生物化學(xué)和新生物技術(shù)市公開課金獎(jiǎng)市賽課一等獎(jiǎng)?wù)n件

1、第1頁第十五章生物化學(xué)與新生物技術(shù) 第2頁基因組genome基因組是生物體內(nèi)全部遺傳信息集合一個(gè)物種單倍體一套染色體DNA第3頁幾個(gè)代表物種基因組大小第4頁第5頁基因組學(xué)genomics發(fā)展和應(yīng)用DNA制圖、測(cè)序新技術(shù)以及計(jì)算機(jī)程序，碩士命體（包含人類）全部基因組結(jié)構(gòu)及功效學(xué)科第6頁基因組學(xué)研究最終目標(biāo) 取得生物體全部基因組序列 判定全部基因功效 明確基因之間相互作用關(guān)系 說明基因組進(jìn)化規(guī)律第7頁人類基因組計(jì)劃科學(xué)意義在于：（1）確定人類基因組中約5萬個(gè)編碼基因序列及其在基因組中物理位置，研究基因產(chǎn)物及其功效。（2）了解轉(zhuǎn)錄和剪接調(diào)控元件結(jié)構(gòu)與位置，從整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)宏觀水平上了解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄

2、后調(diào)整。（3）從整體上了解染色體結(jié)構(gòu)，包含各種重復(fù)序列以及非轉(zhuǎn)錄“框架序列”大小和組織，了解各種不一樣序列在形成染色體結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄及表示調(diào)控中影響與作用。（4）研究空間結(jié)構(gòu)對(duì)基因調(diào)整作用。有些基因表示調(diào)控序列與被調(diào)整基因從直線距離上看，似乎相距甚遠(yuǎn)，但若從整個(gè)染色體空間結(jié)構(gòu)上看則恰恰處于最正確調(diào)整位置，所以，有必要從三維空間角度來研究真核基因表示調(diào)控規(guī)律。第8頁（5）發(fā)覺與DNA復(fù)制、重組等相關(guān)序列。DNA忠實(shí)復(fù)制保障了遺傳穩(wěn)定性，正常重組提供了變異與進(jìn)化分子基礎(chǔ)。局部DNA推遲復(fù)制、異常重組等現(xiàn)象則造成疾病或者胚胎不能正常發(fā)育，所以，了解與人類DNA正常復(fù)制和重組相關(guān)序列及其改

3、變，將對(duì)研究人類基因組遺傳與進(jìn)化提供主要結(jié)構(gòu)上依據(jù)。（6）研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病分子機(jī)制，包含遺傳性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引發(fā)分子病理學(xué)改變及其進(jìn)程，為這些疾病診療、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。（7）確定人類基因組中轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)座子和病毒殘余序列，研究其周圍序列性質(zhì)。了解相關(guān)病毒基因組侵染人類基因組后影響，可能指導(dǎo)人類有效地利用病毒載體進(jìn)行基因治療。（8）研究染色體和個(gè)體之間多態(tài)性。這些知識(shí)可被廣泛用于基因診療、個(gè)體識(shí)別、親子判定、組織配型、發(fā)育進(jìn)化等許多醫(yī)療、司法和人類學(xué)研究。另外，這些遺傳信息還有利于研究人類歷史進(jìn)程、人類在地球上分布與遷移以及人類與其

4、它物種之間比較。第9頁History of the Human Genome Project1990 Official start of HGP with 3 billion $ and a 15 year horizon. 1999 Sanger Centre publishes chromosome 22 Draft Genome published: Celera & Public Completion (almost) of Human GenomeCelera:Craig VenterIntl. Cons:Francis Collins第10頁第11頁人類基因組計(jì)劃HGP第12頁全部

5、標(biāo)識(shí)都必須含有多態(tài)性因?yàn)椴荒軐?duì)人類進(jìn)行“選擇性”婚配，而且人類子代個(gè)體數(shù)量有限、世代壽命較長(zhǎng)，呈共顯多態(tài)性蛋白質(zhì)數(shù)量不多，等位基因數(shù)量不多。形態(tài)標(biāo)識(shí)細(xì)胞學(xué)標(biāo)識(shí)生化標(biāo)識(shí)DNA分子標(biāo)識(shí)遺傳標(biāo)識(shí)第13頁第14頁物理圖物理圖是指以已知核苷酸序列DNA片段為“路標(biāo)”，以堿基對(duì)（bp，kb，Mb）作為基本測(cè)量單位（圖距）基因組圖。 酵母第三號(hào)染色體遺傳圖（右）和物理圖（左）比較第15頁策略用機(jī)器進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序，一次可讀400800個(gè)堿基，因?yàn)闇y(cè)定序列長(zhǎng)度有一定限制?？寺≈睾先悍B槍法第16頁克隆重合群法 將基因組DNA切割長(zhǎng)度為0.1Mb1Mb大片段，克隆到Y(jié)AC或BAC載體上 然后再進(jìn)行亞克隆，分別測(cè)定單

6、個(gè)亞克隆序列 再裝配、連接成連續(xù)DNA分子。 這是一個(gè)自上而下（up to down）測(cè)序策略 clone-by-clone method第17頁鳥槍法將較長(zhǎng)基因片段打斷，構(gòu)建一系列隨機(jī)亞克隆，然后測(cè)定每個(gè)亞克隆序列，用計(jì)算機(jī)分析以發(fā)覺重合區(qū)域，最終對(duì)大片段DNA定序。第18頁 全基因組鳥槍法測(cè)序主要步驟：建立高度隨機(jī)、插入片段大小為2kb左右基因組文庫?？寺?shù)要到達(dá)一定數(shù)量，即經(jīng)末端測(cè)序克隆片段堿基總數(shù)應(yīng)到達(dá)基因組5倍以上。高效、大規(guī)模末端測(cè)序。對(duì)文庫中每一個(gè)克隆，進(jìn)行兩端測(cè)序序列集合。填補(bǔ)缺口。有兩種待填補(bǔ)缺口，一是沒有對(duì)應(yīng)模板DNA物理缺口，二是有模板DNA但未測(cè)序序列缺口。第19頁測(cè)序

7、技術(shù)Sanger雙脫氧鏈終止法Maxam-Gilbert化學(xué)修飾法高通量測(cè)序技術(shù)第20頁高通量DNA序列分析技術(shù) 人類基因組計(jì)劃成功很大程度上得益于有效降低DNA測(cè)序成本技術(shù)更新。經(jīng)過改良測(cè)序方法，不停提升其自動(dòng)化程度，DNA測(cè)序成本降低了100倍，從20世紀(jì)70-80年代$10/bp降低到本世紀(jì)初$0.1/bp！假如一個(gè)熟練DNA序列分析人員采取早期80年代方法天天測(cè)定1000 bp計(jì)算，人類基因組（約3109bp）全序列分析，最少也得需要100名這么工人花上1時(shí)間才能完成。而代高通量測(cè)序儀可到達(dá)月測(cè)序1-6 Mbp！第21頁第二代測(cè)序技術(shù) “Next Generation” Roche 4

8、54：Pyrosequencing Solexa/Illumina：cyclical base addition ABI SOLiD：sequencing by ligation第22頁Illumina / Solexa Genome Analyzer Mb / runApplied Biosystems ABI 3730XL1 Mb / day Roche / 454 Genome Sequencer FLX100 Mb / runApplied BiosystemsSOLiD3000 Mb / run第23頁第24頁功效基因組學(xué) 在完成一個(gè)生物體全部基因組測(cè)序基礎(chǔ)上，詳盡分析基因組序列，判

9、定基因組全部基因功效，描述各個(gè)基因表示和調(diào)控模式。 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究某一特殊功效狀態(tài)細(xì)胞全套R(shí)NA類型與拷貝數(shù)；比較不一樣功效狀態(tài)下RNA表示改變，搜尋與功效狀態(tài)改變緊密相關(guān)主要基因群。此研究領(lǐng)域慣用技術(shù)是生物芯片技術(shù)。 蛋白質(zhì)組學(xué)指蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域，即研究某一特定狀態(tài)細(xì)胞全套蛋白質(zhì)表示譜。此研究領(lǐng)域慣用技術(shù)有蛋白質(zhì)雙向電泳、飛行質(zhì)譜、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等。第25頁轉(zhuǎn)錄組指一個(gè)細(xì)胞內(nèi)一套R(shí)NA轉(zhuǎn)錄物，包含了某一環(huán)境條件、某一生命階段、某一生理或病理（功效）狀態(tài)下，生命體細(xì)胞或組織所表示基因種類和水平。mRNA小RNA：miRNA、siRNA蛋白質(zhì)組指一個(gè)細(xì)胞內(nèi)全套蛋白質(zhì)，即研究某一特定狀態(tài)細(xì)胞全套蛋白

10、質(zhì)表示譜。此研究領(lǐng)域慣用技術(shù)有蛋白質(zhì)雙向電泳、飛行質(zhì)譜、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等。與基因組不一樣是，轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組定義中包含了時(shí)間和空間限定。 第26頁轉(zhuǎn)錄組學(xué)基本研究方法Real-time PCR基于雜交轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法基因芯片基于測(cè)序轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法EST全長(zhǎng)cDNA文庫SAGE第二代測(cè)序技術(shù)生物信息學(xué)分析：基因表示聚類第27頁生物芯片在載體材料上，以大規(guī)模陣列形式排布了不一樣蛋白質(zhì)或核酸等生物分子，形成可與目標(biāo)靶分子相互作用，并進(jìn)行反應(yīng)固相表面。第28頁DNA芯片經(jīng)過微陣列(Microarray)技術(shù)將高密度DNA片段陣列經(jīng)過高速機(jī)器人或原位合成方式以一定次序或排列方式使其附著在固相表面，以熒光標(biāo)識(shí)D

11、NA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量DNA檢測(cè)基因組芯片表示芯片第29頁芯片載體玻璃片、硅片、尼龍膜、凝膠、金屬對(duì)載體進(jìn)行化學(xué)修飾，活化試劑經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)在載體表面鍵合上活性基團(tuán)，方便與配基結(jié)合，形成含有生物活性親和表面，用于固定蛋白質(zhì)和核酸活化試劑：EDC、NHS活性基團(tuán)：氨基、環(huán)氧化物、巰基、醛基第30頁基因芯片探針寡核苷酸OligocDNA：PCR產(chǎn)物 第31頁Spotted MicroarrayscDNA ArraysOligo Arrays In Situ Oligo SynthesisPhotosynthesisPlaner surfaceMicrofluidics chipE-

12、field synthesisIntegrated Chips Integrated uF, microarray and detection chips with PCR, fluorescence or e-detectionMicrofluidicsPlasticsCeramics SiliconOther materials不一樣生物芯片技術(shù)平臺(tái)點(diǎn)樣芯片原位合成芯片微流體芯片整合型芯片第32頁點(diǎn)樣芯片非接觸式接觸式預(yù)先合成好探針經(jīng)過類似于噴墨打印機(jī)技術(shù)噴射到玻璃基片表面，或者用針頭點(diǎn)在片基上。 第33頁原位合成激光照排技術(shù)光源遮蔽板芯片第34頁array probesA 33 arra

13、yCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGA Mask 1AAAAA探針合成第35頁array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGC Mask 2CCCCCCAAAAA探針合成第36頁A 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGG Mask 3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC探針合成完成芯片第37頁LTLLLCLLLLLL

14、LLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPLTLLLCLLLLLLLLACTTTACCCCCCGCCGATATCATCATCGACGAACTACTAGCAGCTTOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPOPFor growth step: one type of monomer is coupled to specific

15、sites deprotected using PGA.Computer generated light irradiation patterns第38頁樣本處理方法按照樣本分 DNA、RNA、DNA-蛋白復(fù)合體按照標(biāo)識(shí)信號(hào)分子劃分 熒光染料、生物素、放射性元素按照標(biāo)識(shí)方法分 cDNA 直接標(biāo)識(shí)(間接標(biāo)識(shí))、PCR擴(kuò)增標(biāo)識(shí)、末端標(biāo)識(shí)第39頁芯片試驗(yàn)流程1、分離RNA（10g）2、標(biāo)識(shí)3、雜交 （預(yù)雜交）4、洗片5、掃描6、數(shù)據(jù)分析第40頁Tagged RNA fragments flushed over arrayLaser activation of fluorescent tagsOpti

16、cal scanning of hybridization intensities基因芯片雜交試驗(yàn)第41頁圖像掃描Cy5Cy3第42頁差異基因篩選原理：采取cy3/cy5ratio值對(duì)差異基因進(jìn)行判斷，或采取統(tǒng)計(jì)方法對(duì)差異基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷。倍數(shù)法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.5第43頁基因芯片應(yīng)用基因表示譜分析基因發(fā)覺SNP檢測(cè)藥品基因組學(xué)微生物菌種判定預(yù)防醫(yī)學(xué)研究第44頁RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測(cè)序）：利用深度測(cè)序技術(shù)對(duì)各種類型轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行高通量檢測(cè)，取得RNA片段在特定樣本中含量第45頁定量化能夠直接測(cè)定每個(gè)轉(zhuǎn)錄本片段序列、單核苷酸分辨率準(zhǔn)確度，同時(shí)不存在傳統(tǒng)微陣列雜

17、交熒光模擬信號(hào)帶來交叉反應(yīng)和背景噪音問題靈敏度高，能夠檢測(cè)細(xì)胞中少至幾個(gè)拷貝稀有轉(zhuǎn)錄本能夠?qū)θ我馕锓N進(jìn)行全基因組分析，無需預(yù)先設(shè)計(jì)特異性探針，所以無需了解物種基因信息，能夠直接對(duì)任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，同時(shí)能夠檢測(cè)未知基因，發(fā)覺新轉(zhuǎn)錄本第46頁蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)組：一個(gè)細(xì)胞（或組織、機(jī)體）所表示全部蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)組學(xué)：以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，研究細(xì)胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)及其動(dòng)態(tài)改變規(guī)律科學(xué)本質(zhì)是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)特征：表示水平 （量）翻譯后修飾（成熟與調(diào)控）蛋白與蛋白相互作用（信號(hào)通路）等由此取得蛋白質(zhì)水平上關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程整體而全方面認(rèn)識(shí) 第47頁蛋白質(zhì)組學(xué)研究范圍蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)間相互作

18、用蛋白質(zhì)和核酸之間相互作用蛋白質(zhì)及其組成質(zhì)點(diǎn)分離、分析、判定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析生理、病理或不一樣發(fā)育狀態(tài)下蛋白質(zhì)組表示差異蛋白質(zhì)信息庫第48頁研究策略與技術(shù)兩條互補(bǔ)試驗(yàn)流程基于凝膠工作流程基于液相色譜工作流程第49頁雙向電泳（2D）第50頁是等電聚焦電泳和SDS組合即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離）然后再進(jìn)行SDS（按照分子大?。┠z經(jīng)染色得到二維分布蛋白質(zhì)圖 第51頁第一向IPG-IEF電泳固相pH梯度等電聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing）IEF是一個(gè)依據(jù)樣品等電點(diǎn)不一樣而使它們?cè)趐H梯度中相互分離一個(gè)電泳技術(shù)將等電點(diǎn)不一樣蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過一定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)對(duì)應(yīng)pH位置上，形成份離蛋白質(zhì)區(qū)帶第52頁第二向垂直SDS電泳SDS- PAGE：十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis）聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，含有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng) 。SDS與蛋白質(zhì)形成雪茄狀帶負(fù)電荷復(fù)