如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢

1、如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？、 UCSC（）網(wǎng)址：在 里擇物種比如 ， 輸入你的基因名 ，點(diǎn) （）出現(xiàn)新的面，看到 ” 下的 了吧，它（）又回到了（）類似的頁(yè)面，此時(shí)，點(diǎn)擊 （ ）出現(xiàn)個(gè)新的頁(yè)面，選中 ，同時(shí)以輸入數(shù)值修改具體的序列區(qū)域，如 ，即示啟動(dòng)子 區(qū)域（）擊“ 出現(xiàn)頁(yè)面中上面的序 - ” 就是你的人 動(dòng)子 區(qū)域的 序列了、（）網(wǎng)址：在 “ 標(biāo)題下 search 后的下框中選中種名 （人 框中 輸入基因名 PTEN，點(diǎn)擊 （）出現(xiàn)的新面中比較，但不要它，直接尋找 “Ensembl protein ” 字樣 的，對(duì)，也是第二個(gè)點(diǎn)擊它（）新出的頁(yè)面也亂，不過然不用管它，看到左側(cè)有點(diǎn)肉色（在

2、不知道么描述 了的那些選了嗎對(duì)，就 下面那一在里面 ” 點(diǎn)它（）現(xiàn)在的界就一目了了，在 “ 中輸入值確定啟子長(zhǎng)度（默 認(rèn)為 如 點(diǎn)擊 ；（）出現(xiàn)序列中，為紅色的是基因的外顯子，紅色之間黑色的列就是內(nèi)子，而 第一個(gè)紅色然就是第外顯子了那么開始的堿基一直到第一個(gè)紅色的堿間自然就 啟動(dòng)子 的列啦這樣，你不查到了啟子，連它外顯子、內(nèi)含子序列也全部搞定了 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？、（）網(wǎng)址：（）具體使用法大同小，就是輸物種名、基因名，限定啟動(dòng)子序列域不過有了前個(gè)，我想經(jīng)足夠用，個(gè)人感覺 庫(kù)容太小，很多因查不到 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？我以前回的，總結(jié)一 / / 如何找一個(gè)基因

3、的啟動(dòng)子序列呢 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？ 一般也和 的一致，你的情況可能外。這就清楚了。 有七個(gè)顯子可 能有它自己理由。另外， 的因中 庫(kù)同時(shí)有 ensembl 和 的接，不從這個(gè)鏈看看。 此外，還可看一看這基因在物間的同源性以及它物種有幾個(gè)外顯子，做參考綜合 考慮一下。給你提供幾啟動(dòng)子區(qū)查找的網(wǎng)，慢慢摸索會(huì)學(xué)到更多的。果蠅的 通常確定啟子的算法以分成兩 ,種根據(jù)啟子區(qū)各種錄信號(hào) 如 盒、 盒 結(jié)合對(duì)這些守信號(hào)及號(hào)間保守空間排列順序的識(shí)別進(jìn)行預(yù)測(cè)。如 用 經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法定 盒、 盒、加位點(diǎn) 和 盒 的位置和距離 , / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？識(shí)別含 TATA 盒的動(dòng)子。

4、根據(jù)轉(zhuǎn)錄因結(jié)合部位基因組中布的不平衡性 將錄因子結(jié)合部位分布密及 盒的 權(quán)重矩陣 結(jié)合來從因組 中別出啟動(dòng)區(qū)3 。但述程序預(yù)測(cè)的 假陽(yáng)性率較 每 23kb 出現(xiàn)個(gè)假陽(yáng)性 ; 平每 出 現(xiàn)一個(gè)假陽(yáng)。 另一種方法據(jù)啟動(dòng)子序列的特進(jìn)行預(yù)測(cè)。 從一組練序列中取出 啟動(dòng)子區(qū)的境特征 并外顯子、含子和 端非翻區(qū)的特征及動(dòng)子區(qū)加區(qū)分從而在基 因組中確定動(dòng)子位置初來乍到，個(gè)技術(shù)貼、取目的基的 序，并且在 NCBI 的數(shù)據(jù)中查獲轉(zhuǎn)起始點(diǎn)、取轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)為中心上下約各 ，若在此范內(nèi)出現(xiàn) ，到翻譯起始點(diǎn)終止 、用在線軟進(jìn)行分析 本人是采取種軟件結(jié)的方法，于 和 假陽(yáng)率較高，僅為參考， 而 的特異較高，結(jié)比較可信。同時(shí)，

5、利用 島預(yù)測(cè)，為輔助參考 、后，可以到小鼠的源區(qū)，進(jìn)同源性比較，啟動(dòng)子區(qū)域一定是高守區(qū)、此，可以步預(yù)測(cè)啟子區(qū)域的圍了。請(qǐng)高手多多教啟動(dòng)子預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)：此處亦有好，自己挑！以下內(nèi)容轉(zhuǎn)啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)因子結(jié)合點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)工具 - / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？ II for a 通常確定啟子的算法以分成兩 ,種根據(jù)啟子區(qū)各種錄信號(hào) 如 盒、 盒 結(jié)合對(duì)這些守信號(hào)及號(hào)間保守空間排列順序的識(shí)別進(jìn)行預(yù)測(cè)。如 用 經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法定 盒、 盒、加位點(diǎn) 和 盒 的位置和距離 , 識(shí)別含 TATA 盒的動(dòng)子。 根據(jù)轉(zhuǎn)錄因結(jié)合部位基因組中布的不平衡性 將錄因子結(jié)合部位分布密及 盒的 權(quán)重矩陣 結(jié)合來從因組 中別出

6、啟動(dòng)區(qū)3 。但述程序預(yù)測(cè)的 假陽(yáng)性率較 每 23kb 出現(xiàn)個(gè)假陽(yáng)性 ; 平每 出 現(xiàn)一個(gè)假陽(yáng)。 另一種方法據(jù)啟動(dòng)子序列的特進(jìn)行預(yù)測(cè)。 從一組練序列中取出 啟動(dòng)子區(qū)的境特征 并外顯子、含子和 端非翻區(qū)的特征及動(dòng)子區(qū)加區(qū)分從而在基 因組中確定動(dòng)子位置 近來還有一程序?qū)⑸戏椒?島 信相結(jié)合。 島一段 或 更長(zhǎng)的 序核苷酸 + C 的含量較并且 CpG 雙核苷酸的現(xiàn)頻率占 C 含的 5 0 以上。許脊椎動(dòng)物啟動(dòng)子區(qū)及 島的位置合。 ( / ) 搜通過 5 定技術(shù)構(gòu)建的第一外顯子數(shù)據(jù)庫(kù)識(shí)別一剪切點(diǎn)first ,結(jié)合 島信息確定啟動(dòng)區(qū)。這種法使預(yù)測(cè)敏感性和特異性都明 顯提高。該序預(yù)測(cè)含 CpG 島啟動(dòng)子

7、的敏性和特異都高于 % ,預(yù)測(cè)不含 島的啟 動(dòng)子的精確相對(duì)略低 數(shù)據(jù)庫(kù) 收錄真核基因調(diào)區(qū)結(jié)構(gòu)和因表達(dá)方的信息 ,每條目對(duì)一個(gè)基因 應(yīng)用權(quán)重矩?cái)?shù)據(jù)庫(kù)搜轉(zhuǎn)錄因子合部位的程序包括 轉(zhuǎn)錄因子搜程序 , )等等。盡管于 PWM 的搜索比敏感 但它最大的缺點(diǎn)就是假陽(yáng)性率過高 在預(yù)測(cè)結(jié)果中有 多結(jié)合部位不真正具生物學(xué)功。 數(shù)庫(kù)經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定復(fù)合元件多 數(shù)據(jù)庫(kù)中錄了近 200 條經(jīng)實(shí)驗(yàn)定的復(fù)合件的信息 如果轉(zhuǎn)錄因結(jié)合部位預(yù)測(cè)結(jié)果包含復(fù)合元件 顯比單個(gè)元件更有可能具生物學(xué)功 o - 程通過建立個(gè)轉(zhuǎn)錄因結(jié)合部位的 及其合作用的模 ,可預(yù)測(cè)序列的 復(fù)合元件。有一些程利用 數(shù)據(jù)庫(kù)已知的復(fù)元件去搜基因組序列。 / / 如何

8、找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？等是用來搜高含量基 的些算法可以對(duì)一組因簇中的 基因調(diào)控區(qū)行比較 以現(xiàn)其中存的高含量的基序 ,調(diào)元件可能存在于這些基序之中。在 查找可的啟動(dòng)1、進(jìn)入網(wǎng)站 。2、點(diǎn)擊 單，在 position 后面的搜索框內(nèi)寫入待查的基因名稱，點(diǎn)擊 getoutput。 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？3、出現(xiàn)一系列候選序列。當(dāng)搜索用詞不特異的時(shí)候會(huì)出來太多的結(jié)果，只顯示 500 條。 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？4、點(diǎn)擊自己目的基因的結(jié)果鏈接，會(huì)出現(xiàn)該基因在染色體上的位置 (有時(shí)候會(huì) 直接跳到選擇 genome，mRNA 那一頁(yè)面可能是在搜索詞比較特異的情 況寫)，繼

9、續(xù) getoutput。 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？5、選擇 genome 這一項(xiàng)。6、promoter/upstream 前面的框中打勾一般的啟子長(zhǎng)度大約為 2kb 右，這數(shù)字可以修改。為便觀察，可續(xù)修改下的幾個(gè)選項(xiàng)。這里選擇 CDS 大。 / 1911 / 19如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？7點(diǎn)擊 sequence 可得到結(jié)果UTR upstream 是分開的CDS 大寫的， 可以看到起始碼。copyATG 以前的序列進(jìn)行啟動(dòng)子分析。 以 genome 模板。在 Ensembl 查找能的啟子 1進(jìn)入站，擇物種，入搜索的因名稱。 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？2出來 2

10、個(gè)結(jié)果本例中貌似是同一個(gè)。擊相應(yīng)鏈進(jìn)入新頁(yè)。3貌似 個(gè)同的轉(zhuǎn)錄。點(diǎn)擊 Info 4新頁(yè)中即可看到 5 upstream sequence 。以在 Flanking of 后 面的框中修期望顯示序列長(zhǎng)度一般啟動(dòng)子最好選 2kb。后 所顯示上游序進(jìn)行 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？分析。隨著基因工的發(fā)展常常需要建一種能高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體啟子對(duì)外源 因的表達(dá)水影響很大是基因程表達(dá)載體的重要元件因研究啟動(dòng)子克隆方法對(duì)研究 基因表達(dá)調(diào)和構(gòu)建表載體至關(guān)要。迄今為止國(guó)外尚見到有關(guān)動(dòng)子克隆方法的綜述性報(bào)道國(guó)僅孫曉紅等就啟動(dòng)子 結(jié)構(gòu)分類克方法和食菌中已經(jīng)離到的啟動(dòng)子作過綜述。而近年來又有多改

11、進(jìn)的隆 啟動(dòng)子的方獲得了多面的成功本文就近年來進(jìn)的啟動(dòng)子克隆方法作綜述以促進(jìn)對(duì) 啟動(dòng)子分離術(shù)的應(yīng)用1 啟動(dòng)克隆的幾種方法 利用啟動(dòng)探針載體選啟動(dòng)子啟動(dòng)子探針載體是一有效、經(jīng)、快速分離基因啟動(dòng)子的工具型載，包含 2 個(gè)本 部分：轉(zhuǎn)化元和檢測(cè)元。其中轉(zhuǎn)化單元含復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性因于擇被轉(zhuǎn)化 細(xì)胞；檢測(cè)元?jiǎng)t包括 1 個(gè)失去轉(zhuǎn)錄能且易于檢測(cè)的遺傳標(biāo)記基因以及隆位點(diǎn)。利用啟動(dòng)子針載體篩啟動(dòng)子的程為，先選用 種適當(dāng)限制性核內(nèi)切酶消化切割 染色體 ，然后將切割產(chǎn)生的 限制片群體及啟動(dòng)子的針質(zhì)粒載體重組，并按照設(shè) 計(jì)的要求使隆的片段好插在緊報(bào)告基因的上游位置；隨后再把重混合物轉(zhuǎn)給寄主細(xì) 胞，構(gòu)建質(zhì)載體基因庫(kù)

12、，并檢報(bào)告基因的表達(dá)活性。當(dāng)插入段同滿足 有基因啟子序列； 有翻譯始區(qū)；具有始 子； 插入方向正； 入片 端編碼區(qū)列抗性基因編碼區(qū)讀碼一致，則可能形成功能 的抗性融合因，從而動(dòng)抗性基的表達(dá)。最早由 等在大腸桿中以四環(huán)素抗性基因作為報(bào)告基因構(gòu)建了啟動(dòng)探針質(zhì)粒 克隆了一原核和真啟動(dòng)子片段后 Donna 等以霉素抗性因作為報(bào)告基因， 等以大腸桿菌 為報(bào)基因，構(gòu)建酵母啟動(dòng)探針質(zhì)粒克隆了一些啟動(dòng)子片段。 構(gòu)建啟動(dòng)子針型載體較為常見檢測(cè)標(biāo)記基因有 半乳糖酶基因 、霉素乙酰移 酶基因 、四環(huán)素性基因 和卡霉素抗性基 (Kan)。近年來，們漸漸較地使用 潮霉素 磷酸移酶( 基因作檢測(cè)標(biāo)記基因李維等構(gòu)建了含有

13、hph 抗性因的啟動(dòng)子 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？探針型載體 ，直接在大桿菌中分黃孢原毛革菌基因啟動(dòng)子。先用 酶 黃孢原毛平菌基因總 ，及用 酶切的 相連，轉(zhuǎn)大腸桿菌用間接篩 選法從氨芐霉素和潮素抗性平上篩選重組子，得到 6 個(gè)雙抗組子 pCH6)，電泳 檢測(cè)插入片分別命名 再用生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將重組子別轉(zhuǎn)化黃原毛平革， 對(duì)獲得的轉(zhuǎn)子進(jìn)行復(fù)，僅 的轉(zhuǎn)平板上有定生長(zhǎng)的落，說明了 片段在黃孢 原毛平革菌具有啟動(dòng)因表達(dá)的能法不要知道具體基因的序列機(jī)篩選啟子， 避免了引物計(jì)，能獲大量的啟子片段。利用 技術(shù)克隆啟動(dòng)子即根據(jù)發(fā)表基因序列設(shè)計(jì)引物克隆基因的啟動(dòng)子，由于 PCR 法簡(jiǎn)便捷，近年人 們較

14、多采用方法克隆因啟動(dòng)子蘇寧等根據(jù)報(bào)道的水葉綠體 啟動(dòng)基因序列計(jì) 5啟動(dòng)子序列引物，以 稻葉綠體 為模板， 擴(kuò)增 基因 5 啟動(dòng)子區(qū)的段，酶切克隆到 的 和 位，構(gòu)建測(cè)序載體質(zhì)粒 pZ16S ，進(jìn)行列測(cè)定結(jié)果表明所克隆的片段為 ， 含有 序列同比較結(jié)果明所克隆的片段及水稻葉綠體 16SrRNA 啟動(dòng)子序列有 的同源性。上述的 PCR 法簡(jiǎn)便快捷、操簡(jiǎn)單，是人們較為廣泛使用的技術(shù)。環(huán)狀 環(huán)狀 包括 和 2 種 都根據(jù)一端已 知序列設(shè)計(jì)嵌套式引進(jìn)行 。 是 年 最早提出的一基于 PCR 的改進(jìn)的染色體步行方法。 的實(shí)驗(yàn)序包括，基因組 經(jīng)酶切后 連接酶進(jìn)行連接，產(chǎn)生狀 片 段；以環(huán)化物為底物用根據(jù)已片

15、段設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增從而得到有未知片 段的擴(kuò)增產(chǎn)流程如圖 1 所示。韓志勇等以 I-PCR 術(shù)為基礎(chǔ)克隆了轉(zhuǎn)基因稻的外源因旁側(cè)序用小量法提轉(zhuǎn)基 因水稻的總 總 DNA 用 倍量的制內(nèi)切酶進(jìn)行過夜酶切，酶切片段行自連接然 后根據(jù)工程粒的 T-DNA 區(qū)設(shè) 2 對(duì)向引物進(jìn)行套式 擴(kuò)旁側(cè)序列。建立了適合處 理大量材料克隆轉(zhuǎn)基水稻中外基因旁側(cè)序列的技術(shù)體系。在 1 周內(nèi)克了 個(gè)基因水 稻株系中外基因的旁序列，長(zhǎng)在 之間。 法速、高效穩(wěn)定，操相 對(duì)簡(jiǎn)單，花少， 引物設(shè)計(jì)比方便。 是 Jones 等提的利用末端反向重復(fù)序列及已知序互補(bǔ)配對(duì)成 環(huán)狀單鏈模，有效增了引物及板結(jié)合的特異性。反應(yīng)需要

16、 3 個(gè)根據(jù)已序列設(shè)計(jì)引物， 3 個(gè)引物已知序列內(nèi)呈線性排列其中第 3 個(gè)引可作為接使用可及已知列互補(bǔ)配對(duì)形 成鍋柄狀單模板。其程為，首酶切基因組 ，產(chǎn)生 或 粘末端，然后連接上合適的 接頭 ，連接好后最用核酸外切 I 除去多余的頭，由于接上的接頭及已知序列 是反向重復(fù)列，變性的 DNA 鏈可退火形成鍋柄狀單鏈模板，之后分別用 個(gè)單引進(jìn)行 3 次 增，能有效地?cái)U(kuò)增 9kbp 大片段未知列流程如 示 。黃君健等成地應(yīng)用 技術(shù)正常的人周血單核細(xì)胞基因組 中擴(kuò)端粒催化亞 基 基 端上游旁序列獲得了 因翻譯始位點(diǎn)上游 的基組 序列。首先酶切消化因組 ，得到帶 的 5突端的 DNA 片段。然后利用已知的

17、 列設(shè)計(jì) PCR 物常規(guī)的 PCR 方法增出 大約 的基組特異片， 序列分析為 的基組 片段。根得到的基因組 序列的息，確定 的引 物退火區(qū)，合成了 磷酸化的接寡核苷酸和 條基因特異引物，其中連接寡核苷酸 5端 的 4 個(gè)堿基 及上述酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的 5突出端 GATC 互補(bǔ)后連接寡核苷酸及基 因組酶切產(chǎn)連接，以接產(chǎn)物為應(yīng)模板，進(jìn)行 ，使模自身進(jìn)行退 -伸反應(yīng)，以形 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？成 構(gòu)。后以單鏈 模板， 條基因特序列為引進(jìn)行嵌套 ， 最終獲得了 1 條 含 基因啟動(dòng)子 片 等利用進(jìn)的 ，形 成 結(jié)構(gòu)之前 末連上 ddCTP 使引物錯(cuò)配的機(jī)率減少特異性增。他們從類 基

18、因組 已知點(diǎn)側(cè)翼擴(kuò)增了 4 的片段未知序列 是目前能夠增距已知列 最遠(yuǎn)的未知 DNA 序列的法，有很高的特異性。利用載體或頭的染色步行技術(shù)隆基因啟動(dòng)子這類方法的一步都是切基因組 DNA ，連接體或接，既可以 等質(zhì)粒體， 也可以使用 DNA 等噬菌體載體只選用的載體有合適的切位點(diǎn)同樣根實(shí)驗(yàn)需要接 頭既可以是鏈也可以單鏈，然根據(jù)基因組 DNA 序列計(jì)的特異引和載體的用引物或 接頭序列進(jìn)擴(kuò)增。利用載體的 PCR 等利用的特異性引 對(duì)小鼠傷寒菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)縱子為起進(jìn)行連續(xù)行。以 為載。用 和 AraI 酶基因 組 ， 和 酶切體 DNA ，后連接基因片段和載片段，用據(jù)基因組 DNA 序 列設(shè)計(jì)的特引物和

19、載的通用引進(jìn)行擴(kuò)增由于非特異段沒有單特引物結(jié)合位點(diǎn) 使有載體連非特異片，也無法到大量擴(kuò)增，而使特異片段得到有擴(kuò)增。利用接頭的 王新國(guó)等用銜接頭的法計(jì)位于單 DNA 兩端互補(bǔ)的顛末端重復(fù)序，增加了應(yīng)的特異，在胡蘿卜 型轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子的克隆方面取了新的 進(jìn)展。首先胡蘿卜基組 分別用 PvuI 、 酶切，并設(shè)計(jì) 1 個(gè)接頭 長(zhǎng)鏈序列和 個(gè)銜頭短鏈序，并在銜接頭短鏈的 3 末端帶 個(gè)氨的銜接頭能夠阻止 聚合酶催化銜接頭短的延伸同時(shí)銜接頭的長(zhǎng)鏈和短鏈之間是反向重復(fù)序?qū)⒚盖衅?此銜接頭連，取連接物做模板以銜接頭引物和基因特異引物做 在首 中只 限定的遠(yuǎn)端因特異引有結(jié)合位，當(dāng)基因特異引物延伸產(chǎn)生的 DN

20、A 鏈通過接頭時(shí)，能 產(chǎn)生銜接頭物的結(jié)合點(diǎn) 才能以接頭引物基因特異物進(jìn)行指擴(kuò)增一方， 如果非特異成產(chǎn)生了 兩都有雙銜接頭序列的 產(chǎn)時(shí)種 產(chǎn)物在次變性 后，單鏈 DNA 末端的接頭反向復(fù)序列將成鍋柄結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)比引物-模板雜更穩(wěn)定，能 抑制非特異列的指數(shù)長(zhǎng)。最后到主要的 PCR 產(chǎn)物為 、 、 和 。將 銜接頭系的 產(chǎn)克隆、測(cè)序源性比較得到 個(gè)新的胡卜 型轉(zhuǎn)酶基因 啟動(dòng)子序列它含有似于 和 CAAT 的元件在啟動(dòng)子的上游區(qū)域多個(gè) 富含區(qū)，該啟子的發(fā)現(xiàn)于研究植中的糖代謝具有重要的意義。接頭物的相對(duì)置如圖 所示。3這種方法具便于操作實(shí)驗(yàn)線路單的優(yōu)點(diǎn)，但是特異性較差，產(chǎn)物進(jìn)一步雜驗(yàn)證。 法 等在擴(kuò)增

21、端采用“”形接頭以減少接引物的單物擴(kuò)增。其原理是接 頭引物處于Y接頭的 個(gè)分單鏈上，列及接頭樣，只有及特異引物引導(dǎo)合成了接的互 補(bǔ)序列后，頭引物才退火參及增，流程如圖 。方衛(wèi)國(guó)等嘗將 法引入到昆蟲原真菌的分生物學(xué)研并取得成功建立了 合于球孢白菌和金龜綠僵菌 體系。在已隆的類球孢白僵菌類枯桿菌蛋白基因 的礎(chǔ)上，用 法，克隆到該因的啟動(dòng)子 先酶切球孢僵菌基因 ，然后及Y形接相連，取接產(chǎn)物做板，先以基因特異 引物 做線性增，再以線性擴(kuò)增產(chǎn)物模板，以頭引物和因特異引物 做指數(shù)擴(kuò)增，只 有當(dāng)線性擴(kuò)時(shí)合成了有接頭引的互補(bǔ)單鏈，接頭引物才能及其發(fā)退火，參指數(shù)擴(kuò)增 從而有效防了接頭引的單引物增。最后得 產(chǎn)物，

22、進(jìn)序列分析確定為 的上 游啟動(dòng)子序。在應(yīng)用 法時(shí)，切酶的選擇關(guān)重要。的內(nèi)切酶生適合 PCR 擴(kuò)增的片段，太大 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？太小都不行為了得到適的內(nèi)切，需要從眾多的內(nèi)切酶中篩選。研表明同物種有自 己合適的內(nèi)酶。 法延的起始片段以是基因 片段，也以是 cDNA 片，在 延伸 片段時(shí)的引物要避開內(nèi)含和外顯子邊界內(nèi)含子的置未知的情況下， 可考慮多合 2 條特異物，以提擴(kuò)增未知片段的機(jī)率。該方法假陽(yáng)性低、效率，理論 上能擴(kuò)出所目的片段 很早就有用機(jī)引物的 ，但由無法有效控制由隨機(jī)引物引發(fā)的非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生， 所以一直未廣泛應(yīng)用近年來由 IJiu 等計(jì)的 又叫熱不對(duì)交錯(cuò) PCR

23、，解決了這問題，后來有研究表明，經(jīng)改良過 成功地從 突變體中克到外源插基因的旁序列，從而為啟動(dòng)子的克隆提供了效的新方。在利用特異物和隨機(jī)物進(jìn)行 中般有 3 產(chǎn)物生由特異性引物和并引物 擴(kuò)增出的產(chǎn)； 由同一異性弓 l 物擴(kuò)增出產(chǎn)物； 由同一簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物。在 反中，其中后 種目標(biāo)產(chǎn)物可以通過以嵌套的特異引物進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)消除。 的 基 本 原 理 是 利 用 目 序 列 的 已 知 序 列 設(shè) 計(jì) 3 個(gè) 嵌 套 特 異 性 引 物 ，簡(jiǎn)稱 ， 約 ，用它分別和 個(gè)有低 值的短的隨簡(jiǎn) 并引物 ，約 組合，基因組 為模板根引物的 長(zhǎng)短和特異的差異設(shè)不對(duì)稱的度循環(huán)，通過分級(jí)反應(yīng)來擴(kuò)增特異物 流程

24、如圖 示。 共分 次反。第一次反包括 5 高特異、 次特異、 次較低異性反 應(yīng)和 個(gè)熱不對(duì)稱超級(jí)循環(huán)。 5 次高特異性應(yīng)，使 sp1 已知序列退火并延伸，增加 目標(biāo)序列的度； 次低異性的反應(yīng)簡(jiǎn)并引物合到較多目標(biāo)序列； 次低特異性 反應(yīng)使 種物均模板退火，隨后進(jìn)行 次超級(jí)環(huán)。經(jīng)上反應(yīng)得到不同濃度的 種類型產(chǎn)物：特性產(chǎn)物型和非特異產(chǎn)物 ( 型和型 ) 。第二次應(yīng)則將第一級(jí)反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋 1000 倍作模板，通 次熱不稱的超循環(huán)，使異性產(chǎn)物選擇地?cái)U(kuò)增，而非特異 產(chǎn)物含量極。第三次應(yīng)又將第次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋作模板，再設(shè)置通的 反應(yīng)或不 對(duì)稱超級(jí)循，通過上 次 應(yīng)可獲得已知序列鄰近的目標(biāo)序列。 等曾用構(gòu)的

25、含有潮素抗性基 ( 的雙表達(dá)載體 化真菌， 后利用 法克隆得到的真菌轉(zhuǎn)化子基因組 T-DNA 入?yún)^(qū)的旁序列并取了成 功。根據(jù) 區(qū)的 基因設(shè)了擴(kuò)增右界的 3 個(gè)引物 ，以擴(kuò)增左邊界的引 物 HAS4 另外根據(jù)不同的化子分別計(jì)了簡(jiǎn)并物 ADl 引物位如圖 所 示。在首輪 PCR ，以 為引物擴(kuò)右邊界以 擴(kuò)增左界，然取首輪 產(chǎn)物為模板 進(jìn)行二次 二次 PCR 產(chǎn)為模板 為模板進(jìn)行三輪 PCR 將 3 輪的 產(chǎn)進(jìn)行電泳分結(jié)果表明采 方法成 地從突變體獲得了帶 左右界的旁側(cè)序而證明 法有效地?cái)U(kuò)增基 因旁側(cè)序列方法，為動(dòng)子的克又增添了 可行的方法。 不需 前任何 操作免了環(huán)化連接度快異性效高， 靈敏，在分

26、生物學(xué)研的各個(gè)領(lǐng)都有廣泛的應(yīng)用。2討論以上介紹的種方法基代表了現(xiàn)的啟動(dòng)子克隆方法分別有不同的特和適用范 圍。利用啟動(dòng)子針載體篩啟動(dòng)子時(shí)不需知道具體的基因序列避免了引設(shè)計(jì)能獲 得大量的啟子片段；缺點(diǎn)是需構(gòu)建 1 個(gè)梭質(zhì)粒，庫(kù)、轉(zhuǎn)化篩選，工作量大，費(fèi)時(shí) 費(fèi)力，而且隆、亞克的過程繁。因此在基因的遺傳背景不是很清時(shí)往過探針載 / / 如何找一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列呢？隨機(jī)篩選啟子。而 法的主要點(diǎn)是簡(jiǎn)便快捷、操簡(jiǎn)單；其缺點(diǎn)是只能擴(kuò)增兩端已知列間的 區(qū)且擴(kuò)增特異性較其用條件是建立在對(duì)基因序列十分清楚的基礎(chǔ)上只有知道因的 全序列根據(jù)已知序設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出基因的啟子此因序列楚的情況下 們首先想到就是 PCR 法。

27、法操作單，克服文庫(kù)篩選克隆、亞克隆的繁瑣步驟，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求不，花 費(fèi)少，在 法基礎(chǔ)上，增加了 環(huán)化過程從而可以增只有一序列已知的 ， 由于不需要計(jì)和合成量昂貴的苷酸接頭此免了物設(shè)計(jì)和有頭而產(chǎn)生非特異性 產(chǎn)物的麻煩然而由于直克隆已知列外的未知 域依于 的環(huán)性而環(huán)化連接 過程中常常生多聯(lián)體成副產(chǎn)物甚是主要產(chǎn)物導(dǎo)致非異擴(kuò)增造成了閉環(huán)雙的 的 PCR 擴(kuò)增效率差經(jīng)常得不滿意的結(jié)果，同時(shí)酶切片段太長(zhǎng)也會(huì)使擴(kuò)增效下降。其用 于尋找只有端序列已的 未知 DNA 段進(jìn)擴(kuò)增。相對(duì)于 ， 經(jīng)過設(shè)計(jì)形的是鍋柄狀單鏈 DNA 模板，而有效增加了引物及模 板結(jié)合的特性 能夠完全部嵌套式擴(kuò)增，因而產(chǎn)物有非常高的特異性缺

28、點(diǎn)是也 在 環(huán)化連接的弊端，但及 I-PCR 相，其 產(chǎn)物的特異性已大大增加目前，P-PCR 可以擴(kuò)增位已知位點(diǎn)翼的大于 的人基因組 DNA 的啟子，是目前止能擴(kuò)增離已 知序列最遠(yuǎn) 序列的方因而常于擴(kuò)增大片段的未知序列。利用載體的 PCR 克隆啟子有實(shí)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)在因組 中入含合適酶位點(diǎn) 的載體基于 PCR 法的又創(chuàng)新之處而其實(shí)驗(yàn)作較為繁特異差使用套式 ， 仍然有幾條泳條帶，而特異性物需雜交進(jìn)一步確定。利用接頭的 PCR 克隆啟子的優(yōu)是避免了 環(huán)改的接頭可以通過形成鍋結(jié)構(gòu) 有效抑制非異性序列擴(kuò)增但設(shè)和合成大量的核苷酸接頭價(jià)格昂貴此外用常規(guī)加接 頭的方法來隆啟動(dòng)子往往有接非特異產(chǎn)物產(chǎn)生特異性較低特產(chǎn)物需雜確定由于 利用接頭的 PCR 法需要 化，通適用于尋找知 cDNA 周圍