能否用酶聯(lián)免疫吸附法測定食品中的三聚氰胺課件

1、能否用酶聯(lián)免疫吸附法測定食品中的三聚氰胺 ?第4小組成員： 陳琦、陳關鋒、陳朝暉 諸世楠、宣建鋒、連翔三聚氰胺（ C3N6H6 ） 三聚氰胺是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，重要的氮雜環(huán)有機化工原料，廣泛應用于塑料、涂料、粘合劑、食品包裝材料生產(chǎn)。 三聚氰胺的含氮量高達66.6%，因此，三聚氰胺常被不法商人用作食品、飼料添加劑，以提升食品、飼料檢測中的蛋白質含量指標。 農(nóng)業(yè)部已明令禁止在飼料和食品中人為添加三聚氰胺，對非法在飼料中添加三聚氰胺的，依法追究法律責任。 Here comes your footer Page 2酶聯(lián)免疫吸附法檢測三聚氰胺 目前，國內檢測三聚氰胺的方法主要是高效液相色譜

2、法，確證方法是氣相質譜聯(lián)用法，但這兩種方法比較復雜、耗時，而且檢測成本較高，會浪費大量的人力物力。 而酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有特異性高、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單，并可同時對大批量樣品進行快速檢測的特點，目前廣泛應用于食品中獸藥、毒素檢測的初篩中。 但是酶聯(lián)免疫吸附法對樣品基質反應敏感，并非所有樣品都能夠采用酶聯(lián)免疫吸附法進行初篩。 Here comes your footer Page 3酶聯(lián)免疫吸附法檢測三聚氰胺 為了確證酶聯(lián)免疫吸附法是否能成功應用于不同的樣品基質中，我們小組從網(wǎng)上選取了一個以美國Abraxis的三聚氰胺酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對奶制品、成品飼料、飼料原料、肉類等不同

3、的樣品基質中的三聚氰胺含量進行檢測的實驗 。 并根據(jù)其實驗結果判斷酶聯(lián)免疫吸附法檢測三聚氰胺的可行性。Here comes your footer Page 4Abraxis三聚氰胺酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 檢測原理： 由于三聚氰胺為小分子抗原，本試劑盒采用競爭ELISA法原理設計并實現(xiàn)對三聚氰胺的檢測。 樣品中的三聚氰胺與一定量的（辣根過氧化物酶 ）HRP標記的三聚氰胺競爭結合固相上的三聚氰胺抗體，洗滌除去未結合的三聚氰胺和HRP標記的三聚氰胺。加入底物溶液，結合在固相上的HRP將無色的底物轉化為 藍色的物質。樣品中三聚氰胺量 含量愈多，結合在固相上HRP標記 的三聚氰胺愈少，最后的顯色也 愈淺，

4、OD值越低。Here comes your footer Page 6酶聯(lián)免疫吸附法檢測三聚氰胺1. 配制標準工作液 精確稱取10.05 mg三聚氰胺標準品至100 ml容量瓶中，用70%甲醇定容至100 ml，溶液中三聚氰胺的濃度為100 mg/kg，28保存。2.加標樣品的制備 取已知陰性樣品。奶粉按0.5、1.0、2.5 mg/kg3個濃度水平進行添加;液態(tài)奶按1.0、2.5、5.0 mg/kg 3個濃度水平進行添加;飼料基質按2.0、3.0、4.0 mg/kg 3個濃度水平進行添加;肉類基質按1.0、2.0、3.0 mg/kg 3個濃度水平進行添加。實驗基本操作Here comes y

5、our footer Page 7酶聯(lián)免疫吸附法檢測三聚氰胺4.測定程序 采用競爭酶聯(lián)免疫法(ELISA)，控制室溫(2025)，取出試劑盒（美國Abraxis的三聚氰胺酶聯(lián)免疫檢測試劑盒），室溫下放置以使試劑盒在使用前與室溫平衡。取出所需酶聯(lián)板的條數(shù)插入框架。 記錄下標準品、加標樣、待測樣品的位置，并于450 nm波長處測定吸光度(A)。并根據(jù)曲線圖計算出曲線方程。 根據(jù)曲線方程，代入酶標儀測定的樣品的最大吸光的百分數(shù)計算三聚氰胺含量，最后乘以相應的稀釋倍數(shù)就是樣品中測定的濃度。Here comes your footer Page 9酶聯(lián)免疫吸附法檢測三聚氰胺檢出限 為驗證酶聯(lián)免疫試劑盒在

6、不同樣品基質中的靈敏度，選取已由理化方法確證過的陰性空白樣品，對奶制品、成品飼料、飼料原料和肉類進行了樣品測定，并每類基質設計了1015個平行孔。 根據(jù)空白平均值加上3倍標準偏差來定義檢出限，用于反映體系的檢測靈敏度。 Here comes your footer Page 10檢出限（RSD：相對標準偏差）Here comes your footer Page 11檢出限 從實驗結果中可以看出，本批次的Abraix三聚氰胺檢測試劑盒對奶制品中三聚氰胺檢測有著較為理想的結果相對標準偏差(RSD)10%，并且能用于成品飼料、肉類基質中的三聚氰胺的檢測(相對標準偏差18.1%)。 而對飼料原料的檢

7、測，采用酶聯(lián)免疫法時，并不是所有的飼料原料都能滿足現(xiàn)時的限量需求，造成差異的可能原因應該是飼料原料基質的復雜性，破壞了整個酶聯(lián)免疫反應體系。Here comes your footer Page 12回收率回收率 根據(jù)線性回歸方程計算出樣品添加三聚氰胺的濃度減去空白樣檢測濃度(20g/L)除以實際添加的濃度，再乘以100%即為三聚氰胺的回收率。 Here comes your footer Page 13回收率 表2所示，酶聯(lián)免疫試劑盒對奶制品中的三聚氰胺檢測均具有較為良好的檢測能力，均滿足我國規(guī)定的臨時限量值的要求。Here comes your footer Page 14回收率表4表明：

8、檢測試劑盒對飼料原料中三聚氰胺的檢測靈敏度不能達到2.5mg/kg。因此其酶免試劑盒不適用于飼料原料中所有基質的三聚氰胺的檢測。表5表明：回收率普遍偏低，其原因可能是系統(tǒng)誤差或者特定樣品基質造成，在實際肉類檢測中，這種情況需進一步實驗進行反復驗證。 Here comes your footer Page 16酶聯(lián)免疫吸附法檢測三聚氰胺 三聚氰胺的ELISA進口檢測試劑盒主要有美國Abraxis、Beacon以及Strategic Diagnostics公司的產(chǎn)品，其中Abraxis公司的三聚氰胺檢測試劑盒由于快速、可靠，在國內應用最為廣泛。 ELISA方法由于高通量、簡單、快速，在食品檢測中應用非常廣泛，但是該方法存在一定的假陽性，只能作為一種篩選方法，其