基因工程第六章

1、基因工程第六章第1頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 由DNA分子的體外重組，通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等適當(dāng)途徑引入宿主，會(huì)得到大量的重組體細(xì)胞或噬菌體。在這些眾多的重組體中，會(huì)有多種類(lèi)型的DNA分子，包括：不帶任何外源DNA插入片段，僅由線性載體分子自身連接形成的環(huán)狀DNA分子；由一個(gè)載體分子和一個(gè)或數(shù)個(gè)外源DNA片段構(gòu)成的重組體DNA分子；單純由數(shù)個(gè)外源DNA片段彼此連接形成的多聚DNA分子。 第2頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 對(duì)于這些由混合的DNA制劑轉(zhuǎn)化而來(lái)的大量的克隆群體，需要采用特殊的方法，才能選擇和鑒定出可能含有目的基因的重組體克隆。

2、目前已發(fā)展和應(yīng)用了一系列重組體克隆檢測(cè)法，包括遺傳檢測(cè)法、物理檢測(cè)法、使用特異性探針的核酸雜交法，以及免疫化學(xué)法等。 第3頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 6.1 利用表型特征選擇（遺傳檢測(cè)法） 表型是指機(jī)體遺傳組成同環(huán)境相互作用所產(chǎn)生的外觀或其他特征。這里所說(shuō)的供篩選用的表型特征來(lái)自兩個(gè)方面：一個(gè)是克隆載體提供的，另一方面是插入的外源DNA序列提供的，前者應(yīng)用較多。 第4頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 6.1.1 利用載體提供的表型特征選擇重組體分子 1. 抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法 檢測(cè)外源DNA插入作用的一種通用的方法是插入失活效應(yīng)。例如在

3、pBR322質(zhì)粒的DNA序列上，編碼有四環(huán)素抗性基因(Tetr)和氨芐青霉素抗性基因(Ampr)，且在Tetr基因內(nèi)有Bam HI和Sal I兩種限制酶的單一切點(diǎn)。在這兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)中的任何插入作用，都會(huì)導(dǎo)致Tetr基因出現(xiàn)功能性失活，因而根據(jù)AmprTets表型即可篩選出在Tetr基因內(nèi)帶有插入DNA片段的重組體細(xì)胞。 第5頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二第6頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 利用環(huán)絲氨酸富集法可以簡(jiǎn)化這種插入失活檢測(cè)法的程序，該法可以使那些只帶有原來(lái)質(zhì)粒載體的細(xì)菌致死，從而抑制不含有插入DNA片段的載體分子形成轉(zhuǎn)化子。例如： 當(dāng)

4、外源DNA 插入在pBR322質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因(Tetr)上，該基因便會(huì)立即失去它的功能作用，而另一種抗菌素抗性基因氨芐青霉素基因(Ampr)，則仍然是完整的。將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌培養(yǎng)物移至含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，經(jīng)過(guò)這樣的選擇作用而得以存活下來(lái)的所有細(xì)胞，都應(yīng)該帶上了pBR322質(zhì)粒分子。 第7頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 在這些pBR322質(zhì)粒分子中，有一部分是在其Tetr基因序列內(nèi)具有DNA插入片段的重組質(zhì)粒。把這種富集了的培養(yǎng)物作適當(dāng)?shù)南♂尯?，轉(zhuǎn)接到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，于是在其pBR322質(zhì)粒分子的Tetr基因序列中帶有DNA插入片段的所有細(xì)胞，都將

5、停止生長(zhǎng)（注意：四環(huán)素不會(huì)使細(xì)胞死亡，只是抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)）。最后加入環(huán)絲氨酸，就會(huì)促使所有正在生長(zhǎng)著的細(xì)胞發(fā)生溶胞反應(yīng)，那些沒(méi)有發(fā)生溶胞反應(yīng)而存活下來(lái)的細(xì)胞，大約有90100%都帶有pBR322重組質(zhì)粒，且在其Tetr基因上都含有一個(gè)插入的外源DNA片段，這些細(xì)胞可通過(guò)離心作用收集起來(lái)。 第8頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 此外，在pBR322質(zhì)粒的Ampr基因序列中，也有一個(gè)Pst I限制酶的唯一識(shí)別位點(diǎn)。Ampr基因正常情況下表達(dá)產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，在其作用下青霉素會(huì)變成青霉酮酸，當(dāng)加入碘-青霉素指示液（30% I2，1.5% KI，5%青霉素G，0.05M的pH 6

6、.4的磷酸緩沖液），AmprTetr菌落為無(wú)色透明。但當(dāng)pBR322質(zhì)粒的Ampr基因插入失活后，AmprTets菌落在碘-青霉素指示液中不褪色，仍呈碘的藍(lán)灰色。根據(jù)菌落周?chē)甘疽侯伾母淖兣c否，很容易鑒別出重組體菌落。第9頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二第10頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需把每一個(gè)轉(zhuǎn)化子接種在Amp和Tet平板上，直接在轉(zhuǎn)化平板上即可鑒定。其缺點(diǎn)是由于把指示液直接加入選擇平板內(nèi)，極易超成菌落之間的相互污染，給其后的鑒定帶來(lái)困難。目前使用紙片法使這一方法得到了改善：預(yù)先將一定大小的紙片浸泡在指示液中，干燥后

7、密閉保存，使用時(shí)只要將紙片覆蓋在轉(zhuǎn)化平板上，數(shù)分鐘內(nèi)就可以觀察到結(jié)果。 第11頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 2. -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 將pUC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，培養(yǎng)在補(bǔ)加有X-gal和乳糖誘導(dǎo)物IPTG的培養(yǎng)基中時(shí)，由于基因內(nèi)互補(bǔ)作用形成的有功能的半乳糖苷酶，會(huì)把培養(yǎng)基中無(wú)色的X-gal切割成半乳糖和深藍(lán)色的底物，使菌落呈現(xiàn)出藍(lán)色反應(yīng)。 當(dāng)pUC質(zhì)粒載體的lacZ 序列插入了外源DNA片段時(shí)，會(huì)阻斷讀碼結(jié)構(gòu)，使其編碼的肽失去活性，結(jié)果產(chǎn)生出白色的菌落。因此，根據(jù)這種-半乳糖苷酶的顯色反應(yīng)，便可以檢測(cè)出含有外源DNA插入序列的重組體克隆。 第12頁(yè)，共35頁(yè)，2

8、022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 6.1.2 利用插入序列提供的表型特征選擇重組體分子 這種選擇法要求所克隆的DNA片段是一個(gè)完整的序列，而且能夠在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)功能的表達(dá)。其依據(jù)的基本原理是：轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源DNA編碼的基因，能夠?qū)Υ竽c桿菌寄主菌株所具有的突變發(fā)生體內(nèi)抑制或互補(bǔ)效應(yīng)，從而使被轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞表現(xiàn)出外源基因編碼的表型特征。例如小鼠的二氫葉酸還原酶（DHFR）的分離： 第13頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 先將含有DHFR-mRNA的小鼠總mRNA制劑反轉(zhuǎn)錄成cDNA拷貝，構(gòu)建cDNA基因文庫(kù)。根據(jù)小鼠DNFR對(duì)于藥物三甲氧芐二氨嘧啶呈現(xiàn)抗性這種性狀

9、特征，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌生長(zhǎng)在含有三甲氧芐二氨嘧啶的培養(yǎng)基中（其含量水平為可以抑制大腸桿菌的DHFR的活性），選擇轉(zhuǎn)化子。這樣分離出來(lái)的抗性克隆，顯然都是由于具有小鼠DHFR基因的克隆片段，賦予寄主細(xì)胞新的抗性表型所致。 第14頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 6.1.3 利用噬菌斑形態(tài)選擇重組體分子 把DNA包裝成有活性的噬菌體顆粒，主要取決于兩個(gè)因素：一是要具有能被噬菌體包裝蛋白和頭部前體所識(shí)別的區(qū)域，即cos區(qū)；二是DNA的長(zhǎng)度，只有重組體DNA是野生型 DNA的75105%的長(zhǎng)度時(shí)，才能在培養(yǎng)平板上形成清晰的噬菌斑，而單一的載體DNA是不會(huì)包裝成活的噬菌體顆粒的。第1

10、5頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 經(jīng)體外包裝，轉(zhuǎn)導(dǎo)后能否形成清晰噬菌斑，尤其是對(duì)替換型載體，本身就是一種可利用的選擇標(biāo)記。 另外cI基因插入失活后，會(huì)誘發(fā)溶源性細(xì)菌的原噬菌體進(jìn)入溶菌周期，根據(jù)產(chǎn)生噬菌斑的清晰與混濁，也可以進(jìn)行選擇。第16頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 6.2 利用核酸雜交篩選 從基因文庫(kù)中篩選帶有目的基因插入序列的克隆，最廣泛使用的一種方法是核酸分子雜交技術(shù)。它所依據(jù)的原理是放射性同位素（32P或125I）標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行DNA-DNA或DNA-RNA雜交，利用同源DNA堿基配對(duì)的原則檢測(cè)特定的重組克隆。第17頁(yè)

11、，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 核酸雜交篩選法的最大優(yōu)點(diǎn)是它可以普遍廣泛地應(yīng)用，尤其適合于大量群體的篩選，只要有現(xiàn)成可用的特異性探針，就可以有效地檢測(cè)任何一種插入的外源DNA序列，而不以這種序列能否在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)為前提。第18頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 6.2.1 原位雜交篩選 生長(zhǎng)在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑，按照其原來(lái)的位置不變地影印在硝酸纖維素濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用，而將母板很好地保存起來(lái)。因?yàn)樽冃訢NA同硝酸纖維素濾膜有很強(qiáng)的親和力，便在膜上形成DNA的印跡，在80下烘烤濾膜，使DNA牢固地固定下來(lái)

12、。第19頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 用放射性同位素標(biāo)記的RNA或DNA為探針同濾膜上的菌落所釋放的變性DNA雜交，并用放射自顯影技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，凡是含有與探針互補(bǔ)序列的菌落DNA，就會(huì)在X光膠片上出現(xiàn)曝光點(diǎn)。根據(jù)曝光點(diǎn)的位置，便可以從保留的母板上相應(yīng)位置挑出所需要的陽(yáng)性菌落或噬菌斑，這就是所需要的含有目的基因插入片段的重組體克隆。第20頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 6.2.2 核酸雜交檢測(cè)的探針 進(jìn)行核酸分子雜交的前提是要有特定的DNA或RNA作探針。具有一定已知序列的核酸片段，大小通常為20kb左右，再帶上一定的探測(cè)標(biāo)記，就構(gòu)成了核酸探

13、針。它可以通過(guò)分子雜交與待測(cè)基因的DNA序列結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號(hào)，從而把待測(cè)基因的質(zhì)和量顯示出來(lái)。第21頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 1. 放射性探針 廣泛使用的探針，多是以32PdNTP為標(biāo)記前體，通過(guò)缺口轉(zhuǎn)移的方法，把天然DNA或RNA片段標(biāo)記上放射性同位素。 此外還可以化學(xué)合成DNA探針，只要已知目的基因產(chǎn)物的部分氨基酸序列，就可以從這個(gè)信息中，反推出基因編碼區(qū)可能的核苷酸排列順序。選擇一小段含有獨(dú)特密碼子（Met和Try）或簡(jiǎn)并性最小的密碼子（Cys、His、Phe和Tyr等）的氨基酸序列，用化學(xué)法合成出相當(dāng)于這些密碼子序列的寡核苷酸片段（1020個(gè)堿基）混和

14、物；然后利用多核苷酸激酶，將32PdNTP轉(zhuǎn)移到合成的DNA的5-OH末端（稱(chēng)為末端標(biāo)記 ），即成為標(biāo)記好的探針。第22頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二一個(gè)密碼子： Met （甲硫氨酸） AUG Try （色氨酸） UGG二個(gè)密碼子： Cys （半胱氨酸） His （組氨酸） Phe （苯丙氨酸） Try （酪氨酸） Lys （賴(lài)氨酸） 第23頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 2. 非放射性探針 由于32P放射性同位素半衰期只有14.3天，不易保存，且對(duì)人體有一定的損害，因而近年來(lái)又研制了非放射性物質(zhì)標(biāo)記核酸的方法，如糖基化探針、生物素探針、毛地

15、黃苷標(biāo)記等。 用生物素標(biāo)記DNA形成探針是目前用得較多的一種，它可以采用酶促或光促生物素來(lái)標(biāo)記核酸。酶促法是利用缺口轉(zhuǎn)移的方法，但標(biāo)記前體不是32PdTTP，而是用嘧啶環(huán)C5位連接了生物素的dTTP（或dUTP），它可以有效地?fù)饺隓NA中形成生物素探針。第24頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 光促法使用的試劑為光敏生物素乙酸鹽，它是由光敏基團(tuán)、連接臂和生物素組成的。光敏基團(tuán)可在光照下活化，與核酸的堿基結(jié)合，連接臂可以降低生物素基團(tuán)對(duì)核酸雜交的空間位阻；生物素用做標(biāo)記物。將待標(biāo)記的核酸（DNA或RNA）與光敏生物素乙酸鹽混合，在近紫外的光源（如高壓汞燈、碘鎢燈）下照射15

16、20分鐘，就可將生物素標(biāo)記在單鏈或雙鏈的DNA或RNA上，形成穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合。第25頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 標(biāo)記好的生物素探針，可用于核酸的雜交反應(yīng)，然后用親和素-酶系統(tǒng)來(lái)顯示。親和素可以特異地與生物素結(jié)合，酶可與底物反應(yīng)進(jìn)行顯色或化學(xué)發(fā)光，這就相當(dāng)于放射性同位素探針雜交后的放射自顯影。最常用的工具酶是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。 非放射性方法進(jìn)行核酸雜交，其靈敏度不如放射性方法高，但非放射性探針具有安全、穩(wěn)定、使用方便等優(yōu)點(diǎn)，是一種正在發(fā)展很有前途的方法。第26頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 6.3 利用免疫學(xué)方法

17、篩選 免疫學(xué)方法專(zhuān)一性很強(qiáng)、靈敏度很高，其基本原理是：以目的基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物（多肽）作抗原，以該基因產(chǎn)物的免疫血清作抗體，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)將目的基因克隆檢出。 免疫學(xué)方法可以分為兩種：即放射性抗體測(cè)定法和免疫沉淀測(cè)定法。這些方法最突出的優(yōu)點(diǎn)是，它們直接檢測(cè)重組克隆所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物，能夠檢測(cè)無(wú)任何可供選擇的表型特征的重組克隆。當(dāng)然這種方法必須具備有效的特異性抗體。第27頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二6.3.1 放射性抗體測(cè)定法 這一方法所依據(jù)的原理為： (1) 一種免疫血清含有好幾種特異性抗體（IgG），它們識(shí)別抗原分子上的不同定子，并分別同各自識(shí)別的抗原定子

18、相結(jié)合； (2) 抗體分子或抗體的F(ab)部分，能夠十分牢固地吸附在固體基質(zhì)（如聚乙烯等塑料制品）上，而不會(huì)被洗脫掉； (3) 通過(guò)體外碘化作用，IgG抗體便會(huì)迅速地被放射性同位素125I標(biāo)記上。第28頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二 放射性抗體測(cè)定的主要程序是：(1) 首先把轉(zhuǎn)化的菌落涂布在平板上，長(zhǎng)出菌落以后，再影印到另一塊平板上繼續(xù)培養(yǎng)，并保留原來(lái)的平板作為母板；(2) 待影印平板上的菌落長(zhǎng)好后，置于含有氯仿飽和氣體的容器中使菌落裂解，陽(yáng)性菌落便釋放出抗原；(3) 將吸附了未標(biāo)記IgG抗體的聚乙烯薄膜覆蓋在平板表面，如果抗原與抗體具有對(duì)應(yīng)關(guān)系，則在薄膜上形成抗原-抗體復(fù)合物；第29頁(yè)，共35頁(yè)，2022年，5月20日，12點(diǎn)7分，星期二(4) 取下聚乙烯薄膜，再用125