樣品溶液分別加 0.5%醋酸鎂乙醇溶液數(shù)滴，觀察顏色變化幾乎有鄰位或?qū)ξ涣u基的蔥醍呈紅紫色-蘭色， 有二個(gè)2-羥基的或與之互成間位羥基的蔥醍呈橙紅-紅色，只有一個(gè)a-羥基或一個(gè)B-羥基或二個(gè)羥基互為間位羥基的蔥醍呈黃橙-橙色。3升華實(shí)驗(yàn)取虎杖粉末少許，平鋪于載玻片中部后

14、放在墊有石棉網(wǎng)的小鐵圈上，玻片兩端各放一小棍，再蓋上另一載玻片，具上置一塊潤(rùn)濕棉花注意上面的玻片勿觸及粉末。用酒精燈小心隔石棉網(wǎng)加熱檢品，邊加熱邊移動(dòng)酒精燈，以免過(guò)熱燒焦檢品。當(dāng)上面玻片上凝結(jié)有明顯升華物時(shí)，停止加熱。冷卻后，取下蓋片，置于顯微鏡下觀察，多數(shù)為黃色針晶或羽毛狀晶體，加堿液呈紅色反響。2、虎杖昔的鑒別1三氯化鐵反響樣品3數(shù)毫克，溶于乙醇中，滴加 1%FeCl3溶液數(shù)滴，觀察顏色變化有酚羥基者 常呈黃、綠、紫、紅等色。8 / 11實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小樊堿的提取2香草醛反響取樣品數(shù)毫克，加乙醇，1ml溶解后，加香草醛鹽酸試劑，凡有間苯二酚或間苯三酚結(jié)構(gòu)者呈紅色。3重氮鹽反響去樣品數(shù)毫克，

15、加 5%NaCO溶液，滴加新配置的重氮鹽試劑1-2滴，凡酚羥基鄰位或?qū)ξ粺o(wú)取代者呈紅色。3、薄層鑒定1制版稱(chēng)取2g層析用硅膠G于小乳缸中，加5-7ml5%oCMCNa水溶液研磨成糊狀，待氣泡除盡后均勻地鋪于潔凈枯燥玻片上，用手晃動(dòng)或者振動(dòng)玻片，使糊狀物流布于整塊板面上，使其外表光滑平整。然后將玻板放平，室溫晾干后于110c加熱活化 30min,取由,待溫度降低后置于枯燥器中備用。2點(diǎn)樣分別取少量樣品12于小試管中，用丙酮溶解，毛細(xì)管吸樣品，輕輕點(diǎn)在制好的薄層板上。點(diǎn)樣的原點(diǎn)直徑不得超過(guò) 3mm幾個(gè)樣品需要在距離玻板邊緣1cm左右的同一起始線上，有一定的問(wèn)隔。3展開(kāi)預(yù)先將展開(kāi)劑環(huán)己烷：乙酸乙酯7

16、:3倒入洗凈烘干的層析缸的一側(cè)注意液面不要超過(guò)中間的隔槽，然后將已點(diǎn)樣的薄層板放入槽內(nèi)未加展開(kāi)劑的一側(cè)，蓋好玻板飽和5-10min，傾斜層析缸，將展開(kāi)劑轉(zhuǎn)入放有薄層板的一側(cè)，使薄板浸入溶劑進(jìn)行展開(kāi)，展開(kāi)式薄層板上的樣品不能浸入溶劑中，展距在7-8cm時(shí)，取由，迅速記下前沿位置。4顯色先在可見(jiàn)光下觀察，記錄有色斑點(diǎn)由現(xiàn)的位置用濃氨水熏或噴以 2%氨水后觀察斑點(diǎn)的色澤變化，再在紫外光下觀察熒光斑點(diǎn)的變化。5計(jì)算Rf值Rf=原點(diǎn)到層析斑點(diǎn)中心的距離 /原點(diǎn)至溶劑前沿的距離【實(shí)驗(yàn)說(shuō)明】9 / 11實(shí)驗(yàn)一黃柏皮中小樊堿的提取.乙醇總提取物的制備稱(chēng)取虎杖根莖粗粉200克，加95次醇拌濕均勻裝于滲漉筒中，邊

17、裝邊用木槌壓緊，整平，使筒內(nèi)藥材均一直，裝筒后外表上蓋一圓形濾紙，濾紙上面用幾塊小石壓上，加200m195%乙醇于滲漉筒中，浸泡過(guò)夜，次日翻開(kāi)螺旋夾，收集滲漉液，將滲漉液裝入圓底燒瓶中回收乙醇至100ml左右，得乙醇總提物。.總游離蔥醍的提取將乙醇總提取物抽濾，濾液置于500ml分液漏斗中，加乙醍 200ml萃取，充分振蕩后放置，傾由上層醍層，下層殘留液再加100ml石油醍萃取兩次，合并三次石油醍萃取液，殘留物合并留用。.電:醍單體的別離1強(qiáng)酸性成分一一游離蔥醍的別離將含有游離蔥醍的乙醍溶液移至500ml的分液漏斗中，力口 50%NaHCOK溶液50ml,振搖提取。放置待分層，放由下層NaHC

18、O箝液，置于另一三角瓶中，上層乙醍溶液留存于分液漏斗中,再加5%NaHCO取50ml萃取兩次，每次振搖提取后，放置分層時(shí)間應(yīng)稍久，以免乙醍溶液混在下層水液中，影響別離效果。提取過(guò)程中，如乙醍揮發(fā)，可酌量補(bǔ)加。合并NaHC砒取液，注意其呈色，在攪拌下小心滴加 HCl調(diào)至pH2,放置沉淀，抽濾，水少量水洗沉淀至洗液呈中性后，枯燥稱(chēng)重，得強(qiáng)酸性局部。2中等酸度成分一一大黃素的提取留存在分液漏斗中的乙醍液，用5%Na2CO水溶液每次3040ml如上法相同提取三次，合并Na2CO犍取液，小心滴加20溢酸酸化至pH1-2,放置待沉淀析由，抽濾收集析生物經(jīng)水洗滌，抽干移至外表皿上，枯燥后稱(chēng)重，得大 黃素1，用95充醇進(jìn)行重結(jié)晶。弱酸性成分一一大黃酚和大黃素 -6-甲醍的提取留存在分液漏斗中的乙醍液，用2%NaOHk溶液每次50ml提取兩次，合并NaOHI取720溢酸酸化，放置。抽濾收集沉淀，經(jīng)水洗