新型冠狀病毒核酸檢測標(biāo)本的采集、運送及保存（新冠肺炎核酸檢測學(xué)習(xí)專家課堂）

1、新型冠狀病毒核酸檢測標(biāo)本的采集、運送及保存病毒及新型冠狀病毒簡介病毒及其基本特點一病毒：病毒是一類由核酸、蛋白質(zhì)等成分組成的非細(xì)胞型的微生物，并以感染和非感染兩種狀態(tài) 存在，其本質(zhì)是一類只含DNA或RNA的遺傳因子病毒基本特點：微小，能通過細(xì)菌濾器，電子顯微鏡才能觀察到；無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要成分是核酸和蛋白質(zhì)；每種病毒只含一種類型的核酸（DNA or RNA）；因缺乏完整的酶系統(tǒng)和能源，只能寄生于活細(xì)胞內(nèi)，依靠細(xì)胞的代謝系統(tǒng)合成核酸和蛋白質(zhì)， 利用宿主的細(xì)胞系統(tǒng)進(jìn)行自我復(fù)制，但無法獨立生長和復(fù)制；具備從一個宿主轉(zhuǎn)移到另一個宿主的能力，病毒可以感染所有的具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生命體；在宿主體外，能以生物大分

2、子狀態(tài)存在，并可長期保持其侵染能力；對一般抗生素不敏感，但對干擾素敏感；部分病毒的核酸能整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并能誘發(fā)潛伏感染呼吸道病毒感染的特點二病毒是活細(xì)胞的寄生物，對人類有較強感染性和傳染性的病毒可在人群中引起病毒性傳染病的暴發(fā) 流行，給人類健康和生命造成巨大危害；病原學(xué)復(fù)雜，傳染性強，易在人群中照常爆發(fā)流行：非典、甲流、手足口病、新型冠狀病毒感染肺 炎等；病毒是一個特殊的生物群體，會隨地域和環(huán)境的變化而發(fā)生相應(yīng)的變異；有明顯的季節(jié)性特點，與 環(huán)境溫濕度有密切的關(guān)系。大部分情況下，病毒的侵入部位、侵入后繁殖部位以及由此引發(fā)的組織及免疫病理改變和臨床癥狀 體征多在呼吸道，大多數(shù)病毒不通

3、過血液侵入機體其他部位，故往往查不出病毒血癥；感染后獲得的免疫力一般不持久；臨床上出現(xiàn)癥狀時，病毒滴度已達(dá)高峰，故預(yù)防比抗病毒治療更有效；早診斷、早隔離、早治療！冠狀病毒三冠狀病毒是一類具有囊膜的線性單股正鏈RNA病毒，基因組大小約27-31kb。冠狀病毒5端 具有帽狀結(jié)構(gòu)，3端具有poly(A)結(jié)構(gòu)，是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒。冠狀病毒僅感染脊椎動物，可引起人和動物呼吸道、消化道和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。于1937年在禽 類發(fā)現(xiàn)，1965年在人群中發(fā)現(xiàn)感染。1968年，Tyrrell、D.A.J等人從普通感冒患者鼻沖洗液接 種到人胚氣管細(xì)胞，鑒定為人冠狀病毒。根據(jù)血清型和基因組特點，冠狀病

4、毒亞科被分為、和四個屬。截至目前，已知感 染人的冠狀病毒共有7種，其中屬有HCoV-229E和HCoV-NL63，屬有HCoV-OC43、 HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV以及此次爆發(fā)流行的SARS-CoV-2。新型冠狀病毒四2019年12月以來，湖北省武漢市發(fā)現(xiàn)多起病毒性肺炎病例，2020年1月7日，相關(guān)實驗室檢測出并證實為一種新型冠狀病毒（ SARS-CoV-2 ）。 屬于屬的冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形， 常為多形性，直徑60-140nm。其基因特征與SARS-CoV和MERS-CoV有明顯區(qū)別。兩端為非編碼區(qū)，中間為非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)和結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)。非結(jié)構(gòu)

5、蛋白編碼區(qū)主要包括開放讀碼框架ORF1a和ORF1b基因，編碼16個 非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)主要編碼刺突（spike，S）蛋白、包膜（envelope，E）蛋白、 膜（membrane，M ）蛋白和核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白。據(jù)日前研究表明：SARS-CoV-2感染細(xì)胞的方式，是其外殼上的刺突蛋白（S Protein）與人體細(xì) 胞的ACE2受體作用從而入侵細(xì)胞，是侵染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵，其親和力是SARS病毒的10-20倍。新型冠狀病毒武漢株02照片來源：國家病原微生 物資源庫(中國疾病預(yù)防控 制中心病毒病預(yù)防控制所)新型冠狀病毒標(biāo)本采集標(biāo)本的采集、運送和保存標(biāo)本的采集、運送及

6、保存是病毒病原學(xué)診斷的基本環(huán)節(jié)。標(biāo)本的類型（取材的 部位）標(biāo)本運送培養(yǎng)基標(biāo)本運送的時間和條 件病原學(xué) 診斷標(biāo)本的采集和運送病毒保存液（非滅活）低溫運送采集拭子樣本保存液（滅活） 塑料桿的植絨或纖維拭子木桿棉拭子（棉棒）標(biāo)本采集要求標(biāo)本采集要求經(jīng)過生物安全培訓(xùn)（培訓(xùn)合格）且具備相應(yīng)的實驗技能，操作熟練、規(guī)范；做好個人防護(hù)：N95及以上防護(hù)口罩、護(hù)目鏡、連體防護(hù)服、雙層乳膠手套、防水靴套； 如果接觸了患者血液、體液、分泌物或排泄物，應(yīng)及時更換外層乳膠手套；住院病例的標(biāo)本有所在醫(yī)護(hù)人員采集；密切接觸者標(biāo)本由當(dāng)?shù)刂付ǖ募部貦C構(gòu)、醫(yī)療機構(gòu)負(fù)責(zé)采集轉(zhuǎn)運載體（采樣液）的選擇病毒保存液：可用1640，DMEM

7、， Hanks，Eagles等。為防止采樣液 生長細(xì)菌和真菌，在采樣液中需加入抗菌素。運送培養(yǎng)基的性能體現(xiàn)在以下三個方面：抑菌效果好對病毒活毒的保存時間長有利于病毒的進(jìn)一步研究可滅活的樣本保存液：一般為含胍鹽的病毒裂解液滅活病毒，降低轉(zhuǎn)運及檢測的風(fēng)險可使RNA酶滅活，減少RNA降解，提高檢出率不同采樣液新冠核酸檢測結(jié)果的比較病毒保存液含病毒裂解液的樣本保存液采樣管的選擇：僅用于核酸檢測的樣本（不培養(yǎng)病毒）建議用含病毒裂解液的采樣管取材降低轉(zhuǎn)運和檢測風(fēng)險可以減少病毒核酸的降解有利于提高病毒低拷貝數(shù)標(biāo)本的檢出清楚樣本保存液的成分及作用裂解病毒、抑制RNA酶活性減少病毒核酸降解裂解病毒、抑制RNA酶

8、活性減少病毒核酸降解、增大核酸沉降系數(shù)有利核酸的分離標(biāo)本采集種類采集急性期呼吸道標(biāo)本（包括上呼吸道及下呼吸道），重癥優(yōu)先采集下呼吸道標(biāo)本； 根據(jù)臨床需要可留取便標(biāo)本、全血標(biāo)本、血清標(biāo)本標(biāo)本種類上呼吸道標(biāo)本：鼻拭子、咽拭子等；急性期采集，最好在發(fā)病三天內(nèi)采集下呼吸道標(biāo)本：深咳痰、肺泡灌洗液、支氣管灌洗液、呼吸道吸取物等便標(biāo)本：如果不便于留取便標(biāo)本，可采集肛拭子血液標(biāo)本：盡量采集發(fā)病后7天內(nèi)的急性期抗凝血，EDTA抗凝血清標(biāo)本：盡量采集急性期、恢復(fù)期雙份血清，急性期血清在發(fā)病7天內(nèi)采集， 第二份（恢復(fù)期）在發(fā)病后3-4周采集。血清標(biāo)本主要用于抗體的測的急性期樣本采集采集部位：扁桃體、咽后壁纖維拭子

9、口咽拭子（ OPS ）采集部位：鼻咽腔后壁。植絨拭子鼻咽拭子（NPS）急性期采集：最好發(fā)病72小時內(nèi)，晨起后。咽拭子采集方法1） 準(zhǔn)備咽拭子（生理鹽水浸濕甩干）光源和壓舌板囑患者發(fā)長“啊” 音，將拭子越過舌根，在兩側(cè)扁桃 稍用力來回擦拭數(shù)次，再在咽后壁擦拭數(shù)次置拭子于標(biāo)本保存液中，折斷并擰緊管蓋，貼上條形碼 后保存于冰箱待送檢咽喉壁扁桃體正確錯誤鼻拭子采集取鼻拭子（生理鹽水浸濕甩干），從鼻腔沿下 鼻道的底部向后緩緩進(jìn)入（如圖示）至有阻力（長度約為鼻孔到耳根）輕輕旋轉(zhuǎn)一周（如遇反射性咳嗽，應(yīng)停留片刻）， 然后緩慢取出拭子置拭子于標(biāo)本保存液中，折斷并蓋好貼上條形碼 后保存于冰箱待送檢深咳痰：咳出的

10、痰收集于含采樣液的螺口塑料管中。如果痰液未收集 于采樣液中，可在檢測前加入2-3ml采樣液或等體積的痰消化液支氣管灌洗液：將收集器頭部從鼻孔或氣管插口處插 入氣管（約30cm深，注入5ml生理鹽水，接通負(fù)壓， 旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用 采樣液沖洗收集器1次（亦可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注 射器上來替代收集）肺泡灌洗液：局麻后，通過纖支鏡操作痰液氣管插管抽吸物支氣管肺泡灌洗液鼻咽抽取物發(fā)病早期氣管抽取物發(fā)病各期方法：用與負(fù)壓泵相連的收集器從鼻咽部抽取粘液或從氣管抽取呼吸道分泌物。將收集器頭部插入鼻腔或氣管，接通負(fù)壓，旋轉(zhuǎn)收集器頭部并緩慢退出， 收集抽取的粘液，并用3ml采樣

11、液沖洗收集器1次；亦可用小孩導(dǎo)尿管接在50ml注射器上來替代收集器?？捎貌《颈４嬉核蜋z，也可直接將粘液送檢！ 盛放容器：無菌、帶墊圈的50ml螺口塑料管；鼻咽抽取物或呼吸道抽取物糞便標(biāo)本：取1ml標(biāo)本處理液，挑取黃豆粒大小的糞便加至管中，輕輕吹打3-5次，室溫靜置10分鐘，8000rpm離心5分鐘，取上清檢測肛拭子：用消毒棉拭子輕輕插入肛門3-5cm處，再輕輕旋轉(zhuǎn)退出，放入含保 存液的管中，棄去尾部，旋緊管蓋。血液標(biāo)本：EDTA抗凝血清標(biāo)本：急性期和恢復(fù)期雙份血清不合格標(biāo)本未取到細(xì)胞，PCR擴(kuò)增結(jié)果：內(nèi)參陰性新型冠狀病毒的運送與保存標(biāo)本的運送外包裝所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶螺旋蓋內(nèi)有墊圈、耐冷

12、凍的樣本采集管里，擰緊管蓋采樣管標(biāo)識清楚，條碼信息包括：姓名、樣本種類、樣本編號、采樣日期等。運輸前盡可能對容器外壁做好消毒送檢：樣本采集后盡快送實驗室檢測。標(biāo)本的運送國內(nèi)運輸：標(biāo)本采集后，按照A類感染性物 質(zhì)的包裝，即三層包裝：主容器（防水、密 封、防泄漏，如裝標(biāo)本的試管等）、輔助容 器（防水、耐95kPa的壓力、無滲漏，如塑料罐等）和外包裝（在輔助容器外的保護(hù)層， 具有足夠的強度，如運輸箱或一次性運輸包 裝等）對標(biāo)本進(jìn)行包裝后，由經(jīng)過生物安全 培訓(xùn)并培訓(xùn)合格的至少兩名專業(yè)人員、配有 生物危害物質(zhì)溢出緊急處理箱的專車運送。 如需長途運輸?shù)?，?biāo)本需置干冰中運輸。標(biāo)本的運送國際運輸新型冠狀病毒毒

13、株或樣本在國際間運輸?shù)?，?yīng)規(guī)范包裝，按 照出入境特殊物品衛(wèi)生檢疫管理規(guī)定辦理相關(guān)手續(xù)，并滿足相關(guān) 國家和國際相關(guān)要求。標(biāo)本的保存用于病毒分離和核酸檢測的標(biāo)本應(yīng)盡快進(jìn)行檢測；24小時內(nèi)檢測的標(biāo)本可置于4保存；24小時內(nèi)無法檢測的標(biāo)本則應(yīng)置于-70或以下保 存（如無-70保存條件，則于-20冰箱暫存）。血清可在4存放3天，-20以下可長期保存。應(yīng)設(shè)立專庫或?qū)９駟为毐４鏄?biāo)本。標(biāo)本運送期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)本的保存毒株和樣本管理新型冠狀病毒毒株及其樣本應(yīng)由專人管理，準(zhǔn)確記錄毒株和樣本的來源、種類、數(shù)量，編 號登記，采取有效措施確保毒株和樣本的安全，嚴(yán)防發(fā)生誤用、惡意使用、被盜、被搶、 丟失、泄露等事件

14、。無保存資質(zhì)的單位，完成檢測后應(yīng)在一周內(nèi)將新冠陽性標(biāo)本送交有保存資質(zhì)的單位或按規(guī) 定開展復(fù)核檢測的單位。如果無需上送，應(yīng)在一周內(nèi)銷毀。新型冠狀病毒監(jiān)測期間，可設(shè)立有保存條件的各級疾控中心和有生物安全三級實驗室的單 位為臨時保存單位。其他單位如因有科研項目或?qū)嶒炄蝿?wù)，需要臨時保存和使用新型冠狀 病毒生物樣本，可向當(dāng)?shù)胤止苌锇踩男姓块T提出申請。標(biāo)本的保存標(biāo)本的保存本實驗室開展的病毒核酸檢測簡 介廣州市婦女兒童醫(yī)療中心中心實驗室（病毒研究室）以病毒學(xué)研究為主要方向，下設(shè)有病毒室、病毒血清學(xué)實驗室、臨床基因擴(kuò)增實驗室、流式細(xì)胞室、遺傳室等相對專業(yè)實驗室。病毒室在國內(nèi)建立較早，目前是國內(nèi)極少 數(shù)可

15、以進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)的臨床實驗室之一。病毒室成立于上世紀(jì)60年代，70年代即常規(guī)開展病毒分離培養(yǎng)及相關(guān)研究工作；1997年被指定為WHO流感監(jiān)測哨點；1999年在國內(nèi)首先從呼吸道感染患兒咽拭子標(biāo)本中分離出H9N2病毒株；2003年P(guān)CR室通過國家衛(wèi)生部臨檢中心認(rèn)證，為多種病原體的快速核酸檢測提供了保障；2005年獲國家流感監(jiān)測工作先進(jìn)單位；常年進(jìn)行兒童常見病毒的臨床檢測及研究。是廣東省第一家開展新冠病毒核酸檢測的醫(yī)院實驗室，檢測出廣州 市第一例兒童新冠病毒陽性對臨床開展了數(shù)十余種病毒及其亞型的 核酸檢測，為臨床病毒類疾病的診斷、 治療、及院感防控及科研等工作提供了 十分有力的支撐1999國內(nèi)首

16、先分離 H9N2病毒株2003SARS克隆和序 列分析某幼兒 園急性 眼結(jié)膜 熱暴發(fā) 流行（當(dāng)天便檢測出 為3型腺病 毒）200820042009201320142015201620182019手足口 病毒核 酸檢測（當(dāng)年檢 測2萬余例）H7N9禽流感病 毒核酸 檢測（2014年春 節(jié)期間檢測 出一例陽性， 及時隔離）諾如病 毒核酸 檢測（篩 查、協(xié)助 院感做好 感控）柯薩奇 病毒 A6/A10型核酸 檢測甲型H1N1流感核酸檢測（當(dāng)年檢測近3 萬例）登革熱 病毒NS1 抗原及 核酸檢 測呼吸道 13項病 原菌核 酸檢測腸道病 毒 ECHO11型核酸 檢測參與諾 如病毒 爆發(fā)應(yīng) 急處置2019

17、年12月31日武漢報 道不明 原因肺 炎新型冠 狀病毒 基因序 列首次 公開檢測出 廣州第 一例兒 童患者開展常 見六種 常見冠 狀病毒 核酸檢 測2020年01月08日2020年01月11日2020年01月14日2020年01月23日新冠核 酸檢測 超過10 萬人次2020年06月30日中心實 驗室開 展新型 冠狀病 毒核酸 檢測檢測的樣本類型包括有：咽拭子、肛拭子、尿 、痰、肺泡灌洗液、眼部分泌物等所有患兒肛拭子新冠病毒核酸均陽性收治確診病人二十余例，無院內(nèi)感染、無醫(yī)務(wù)人員感染疫情早期-密切關(guān)注及時建立應(yīng)對疫情的檢測手段常見呼吸道病原體核酸檢測項目2003年以來，逐步建立了兒童常見病原快速基因診斷序號名稱序號名稱1甲型流感病毒10人博卡病毒2甲型H1N111腸道病毒（通用型）3H7N912EV71病毒4乙型流感病毒13柯薩奇病毒A16型5呼吸道合胞病毒14柯薩奇病毒A6/A10型6副流感病毒（I、III型）15腸道病毒ECHO117鼻病毒16新型冠狀病毒8人偏肺病毒1肺炎支原體9腺病毒2肺炎衣原體其他病原體核酸檢測項目小結(jié)