水稻TOS17突變體庫(kù)的創(chuàng)建與應(yīng)用

1、 5/5水稻TOS17突變體庫(kù)的創(chuàng)建與應(yīng)用1文獻(xiàn)綜述 1.1 水稻基因組學(xué)研究現(xiàn)狀 1.1.2 水稻全基因組測(cè)序 水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的糧食作物之一，全世界有一半的人口食用它，水稻年總產(chǎn)量占世界糧食作物產(chǎn)量第三位，維持較多人口的生活。亞洲是世界水稻主產(chǎn)區(qū)，近年稻米產(chǎn)量占世界的90%以上，中國(guó)稻米年產(chǎn)量占亞洲的38%。大米作為我國(guó)主要糧食種類，在養(yǎng)活我國(guó)13億人口和改善我國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)中具有舉足輕重的影響。同時(shí)，水稻又以其基因組相對(duì)較小(430Mbp)，高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，與玉米、大麥和小麥等其它禾本科作物在基因組上存在明顯的共線性，而成為研究單子葉植物的模式植物

2、。 國(guó)際水稻基因組計(jì)劃(IRGSP)啟動(dòng)于1998年，以粳稻品種(japonica)日本晴(Nipponbare)為模式材料，由中國(guó)、日本、美國(guó)等是十個(gè)國(guó)家參與，所采用的方法為逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，隨后在2002年由日本和中國(guó)科學(xué)家率先公布了第1、4染色體的精確序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9月第10條染色體的全長(zhǎng)序列由美國(guó)Clemson大學(xué)公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。2005

3、年8月水稻全基因組精確序列在Nature發(fā)表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。IRGSP公布的水稻“日本晴”精確序列經(jīng)過(guò)分析表明：(1) 水稻“日本晴”基因組大小為389Mb，IRGSP公布的序列能夠覆蓋其全基因組的95%，并包含了所有的常染色質(zhì)和兩個(gè)完整的著絲粒；(2) 整個(gè)基因組中包含大約37544個(gè)非轉(zhuǎn)座相關(guān)基因，其中71%的基因可能在擬南芥中有同源基因；(3) 通過(guò)與擬南芥基因組序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥90%的基因在水稻中可能存在同源物；(4) 水稻中預(yù)測(cè)的37544個(gè)基因中，29%是屬于成簇的基因家族；(5) 水

4、稻基因組中轉(zhuǎn)座元件的數(shù)目和種類與玉米和高粱基因組共線性區(qū)段的擴(kuò)張是一致的；(6) 有證據(jù)證明基因能從細(xì)胞器中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。 另外的一些科學(xué)研究部門(mén)和公司也分別啟動(dòng)了各自的水稻測(cè)序計(jì)劃。如華大基因在2005年宣布完成秈稻品種“93-11”的全基因組序列測(cè)序，其所采用的方法為鳥(niǎo)槍法。Syngenta公司也于2002年宣布完成了粳稻品種“日本晴”的全基 因組序列測(cè)序。 隨著目前水稻基因組已測(cè)序完成，以及構(gòu)建了水稻高密度的遺傳圖譜和高質(zhì)量的物理圖譜(Chen et al., 2002)。同時(shí)獲得了超

5、過(guò)25萬(wàn)條來(lái)源于水稻不同組織的ESTs及28000條全長(zhǎng)cDNA序列(Kikuchi et al., 2003)。人們對(duì)有益基因的定位、克隆、轉(zhuǎn)移和聚合越來(lái)越關(guān)注。因此，可以說(shuō)對(duì)水稻生命科學(xué)的研究步入到后基因組時(shí)代即對(duì)基因功能大規(guī)模研究的時(shí)代(Jeon et al., 2000)，其核心內(nèi)容是植物功能基因組學(xué)。因此，接下來(lái)的任務(wù)就是利用水稻功能基因組學(xué)，詮釋全基因組測(cè)序所獲得的遺傳信息，分析基因的功能。 1.1.3 基于突變體的水稻功能基因組研究 目前來(lái)講克隆分析基因最有效的方法，就是利用突變體來(lái)研究分析基因的功能。其基本原理是通過(guò)破壞植物基因內(nèi)部或鄰近位點(diǎn)，造成基因的突變。然后再利用各種方法

6、分離被破壞的基因。目前構(gòu)建飽和的基因突變?nèi)后w，通過(guò)突變體分析鑒定基因已經(jīng)成為最直接最有效的方法。在水稻測(cè)序完成之前，植物學(xué)家利用一些自然產(chǎn)生的突變體及利用物理和化學(xué)等方法產(chǎn)生的突變體，克隆了一些控制水稻重要農(nóng)藝性狀的基因(Yoshimura et al., 1996; Yoshimura et al., 1998; Yano et al., 2000)，但自然界自發(fā)產(chǎn)生的突變很少，頻率僅有10-5。所以目前有很多的方法通過(guò)人為的手段提高突變頻率，滿足與構(gòu)建大規(guī)模飽和突變題庫(kù)的需要。目前大規(guī)模構(gòu)建突變體庫(kù)的主要的方法有：物理和化學(xué)誘變法，T-DNA、轉(zhuǎn)座子及反轉(zhuǎn)綠轉(zhuǎn)座子插入突變等。 1.1.3.

7、1 物理和化學(xué)誘變 物理和化學(xué)誘變主要是利用一些物理和化學(xué)的手段如快中子(Fast neutron)、伽瑪射線(Gamma ray)、雙環(huán)氧丁二烯(Diepoxybutane, DEB)、甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate, EMS) 等方法處理種子，然后通過(guò)播種處理的種子來(lái)篩選突變表型?？熘凶愚Z擊法是物理方法中被認(rèn)為是非常有效的一種方法，快中子轟擊往往導(dǎo)致基因組片段的缺失。而以EMS誘導(dǎo)為代表的化學(xué)誘變的方法，往往導(dǎo)致DNA中的堿基轉(zhuǎn)換，如G到A的轉(zhuǎn)換。物理和化學(xué)誘變的方法非常簡(jiǎn)單，快速和經(jīng)濟(jì)且不存在組織培養(yǎng)或遺傳轉(zhuǎn)化匯總基因型的限制，被廣泛應(yīng)用于大型突變體庫(kù)的創(chuàng)建

8、，如Li等(2001)利用Deletegene系統(tǒng)，在水稻中構(gòu)建了含24,660個(gè)快中子轟擊群體，篩選到5個(gè)基因位點(diǎn)，得到一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生缺失的突變體。而使用EMS作為化學(xué)誘變劑同樣也可以得到遺傳穩(wěn)定的點(diǎn)突變體，而且已經(jīng)被廣泛 用于水稻等植物誘變育種。但是物理和化學(xué)的方法處理得到突變體，只能通過(guò)圖位克隆的方法克隆基因，需要構(gòu)建龐大的克隆群體，精細(xì)的遺傳圖譜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無(wú)法適應(yīng)大規(guī)模篩選鑒定突變體的要求。 1.1.3.2構(gòu)建插入突變體庫(kù) 利用T-DNA、轉(zhuǎn)座子和反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子等插入元件，通過(guò)插入元件插入到植物基因組中，是植物基因不能正常的轉(zhuǎn)錄和翻譯，達(dá)到破壞基因的效應(yīng)產(chǎn)生突變體，而且可以通過(guò)插入元件很

9、容易找到被插入元件的位點(diǎn)，目前構(gòu)建插入突變體是最有效的構(gòu)建大規(guī)模飽和突變體庫(kù)的方法。 元件的插入效應(yīng)是多樣的。Krysan等(1999)探討了元件插入到植物基因組中后引起的靶位點(diǎn)基因功能的變化的幾種情況：當(dāng)插入元件插入到靶位點(diǎn)基因的編碼區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)就有可能使被插入的基因功能完全敲除，產(chǎn)生功能缺失性的突變體，即無(wú)義突變(null mutant)；當(dāng)插入到啟動(dòng)子或3端的非翻譯區(qū)就有可能使靶位點(diǎn)基因表達(dá)量下降；當(dāng)元件接上一個(gè)35S的啟動(dòng)子的時(shí)候，插入到基因的啟動(dòng)子區(qū)域，就可以使基因表達(dá)量上升；當(dāng)插入基因編碼區(qū)時(shí)，還有可能無(wú)法看到表型的缺失，因?yàn)楦叩戎参镏写嬖诖罅炕蛉哂嗟默F(xiàn)象，突變基因的功能被其它同

10、家族的基因補(bǔ)償；在植物基因組內(nèi)部存在多個(gè)拷貝的元件插入是，有可能多個(gè)基因被同時(shí)敲除掉，使多個(gè)基因同時(shí)失活；元件的插入還有可能導(dǎo)致插入位點(diǎn)附近的染色體重排的現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)室張健同學(xué)的一個(gè)突變體就是由于插入位點(diǎn)附件的染色體重排，而引起植物出現(xiàn)一個(gè)不育的突變表型（私下交流）。 圖1.植物基因組中中由T-DNA插入引起靶基因表達(dá)的不同效應(yīng)（Kryson et al，1999） Fig1. The insertion of a T-DNA into a plant genome chromosome can lead to many different outcomes T-DNA(Transferred

11、 DNA)是農(nóng)桿菌(Agrobacterium)的Ti質(zhì)粒(Tumor-inducing Plasmid)上一段DNA序列，它可以從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定的整合到植物核基因組當(dāng)中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于構(gòu)建擬南芥和水稻的插入失活突變體庫(kù)(Azpiroz-Leehan and Feldmann, 1997)。如在擬南芥中已經(jīng)建立飽和的插入突變體庫(kù)(Alonso et al., 2003)。隨著水稻粳稻的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立(Hiei Y et al., 1994)，水稻中的T-DNA插入突變體庫(kù)開(kāi)始大量建立如本室已經(jīng)建立了超過(guò)120,000個(gè)含有T-DNA標(biāo)簽的獨(dú)立的轉(zhuǎn)化子

12、，平均每個(gè)突變體含有約為2.0個(gè)T-DNA拷貝，并且能穩(wěn)定遺傳(Wu et al., 2003)，并且通過(guò)對(duì)突變體的篩選，克隆到了一系列的重要基因如RID1(Wu et al., 2008)。而其它的一些研究機(jī)構(gòu)也紛紛建立了大型的T-DNA插入突變體庫(kù)，如韓國(guó)的POSTECH研究所，法國(guó)的Genoplant研究所。T-DNA在擬南芥中的插入被認(rèn)為是一個(gè)隨機(jī)的過(guò)程(Sallaud et al., 2004)，而在水稻中的插入則存在熱點(diǎn)，如比較傾向于插入水稻中較大的染色體，傾向于插入遠(yuǎn)離著絲粒的區(qū)域，傾向于插入基因區(qū)，在基因的間隔區(qū)插入比較均一，傾向于插入基因編碼區(qū)(Zhang et al., 2

13、007)。而且T-DNA 插入也有一些缺點(diǎn)如：可能會(huì)引起插入位點(diǎn)的重排、插入過(guò)程中T-DNA的邊界序列容易缺失，并且組織培養(yǎng)容易激活其它元件如Tos17。 Tos17是水稻中的一個(gè)內(nèi)源性的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，全長(zhǎng)4114bp，在栽培稻中含有1-5個(gè)拷貝(Cheng et al., 2006)，并且在日本晴中有兩個(gè)原始拷貝，一個(gè)位于第7染色體上，具有轉(zhuǎn)座子活性，另一個(gè)位于第10染色體上，沒(méi)有轉(zhuǎn)座子活性活性，而現(xiàn)在認(rèn)為第10染色體上一段20bp的堿基缺失，造成其轉(zhuǎn)座活性的缺失。Hirochika等(1996)在1996年發(fā)現(xiàn)了15個(gè)水稻品種“日本晴” 中的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，其中Tos10，Tos17，Tos

14、19在組培的條件下被激活，經(jīng)過(guò)詳細(xì)研究后發(fā)現(xiàn)Tos17具有以下特點(diǎn)：1.Tos17在組培的條件下激活，分化成植株后失活，因此Tos17插入引起的突變可以穩(wěn)定遺傳；2.Tos17的拷貝數(shù)隨著組培的時(shí)間而增多，經(jīng)5個(gè)月的組培后，可平均產(chǎn)生10個(gè)拷貝，可以通過(guò)組培時(shí)間的長(zhǎng)短來(lái)控制轉(zhuǎn)座的拷貝數(shù)；3.突變體產(chǎn)生過(guò)程不涉及轉(zhuǎn)基因。4.Tos17是水稻內(nèi)源性的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，因此在插入植物基因組內(nèi)部時(shí)，一般不會(huì)產(chǎn)生片段的缺失和改變，而且相對(duì)于T-DNA，Tos17突變體的側(cè)翼序列的分離相對(duì)容易。因此Hirochika認(rèn)為T(mén)os17很適合用來(lái)構(gòu)建插入突變體庫(kù)。并構(gòu)建了超過(guò)50,000個(gè)獨(dú)立的再生植株，大約含有5

15、00,000個(gè)插入位點(diǎn)，并對(duì)M2代突變產(chǎn)生的表型進(jìn)行了詳細(xì)的分類(Miyao et al., 2003; 2007)，發(fā)現(xiàn)后代中大約50%的家系出現(xiàn)至少一個(gè)突變表型，在田間出現(xiàn)最多的表型是不育和矮化。但是Tos17突變體庫(kù)也有一些缺點(diǎn)如其插入的拷貝數(shù)多，對(duì)以后的遺傳分析不利；其產(chǎn)生的突變體只有10%是真正由Tos17的插入引起的，其余的突變體是在組培的情況下或是由其它的未知的轉(zhuǎn)座子專座產(chǎn)生的。 Miyao等(2003)通過(guò)大量的Tos17的插入位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)，Tos17在水稻中的插入事件并不是一個(gè)隨機(jī)的過(guò)程，存在熱點(diǎn)，Tos17偏向于插入水稻中的較大的染色體，且插入密度和染色體大小高度相關(guān)。在染色體兩端分布較多，在著絲粒附近和染色體中部分部較少。偏向于插入基因區(qū)，而極度不偏向插入轉(zhuǎn)座子相關(guān)基因和基因間隔區(qū)以及基因調(diào)控區(qū)。偏愛(ài)于插