人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離及鑒定

1、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞的分離及鑒定閆秀萍，羅 虎，周向東（400038重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院呼吸內(nèi)科）【摘要目的 從人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中分離并鑒定肺癌干細(xì)胞。方法 將A549細(xì)胞置于無血清條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成細(xì)胞球，采用平皿克隆形成實驗、MTT細(xì)胞增殖實驗、RT-PCR、Western blot、免疫熒光技術(shù)，檢測并比較A549細(xì)胞和A549細(xì)胞球的增殖能力及干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記的表達(dá)水平，鑒定細(xì)胞球的腫瘤干細(xì)胞特性。結(jié)果 利用無血清條件培養(yǎng)基從A549細(xì)胞中分離出腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞；相比A549細(xì)胞，細(xì)胞球呈懸浮生長，增殖能力和克隆形成數(shù)目高于貼壁細(xì)胞，且干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記Sox

2、2和Oct4表達(dá)水平明顯提高。結(jié)論 運用無血清條件培養(yǎng)基可以從A549細(xì)胞系中有效富集肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。關(guān)鍵詞 肺癌；腫瘤干細(xì)胞；細(xì)胞球 Isolation and identificationcharacterization of lung cancer stem cells from human lung cancer cell lines A549Yan Xiuping, ，Luo Hu, ，Zhou Xiangdong （(Department of Respiratory Diseases ，, Southwest Hospital，, Third Military Medical

3、University，, Chongqing，, 400038，, China）)【Abstract】 Objective To isolate and characterize identify the lung cancer stem cells from the established human lung adenocarcinoma cell lines A549. Methods The A549 cells were cultured in serum-free condition medium. to form After tumor spheres. formed, cCol

4、ony formation assay and MTT assay were used to observe the colony formation ability,. RT-PCR, wWestern blot analysis, and immunofluorescent staining were performed to compare the expression levels of stem cell markers between adhere A549 cells and A549 tumor sphere cells. Results The stem cells were

5、 isolated from A549 cells in serum-free condition medium and formed typical neurospheres. The results showed that the proliferation and self-renewal capacityability of the A549 sphere cells was stronger than A549 adhere cells. A549 sphere cells expressed higher levels of stem cell markers（ Sox2 and

6、Oct4） than A549 adhere cells. Conclusion The serum-free condition culture could be effectively enriched in cancer stem cells from human lung adenocarcinoma cell lines A549. 【Key words】lung cancer ; cancer stem cells ; tumor sphere Supported by the National Basic Research Program of China (973 Progra

7、m, 2010CB529402). Corresponding author: Zhou Xiangdong, E-mail: HYPERLINK mailto: 基金項目 國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃，2010CB529402）通信作者 周向東，E-mail:近年來，肺癌發(fā)病率及病死率居高不下甚至呈持續(xù)上升趨勢，加之其惡性程度高、預(yù)后差，已經(jīng)成為各種癌癥中導(dǎo)致死亡的首要病因，嚴(yán)重危害人類健康 ADDIN EN.CITE Jemal200730403040304017Jemal, AhmedinSiegel, RebeccaWard, ElizabethMurray, TaylorXu

8、, JiaquanThun, Michael J.Cancer Occurrence, Department of Epidemiology and Surveillance Research, American Cancer Society, Atlanta, GA, USA.Cancer statistics, 2007CA: a cancer journal for cliniciansCA Cancer J ClinCA Cancer J Clin43-66571AdolescentAdultAge DistributionAgedAged, 80 and overCause of D

9、eathChildChild, PreschoolFemaleGeographyHumansIncidenceInfantInfant, NewbornMaleMiddle AgedModels, StatisticalNeoplasmsPopulation SurveillanceRisk AssessmentSex Distributitrendsclassificationepidemiology20070007-923517237035:/MEDLINE:17237035English1。盡管目前肺癌綜合治療方面取得了一定進(jìn)展，手術(shù)、化療和放療仍然是當(dāng)前肺癌治療的主要手段，但臨床研究證

10、實，多數(shù)患者確診肺癌時已屬中晚期而喪失手術(shù)機(jī)會，加之肺癌對放化療的抵抗性，肺癌的5年生存率也未見明顯提高 ADDIN EN.CITE Jemal200730403040304017Jemal, AhmedinSiegel, RebeccaWard, ElizabethMurray, TaylorXu, JiaquanThun, Michael J.Cancer Occurrence, Department of Epidemiology and Surveillance Research, American Cancer Society, Atlanta, GA, USA.Cancer sta

11、tistics, 2007CA: a cancer journal for cliniciansCA Cancer J ClinCA Cancer J Clin43-66571AdolescentAdultAge DistributionAgedAged, 80 and overCause of DeathChildChild, PreschoolFemaleGeographyHumansIncidenceInfantInfant, NewbornMaleMiddle AgedModels, StatisticalNeoplasmsPopulation SurveillanceRisk Ass

12、essmentSex Distributitrendsclassificationepidemiology20070007-923517237035:/MEDLINE:17237035English1。腫瘤干細(xì)胞理論的出現(xiàn)為腫瘤治療帶來新的希望。隨著該理論的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明化療耐藥跟腫瘤干細(xì)胞有關(guān)，且在腫瘤的發(fā)生、維持及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 2-4。但腫瘤干細(xì)胞的分離、純化及鑒定等研究仍是目前腫瘤干細(xì)胞研究的熱點和難點。1997年Bonnet等 ADDIN EN.CITE Bonnet19973006300630061

13、7Bonnet, D.Dick, J. E.Department of Genetics, Research Institute, Hospital for Sick Children, University of Toronto, Ontario, Canada.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cellNature MedicineNat MedNature Medicine730-737ADP-ribosyl Cyc

14、laseAcute DiseaseAgedAnimalsAntigens, CDAntigens, CD34Antigens, CD38Antigens, DifferentiationCell DifferentiationCell DivisionCell Transformation, NeoplasticClone CellsDisease Models, AnimalFemaleHematopoietic Stem Cell Tranpathologypathologypathologypathology19971078-89569212098:/MEDLINE:9212098Eng

15、lish5首次發(fā)現(xiàn)了白血病干細(xì)胞。隨著研究的深入，人們陸續(xù)在腦腫瘤、乳腺癌、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)并成功分離出腫瘤干細(xì)胞 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 6-11。目前國內(nèi)外有關(guān)肺癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展緩慢，原因之一就在于公認(rèn)的、高特異性的肺癌干細(xì)胞分選標(biāo)記尚未發(fā)現(xiàn)。本研究運用無血清條件培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)方法分離并富集肺癌干細(xì)胞，并且進(jìn)一步鑒定細(xì)胞球的腫瘤干細(xì)胞特性，為肺癌干細(xì)胞的分離、富集及進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 細(xì)胞株及主要試劑 細(xì)胞株：人肺癌細(xì)胞株A549來自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。主要試劑：RPMI 164

16、0培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，重組人表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、重組人堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）均來自PeproTech公司，B27 (Gibco公司)，小鼠抗人Oct4單克隆抗體（Abcam公司），小鼠抗人Sox2單克隆抗體（Novus公司），Cy3標(biāo)記的羊抗小鼠IgG（碧云天公司），Cy5標(biāo)記的羊抗兔IgG（碧云天公司），PVDF膜（Millipore公司），羊抗兔IgG（碧云天公司），小鼠抗人GAPDH單

17、克隆抗體（Invitrogen公司）。 1.2 細(xì)胞培養(yǎng)A549細(xì)胞培養(yǎng)：培養(yǎng)基為含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)飽和濕度條件下培養(yǎng)。實驗取對數(shù)生長期的細(xì)胞。細(xì)胞球培養(yǎng)：培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，含有20 l/ml B27，20 ng/ml EGF，20 ng/ml bFGF。將A549制成單細(xì)胞懸液以20 000個/孔的密度種植6孔板中，每孔2 ml培養(yǎng)液，每隔23 d半量換液。在37，5% CO2條件下培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞成球情況和形態(tài)。實驗取第3代細(xì)胞球。1.3 細(xì)胞增殖實驗和克隆形成實驗 A549細(xì)胞及細(xì)胞球增值能力的檢測，采用MTT法

18、。將A549細(xì)胞和A549細(xì)胞球制成單細(xì)胞懸液按1104/孔的密度分別加入96孔板，每孔200 l，對照組只加培養(yǎng)基。在37，5% CO2條件下培養(yǎng)，每過24 h，拿出孔板檢測，檢測6 d，取每次檢測的平均值。檢測時，加180 l基礎(chǔ)培養(yǎng)基和MTT 20l（5 mg/ml），37，4 h，除去培養(yǎng)液，每孔加入150 l DMSO，搖晃10 min。酶標(biāo)儀測定的光密度值D(490)，以光密度值和時間為坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。將A549細(xì)胞和A549細(xì)胞球制成單細(xì)胞懸液按200個/孔的密度分別接種于6孔板中，每孔加入2ml含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，定期換液，在37，5% CO2條件

19、下培養(yǎng)2周，將培養(yǎng)基吸棄，用PBS潤洗后加入4%多聚甲醛固定，然后用結(jié)晶紫染色，觀察克隆形成情況。1.4 RT-PCR檢測收集A549細(xì)胞和細(xì)胞球進(jìn)行總RNA提取，用試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行RT-PCR，引物設(shè)計如下：Oct4上游：5-GCAGCGACTATGCACAACGA-3，下游：5-CCAGAGTGGTGACGGAGACA-3；Sox2上游：5-CATCACCCACAGCAAATGACA-3，下游：5-CTCCTACCGTACCACTAGAACTT-3；GAPDH上游：5-AGCCACATCGCTCAGACA-3, 下游：5-GCCCAATACGACCAAATCC-3。引物合成由上

20、海英駿生物技術(shù)有限公司合成。RNAiso（TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PCR擴(kuò)增試劑盒RT-PCR試劑盒均為Fermentas公司。1.5 免疫熒光檢測分別取A549細(xì)胞和細(xì)胞球種植于蓋玻片上，在37，5% CO2條件下培養(yǎng)，待爬片完成后，取出玻片用4%多聚甲醛固定，用PBS潤洗后用0.3% Triton X-100透化處理，然后封閉后加入一抗（1:400），4冰箱孵育過夜。第2天，取出玻片，PBS洗滌后加入二抗（1:500），37避光孵育1 h，然后用PBS洗滌，用Hochest33258染色，PBS洗滌后抗熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡觀察拍照。1.6 Western blot 收集A54

21、9細(xì)胞和細(xì)胞球，用蛋白裂解液提取總蛋白，用BCA法測定總蛋白濃度，制備蛋白樣品，進(jìn)行SDS電泳，濃縮膠80 V、30 min，分離膠120V、120 min，電泳完成后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉4 h。封閉完成后用TBST洗膜，加入一抗4冰箱孵育過夜，然后再次洗滌，室溫孵育二抗2 h，洗滌，采用化學(xué)發(fā)光試劑盒（Pierce公司）按說明操作，用凝膠成像儀自動曝光記錄成像。1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果以xs表示，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行獨立樣本的t檢驗。2 結(jié)果2.1 A549細(xì)胞球培養(yǎng)結(jié)果A549細(xì)胞株在有血清培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)皿底部貼壁生長，細(xì)胞呈短

22、梭形，細(xì)胞生長迅速；而在無血清條件培養(yǎng)基條件下，細(xì)胞呈球形立體生長，細(xì)胞球呈圓形或者橢圓形，球內(nèi)細(xì)胞結(jié)合緊密，球體飽滿，折光性強(qiáng)，隨著時間延長，細(xì)胞球可逐漸增大，形狀趨于規(guī)則。見圖1。2.2 細(xì)胞增殖能力和克隆形成能力結(jié)果分析用MTT比色法測定細(xì)胞增殖能力，并繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果顯示，細(xì)胞球的增殖能力顯著高于普通貼壁細(xì)胞( P 0.05)（圖2A）。為檢測細(xì)胞的體外克隆能力，將細(xì)胞和細(xì)胞球分別接種于平皿，進(jìn)行平皿克隆實驗，結(jié)果顯示，細(xì)胞球的平皿克隆形成能力克隆數(shù)（ ）顯著高于貼壁細(xì)胞克隆數(shù)（ ），(P 0.05)（，圖2B）。上述結(jié)果說明細(xì)胞球比貼壁細(xì)胞體外增殖能力明顯提高，具有更強(qiáng)的自我更

23、新能力。2.3 A549細(xì)胞和細(xì)胞球干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記表達(dá)分析運用RT-PCR分別檢測A549細(xì)胞和細(xì)胞球的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)情況，結(jié)果提示細(xì)胞球的Sox2 （ ）和Oct4（ ）的表達(dá)水平要高于貼壁細(xì)胞分別為（ ）、（ ），（圖3A）。Western blot試驗檢測在蛋白水平上也證實了這一點（圖3B）。免疫熒光檢測試驗結(jié)果（圖4）顯示，Sox2 和Oct4免疫熒光染色后激光共聚焦顯微鏡下觀察呈紅色，可以看到細(xì)胞球中的表達(dá)強(qiáng)度較高，普通貼壁細(xì)胞幾乎看不到染色。這就提示了，細(xì)胞球中干性標(biāo)記Sox2 和Oct4表達(dá)多于貼壁細(xì)胞，細(xì)胞球更具有腫瘤干細(xì)胞特征。圖1 A549貼壁細(xì)胞和細(xì)胞球顯微鏡觀察（L

24、M?200）A：生長曲線比較 a：P 0.05； B：克隆能力比較 a：P 0.05圖2 MTT法測定A549細(xì)胞和細(xì)胞球增殖能力及平皿克隆能力 AA549細(xì)胞和細(xì)胞球中Sox2和Oct4表達(dá)。藍(lán)色為細(xì)胞核染色；紅色為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)；后面是兩者疊加。A：WA：Sox2和Oct4 mRNA表達(dá)比較（a：P 0.05）B：Sox2和Oct4蛋白水平表達(dá)比較（a：P 0.05）A：Western blot 檢測結(jié)果；B：半定量分析圖3 腫瘤干細(xì)胞相關(guān)分子Sox2及Oct4標(biāo)記蛋白水平的表達(dá) 1：Sox2；2：Oct4；A、D：細(xì)胞核染色；B、E：腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)；C、F：疊加；AC：A549貼

25、壁細(xì)胞；DF：A549細(xì)胞球圖4腫瘤干細(xì)胞相關(guān)分子Sox2及Oct4免疫熒光測定結(jié)果3 討論腫瘤干細(xì)胞理論從產(chǎn)生到證實伴隨著各種各樣的爭議，但是隨著各種腫瘤中分離和鑒定腫瘤干細(xì)胞的證據(jù)越來越多，這個理論正逐漸得到公認(rèn)。腫瘤干細(xì)胞的深入研究，為人們認(rèn)識腫瘤提供了新的視角，也為進(jìn)一步挖掘潛在的腫瘤治療靶點提供了新的方向。近年研究3，12-15顯示：腫瘤干細(xì)胞的存在是導(dǎo)致腫瘤放化療的失敗的原因之一。 腫瘤干細(xì)胞還和許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如Wnt通路16、Akt通路17、PI3K通路有關(guān)18。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特征，

26、且腫瘤干細(xì)胞具有高侵襲性和高轉(zhuǎn)移性，更易發(fā)生EMT19-22。以上研究表明，腫瘤干細(xì)胞已經(jīng)涉及到腫瘤研究的諸多方面。所以，有效分離和富集腫瘤干細(xì)胞就顯得尤為重要。目前腫瘤干細(xì)胞的篩選主要依靠各種表面分子標(biāo)記進(jìn)行分選。CD133是表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面的糖蛋白，近年來在腫瘤干細(xì)胞研究領(lǐng)域倍受關(guān)注。利用其作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記已經(jīng)從腦腫瘤 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 6、結(jié)腸癌 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 10、前列腺癌 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 23、肝癌 ADDIN EN.CITE

27、ADDIN EN.CITE.DATA 24等多種腫瘤中分離出腫瘤干細(xì)胞，但是仍存在爭議，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過程中，CD133+可以產(chǎn)生CD133-細(xì)胞，且可以在NOD/SCID 鼠中發(fā)生腫瘤 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 25。同樣，在肺癌干細(xì)胞中也存在類似問題，2008年Eramo等 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 11提出CD133是肺癌干細(xì)胞的分選標(biāo)記，隨后就有人提出質(zhì)疑，A549和H446細(xì)胞系中CD133+及CD133-細(xì)胞均含有腫瘤起始細(xì)胞 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 26?？梢?，由

28、于各種腫瘤干細(xì)胞存在異質(zhì)性，在研究肺癌干細(xì)胞時，借鑒其他腫瘤干細(xì)胞的表面分子標(biāo)記并不可靠。因此，在深入研究肺癌干細(xì)胞之前，尋找肺癌干細(xì)胞的特有分子標(biāo)記來分離和富集干細(xì)胞顯得尤為必要。在本研究中，我們探索了一種有效分離肺癌干細(xì)胞的方法無血清條件培養(yǎng)基懸浮球培養(yǎng)方法。這種無血清條件培養(yǎng)基添加有生長因子，在促進(jìn)細(xì)胞的增殖的同時能夠保持細(xì)胞未分化狀態(tài)。在這種培養(yǎng)基中，只有腫瘤干細(xì)胞能夠進(jìn)行生長增殖，這是一個篩選分離的過程，從而更大限度的富集了腫瘤干細(xì)胞。這種培養(yǎng)方法最早用于培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，后來在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞中得到證實和應(yīng)用27-28。我們用MTT比色法繪出細(xì)胞生長曲線，結(jié)果提示細(xì)胞球的體

29、外增殖能力顯著強(qiáng)于普通A549貼壁細(xì)胞，平皿克隆形成實驗結(jié)果也顯示細(xì)胞球克隆形成能力強(qiáng)。以上結(jié)果說明，無血清培養(yǎng)得到細(xì)胞球增殖能力要強(qiáng)于貼壁細(xì)胞。為進(jìn)一步驗證細(xì)胞球的干細(xì)胞特性，我們選用干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2 和Oct-4，這兩個轉(zhuǎn)錄因子能夠維持肺癌干細(xì)胞的特性，可以作為鑒定肺癌干細(xì)胞的分子標(biāo)記 ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 29-30。我們分別運用RT-PCR、Western blot及免疫熒光技術(shù)檢測了Sox2 和Oct-4在A549細(xì)胞及細(xì)胞球中的表達(dá)情況，結(jié)果證實細(xì)胞球中干性標(biāo)記Sox2 和Oct4表達(dá)顯著強(qiáng)于普通A549細(xì)胞，說明細(xì)胞球更具有腫瘤干

30、細(xì)胞特征，富含肺癌干細(xì)胞。以上結(jié)果提示，我們利用懸浮球培養(yǎng)方法可以成功分離和富集肺癌干細(xì)胞，這類細(xì)胞懸浮生長，具有更強(qiáng)的自我更新和增殖能力，且高表達(dá)腫瘤干細(xì)胞分子標(biāo)記。目前在眾多分選腫瘤干細(xì)胞的方法中存在的共同問題是操作繁瑣、技術(shù)難度大、花費昂貴。且在肺癌干細(xì)胞的研究中，先后報道的各種表面分子標(biāo)記并不具有特異性。本研究探討的無血清懸浮球培養(yǎng)法成本低、方便、快捷、高效，可暫時作為研究肺癌干細(xì)胞的工具，有利于進(jìn)一步尋找肺癌干細(xì)胞篩選分子標(biāo)記，有利于肺癌干細(xì)胞分子調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等基礎(chǔ)研究工作順利進(jìn)行，進(jìn)而為腫瘤發(fā)病機(jī)制及臨床以肺癌干細(xì)胞為靶點的靶向治療研究奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)： ADDIN EN.

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